Summary
אנו מתארים טכניקה שבה קטע של אב העורקים בבטן מעכבר הושתל orthotopically ממש מתחת לעורקי הכליה בנמען אלוגנאית או syngeneic. טכניקה זו יכולה להיות שימושית במחקרים בם השתלה של עורקים גדולים של גודל אחיד נחשבת יתרון.
Abstract
נהלי כלי דם המעורבים anastomoses בעכבר נחשבים בדרך כלל להיות קשה ותלוי מאוד במיומנותו של מנתח הפרט. זה בעיקר נכון, אבל יש מספר העקרונות חשובים שיכול להפחית את הקושי של נהלים אלה ולשפר את השחזור. השתלת אב העורקים orthotopic היא הליך שבו מצוין ללמוד עקרונות אלה משום שהיא כוללת רק שני anastomoses מקצה לקצה, אבל דורשת טכניקה טובה תפירה וטיפול בכלי להצלחה בקנה אחד. הליך זה מתחיל ברכש של אורך של אב עורקים בבטן מחית תורם, ואחרי החלוקה של אב עורקי היליד בנמען. אז אב עורקי הרכש ממוקם בין הקצוות החצויים של אב עורקי הנמען ונתפר למקומו באמצעות anastomoses מקצה לקצה. כדי להשיג מטרה זו דורשת רמה גבוהה של ריכוז, כלים טובים, יד יציבה, והערכה להצלחה באיזו קלותמערכת כלי דם של עכבר יכולה להיות פגומה, וכתוצאה מפקקת. למידת העקרונות חשובים האלה היא מה שתופס את רוב הזמן של המתחילים כאשר למידת microsurgery במכרסמים קטנים. לאורך פרוטוקול זה, אנו מתייחסים לנקודות חשובות אלה. מודל זה יכול לשמש כדי לחקור מחלת כלי דם במגוון רחב של מערכות ניסיוניות שונות 1-8. בהקשר שמוצג כאן, זה משמש לרוב לחקר מחלה לאחר השתלת כלי דם, סיבוכים ארוכי טווח שכיחים של השתלת איבר מוצקה שבי היפרפלזיה intimal מתרחשת בתוך השתל. היתרון העיקרי של המודל הוא שהוא מאפשר ניתוחי מורפומטריות כמותיים והכלי המושתל טמון רציף לכלי אנדוגני, שיכול לשמש כשליטה נוספת 9. הטכניקה המוצגת כאן משמשת לרוב לעכברים במשקל 18-25 גרם. צברנו את רוב הניסיון שלנו באמצעות C57BL/6J, BALB / CJ, וזני C3H/HeJ.
Protocol
1. הכנת Presurgical
- הליכים כירורגיים, לא משנה כמה נעשה בזהירות, מביא ללחץ משמעותי. כדי למזער את ההשפעות של לחץ כזה ולמקסם מילואים, בעלי חיים צריכים להישמר בביבר ללפחות 72 שעות לפני השימוש 10,11.
- כלים כירורגיים, גזה, ומטליות חייבים להיות סטרילי. אין צורך להשתמש בכפפות סטריליות המספקות רק את קצות תפר מגע או מכשירי התחום האופרטיבי.
- לhemostasis, זוהי החובה של לחצי clamping הם המינימום הכרחי. ניזק לכלי השיט עקב לחץ מוגזם או התרשלות בטיפול יגרום לפקקת, וכתוצאה מכך לשיתוק ברגל האחורית, איסכמיה מעי, ומוות תוך 24 שעות. מצאנו כי שימוש במהדק, עם לחץ של לא יותר מ 2 גרם / 2 סנטימטר מבטל את הבעיה. מלחציים אלה ציינו בטבלת 1. לחצי קלאמפ הם מצוינים במפרט הטכני למהדק שנעשה על ידי instrumen כירורגית באיכות הגבוההיצרנים לא. אנחנו גילינו שמלחציים זולים או חד פעמיים מלחציים אוניברסליים יפעילו יותר מדי לחץ.
- המיקום של כלי טחונות כמו גם את המיקומים היחסיים של אב העורקים בבטן והנחותה וריד הנבוב (IVC) הוא זן תלוי. תוכל גם למצוא וריאציות קטנות בין עכברים בודדים, במיוחד במיקום של כלי ביטחונות.
2. מבצע תורם
- עכברים יכולים להיות מורדמים עם (אינדוקצית 1.5-2.5%, תחזוקה 1.0% באוויר) או עם isoflurane פנטוברביטל (55-65 מ"ג / ק"ג). Pentobarbital מטיל מגבלת זמן (עד 1.5 שעות), אבל מספק למנתח עם האפשרות לסובב את בעלי החיים לגישה טובה יותר, אם תרצה בכך. זמן הרדמה ניתן להרחיב עד 2 שעות על ידי צבת 2-3 טיפי ההרדמה בעת צורך על המעי או בכבד במהלך הניתוח. קטמין / xylazine (משקל 100 מ"ג / קילו משקל גוף ולקטמין 7 מ"ג / ק"ג לXylazine, IP) יכול לשמש גם על ידי מנתחים מאומנים היטב שcan לסיים את ההליך בתוך 1-1.5 שעות, אבל יש לו טווח מינונים בטוח צר יותר. בארה"ב, השימוש בפנטוברביטל הפך בעייתי יותר בשנים האחרונות, בשל אספקה קצרה. זה הכרחי כי את עומק ההרדמה להיות פיקוח על מנת להיות בטוח שזה מספיק. רפלקס בוהן הקמצוץ הוא המדד הטוב ביותר לעומק מתאים אבל כדאי גם לציין את קצב נשימה ותנועות אחרות גם כן.
- לאחר אינדוקצית הרדמה, להשתמש בג'ל הסרת שיער או גילוח להסרת שיער בבטן הגחון.
- הר החיה על לוח ההפעלה באמצעות קלטת מעבדה כדי להחזיק אותו בעמדה פשוט איברים. לוח הפעלה מתכתית מתיר את השימוש בכרית חימום מתחתיו כדי לספק תמיכת טמפרטורה במהלך הניתוח. אנחנו באופן ידני לשלוט על הטמפרטורה של כרית החימום, שהיא יחידת צרכן כיתה לשימוש ביתי. הטמפרטורה נשמרת בין 35-38 מעלות. לוח ההפעלה המתכתי הוא גם קל לעקר בין הליכים.
- לחטא את האזור באמצעות חומרי חיטוי כמו כלורהקסידין, ואחריו לשטוף אתנול. חזור על תהליך זה שלוש פעמים, כדי להבטיח חיטוי הולם. זה יהיה גם להסיר את כל חתיכות חתוכות תכשירי שיער, אם קיים.
- בעזרת מספריים לעשות חתך דרך קיר הגוף על מנת לחשוף את הקרביים של הבטן.
- השתמש במטלית כותנה, לדחוף את הקרביים בצד לחשוף את הכולים הגדולים של הבטן. הקרביים מונחים על פיסת הגזה שהורטבה בתמיסת מלח חמימה כדי לשמור אותו הלח.
- באמצעות נתיחה בוטה, לנתח את אב העורקים בבטן בזהירות רבה מרקמה הסובבת. היזהר מאוד בניתוח הכלי מהווריד הנבוב הנחותה. יהיו סניפים אחד או יותר, כגון עורקים המותני, שיש להסירו בזהירות וצרבו. הקטע של אב עורקים מבותרים צריך להיות מתחת כלי הכליות ומעל ההסתעפות של אב עורקים בעורקי הירך. סעיף זה יכול לשמש כחומר תורם לרביםשני נמעני s, תלוי כמה הסתעפות כולים קיימים וגודל חית תורם הזרע.
- לקשור את תפר ממש מתחת לעורקי הכליה ואחרת, ממש מעל ההסתעפות. בעזרת מספריים מחלקים את אב העורקים, יש לשטוף את השתל באופן מלא עם המלח המכיל 200 U / הפרין מ"ל. להחזיק בזהירות קצה אחד של כלי השיט ולטפטף תמיסת המלח, כך שהוא עובר על הספינה על ידי כוח הכביד. אל תנתנו לבועות אוויר להפעיל באמצעות הכלי. לטפל בקצוות של הכלי קטן ככל האפשר אחרת אינטימה יכולה להיפגע וכתוצאה מפקקה מאוחר יותר. הסר אותו מהשטח ולמקם אותו באופן מיידי במכל של מי מלח קר כקרח. לאפשר חית התורם ללגרום לדימום מחודשת.
3. מבצע נמען
- הרדם את החיה כאמורה לעיל ולהחיל ג'ל הסרת שיער או להשתמש במכונת גילוח להסרת שיער בבטן. רק לפני החתך שניתן לו מנה של עצירות תת עורי ברמה של 0.1 מ"ג / ק"ג להקמת שיכוך כאבים.
- Mount בעלי החיים בתחום ההפעלה באמצעות קלטת מעבדה. בעלי החיים חייבים להיות מותקנים על שלב הפעלה חמה שיעזרו לשמור על טמפרטורת גוף בזמן הניתוח.
- החל משחה העינים gentamycin לעיניים כדי למנוע מהם להתייבש.
- לחטא את הבטן, ואחריו לשטוף אתנול. חזור על תהליך זה שלוש פעמים, כדי להבטיח חיטוי הולם.
- בדקו את נאותות הרדמה שוב לפני שתמשיך לשלב הבא.
- לעשות חתך קו אמצע דרך העור וקיר הגוף בשני שלבים, נזהר שלא לפגוע ברקמות שמתחת.
- הכנס מפזר להחזיק החתך בבטן פתוחה. כוון את הרכבת הבורג לקראת הסוף האחורי כדי לשמור את חלק הארי של מהדק מהדרך.
- הרטב את הכיכר של גזה סטרילית עם מלח ומניח אותה על המעיים. עם האצבע שלך בעדינות על הגזה, הכניסו מקלון צמר גפן תחת המעיים ועדינות משקף על המעיים שלIDE ולכן הם יושבים על גבי הגזה. קח עוד פיסת גזה, מקם אותו במעיים והרטבת אותו עם מי מלח.
- הסר את כל רקמה שומנית המכסה את אב עורקים ווריד הנבוב הנח (IVC). להיות עדין. IVC הוא מאוד שביר.
- בעדינות להשתמש במלקחיים כדי לנתח את אב עורקי infrarenal מחברת מחקר IVC. נקה את שטח גדול מספיק כדי לספק מקום לשני חבקים עם מספיק כלי ביניהם כך שכאשר יחולקו, יהיה מספיק לכלי שניתן נתפר השתל. מתי לנתח, לחפש ענפי כולים. אם יש צורך לצרוב אותם עם cauterizer טמפרטורה נמוכה.
- הכנס מהדק כלי דם מתחת לעורק כליה ועוד אחד בדיוק מעל ההסתעפות.
- חותך את אב העורקים. את הקצוות של אב העורקים בדרך כלל לחזור בו, והשאירו שטח של כ 5 מ"מ. בדקו hemostasis. אם המהדק עובד בצורה נכונה, רק כמות קטנה של דם צריכה להימלט לאחר הקיצוץ. אם הדימום ממשיך, בדוק את המהדק להיות דבר בטוח הוא interfering איתם. שים לב שאף אחד מאב העורקים הוסר. הוא מחולק רק.
- יש לשטוף את הקצוות לחתוך עם מי מלח heparinized (200 U / ml) ולאחר מכן להסיר את הפתרון הנוסף עם ספוגית.
- Tack השתל למקומו באמצעות שלושה תפרים שאינם רציפים בכל קצה. רק לתפור צד אחד של השקה בכל קצה, ולאחר מכן למלא את שאר עם תפר רציף ריצה או תפרים רציפים יותר. שבעה עד שמונה תפרים שאינם רציפים מספיק. אם אתה משתמש בתפר פועל, כדי להיות בטוח שאת דפנות הכולים תישארנה רגועות ושאינך גורם להיצרות בהשקה.
- מוציא בזהירות את המהדק בסוף הגולגולת ולחפש דליפות בקווי התפר. כמות קטנה של חלחול אישור הוא מתן הוא מפסיק בתוך כדקה. אם יש יותר מזה, אפשר להשתמש בתפר אחד כדי לעצור את הדימום.
- לחץ בעדינות על באב העורקים מעל אתר ההשקה עם מוליך כותנת הרטובות, ולאחר מכן להסיר את המהדק השני. לחץ בעדינות על ולשחרר כמה פעמים ולבדוק שאב העורקים מופיע פטנט. השתל יהיה perfused מייד ודופק צריך להיות גלוי.
- הסר את הגזה מכסה את המעיים ולהעביר אותם בחזרה למקומו. הימנע פיתול של המעי ולשמור על אורינטציה אנטומית רגילה.
- סגור את שכבת השריר באמצעות 5-0 Vicryl.
- סגור את העור באמצעות 5-0 או 6-0 prolene.
- פנק את העכבר מתחת לעור עם carprophen ב5 מ"ג / ק"ג כדי להגדיל אלחוש לפני סיום הרדמה.
- תן מלוח מיליליטר עכבר 0.5-0.8 מתחת לעור.
- הנח את העכבר בכלוב מחומם כדי להתאושש. לנטר אותה בזהירות במהלך התאוששות כדי להיות בטוח שהוא מחלים באופן נורמלי. 2-3 שעות לאחר ניתוח, העכבר צריך להיות מתנהגות יחסית באופן רגיל. ב12 שעות אחרי ניתוח, טיפול בבעלי החיים עם עצירות תת עורי בשעת 2 מ"ג / ק"ג לשיכוך כאבים. אם, בכל זמן, החיה קמרה, עושה רעש או מציג טווח מוגבל של תנועה, לחקור את העניין. אםסיבה סופית לא ניתן לקבוע וקבוע, בעלי החיים צריכים להיות מורדמים לפרוטוקולים מוסדיים. בגיל 24 שעתי בעלי החיים צריכים לקבל עוד מנה של carprophen תת עורית במינון 5 מ"ג / ק"ג. שיתוק רגל אחורי מציין השקה נכשלה או פקיק. במצב זה, בעל החיים צריך להיות מורדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג שתל של אב עורקים. החצים הלבנים יסמנו את קווי התפר. שתל פטנט יציג דופק גלוי. איור 2 מצביע על ניסוי טיפוסי בו הישרדות נמען הייתה במעקב במשך תקופה של 56 ימים. קבוצה אחת הורכבה מעכברי נמען פראי מסוג-(C57BL / 6 x FVB) הושתלו באב עורקי BALB / ג. קבוצה האחרת, המיועד "KO" מורכבת מנמענים (C57BL / 6 x FVB) חסרים בביטוי של heme oxygenase-1, שתוצאה פקק מהשתלים בתוך 24 שעות. יש לציין, זה תוצאות במותו של כל הנמענים, כפי שמוצגות באיור. איור 3 מראה הד מדידות של IVC ואב העורקים בבטן בחיים נורמלים ובאדם שעברו השתלה. שים לב שהשתל הוא פטנט ודומה במראו לאב העורקים שאינם המושתל.
איור 1.מבט של אב עורקים מושתל. החצים הלבנים יסמנו את קווי התפר.
איור 2. תיאורי קפלן במהלך המעקב של הישרדות לאחר השתלת אב עורקים בשתי קבוצות של עכברים מושתלים עם אב עורקים מעכבר BALB / ג. "KO" מציין מקבלים לקויים בביטוי של heme oxygenase-1, שתוצאה פקק משתלי אב העורקים תוך 24-48 שעות. "WT" מייעד את המלטת הסוג פראי. נדפס מ: חד תחמוצת הפחמן מצילה עכברי heme oxygenase-1-לקויים מפקקת עורקים באב עורקי השתלה אלוגנאית, החן B, גואו L, המאוורר C, Bolisetty S, ג'וזף ר, רייט MM, Agarwal, ג'ורג' JF. Am J Pathol. יולי 2009; 175 (1) :422-9 באישור Elsevier.
Figurדואר 3. Echo הדמיה של הווריד הנבוב הנחים (IVC) ואב העורקים בבטן in vivo בעכבר רגיל (פנל שמאלי) ובהשתלת אב עורקים (לוח ימני). התמונות שהופקו באמצעות מכשיר Visualsonics Vevo 660. כוכביות מציינות לומן של הספינות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודלי עכבר של אב עורקי השתלה לספק מספר היתרונות, כי עכברים הם מאוד מוגדרים היטב immunogenetically 9,12,13, והם יכולים לטפל בקלות לשנות את הביטוי של גנים ספציפיים שלהם, אם תרצו בכך. כפי שצוין במבוא, כירורגיה של כלי דם בעכבר היא יותר קשה מאשר רוב הדגמים בגלל גודלו של כלי השיט. אפילו העורקים הגדולים, כגון אב עורקים הם בדרך כלל לא יותר מ 100-200 מיקרומטר בקוטר פנימי; כך מניפולצית הכלים האלה דורשים כמות משמעותית של מיומנות וכשרון 8,14. הסיבוך השכיח ביותר שנצפה בניתוח זה על ידי אלה שרק התחילו ליישם את המערכת הוא שיתוק רגליו האחוריות, בדרך כלל נגרם על ידי פקק כתוצאה מפציעתו של אינטימה ידי טיפול גס או הידוק. רוב התפסים המשווקים על ידי חברות שמוכרות כלים מתאימים למייקרו יוצר לחץ רב מדי כדי לשמש לעכברים, עם לחצים בדרך כלל גדולים יותר מ 25 גר '/ 2 סנטימטר. CLAחברי פרלמנט בם אנו משתמשים הם חלק, עם לחץ של 2 גרם / 2 סנטימטר, לחץ כי הוא פשוט מספיק כדי להשיג hemostasis ולא יגרום ניזק לכלי השיט. מנתחים שמעדיפים להשתמש בתפר ולא מהדק. אנו לא ממליצים על נוהג זה משום שהוא שיטה שתלויה מאוד ביכולת של המנתח לאמוד את הלחץ הנכון ולפי דעתנו, יכול לתרום לשיעור הצלחה נמוכה יותר. בעזרת תרגול, צריכים להיות צפויים שיעורי הישרדות של 90% ומעלה.
תפירת טכניקה לanastomoses מקצה לקצה היא מיומנות קריטית שבו נרכשה עם ניסיון. בהתאם לניסיון קודם בטכניקות ניתוחיות ומיומנות ידנית, בקיאות מלאה יכולה להיות מושגת לאחר 50-100 נהלים. מחקרים מאוחרים יותר מציעים טכנולוגיות חלופיות לanastomoses עשויות להיות זמינות בעתיד 15.
המגבלה העיקרית בהליך זה היא, כמו רוב הליכי מייקרו בעכברים, שרמה גבוהה של מיומנות היאהנדרש לביצוע ואנשים מצליחין ללא מוטוריקה עדינה מצוינת אף פעם לא יכול להגיע לרמה גבוהה של מיומנות. עם זאת, עם תרגול, רוב האנשים יכולים להשיג שיעור הישרדות מקובלת. גדליו הקטנים של הרקמות גם תוצאות נוספים בגלל אילוצי הגודל של השתל הוא מאוד קטן, ולכן כמות החומר לניתוח הבא היא ההגבלה. היתרון הגדול ביותר של המודל הוא את immunogenetics המאופיין היטב של עכברים, בזמינותם הרחבה של זנים רבים לידה, מעכברים מהונדסים ועכברים בנוקאאוט, מה שמאפשר לניסויים שימושיים מאוד כדי לטפל במנגנונים מולקולריים בגוף חי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי משאב הליבה של NIH P30 אובריאן המרכז (DK 079337).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vascular Clamps | Fine Science Tools | 00396-01 (Size B-1) | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11293-00 | |
| 10-0 Needled microsuture | AROSurgical | TK-107038 | |
| Straight scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5620 | |
| Low temperature cauterizer | Beaver-Visitec International | 8441000 | |
| Self retaining retractor | World Precision Instruments | 14240 |
References
- Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18, 368-371 (1998).
- Dambrin, C., Calise, D., Pieraggi, M. T., Thiers, J. C., Thomsen, M. Orthotopic aortic transplantation in mice: a new model of allograft arteriosclerosis. J. Heart Lung Transpl. 18, 946-951 (1999).
- Calise, D., et al. Orthotopic aortic transplantation in rodents by the sleeve technique: a model system for the study of graft vascular disease. Transpl. Proc. 33, 2369-2370 (2001).
- Thomsen, M., et al. An orthotopic aortic graft mouse model to study the immunopathology of chronic vascular rejection. Transpl. Proc. 34, 2833-2835 (2002).
- Benza, R. L., George, J. F. Aortic graft transplantation in mice. J. Heart Lung Transpl. 21, 1319-1321 (2002).
- Chereshnev, I., et al. Mouse model of heterotopic aortic arch transplantation. The Journal of surgical research. 111, 171-176 (2003).
- Cho, H. R., et al. Improved surgical technique for heterotopic aortic transplantation in mice. J. Korean Med. Sci. 22, 12-15 (2007).
- Zhong, R. Organ transplantation in mice: current status and future prospects. Microsurgery. 19, 52-55 (1999).
- George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease. J. Heart Lung Transpl. 24, 2003-2014 (2005).
- Gorska, P. Principles in laboratory animal research for experimental purposes. Med Sci Monit. 6, 171-180 (2000).
- Landi, M. S., Kreider, J. W., Lang, C. M., Bullock, L. P. Effects of shipping on the immune function in mice. Am. J. Vet. Res. 43, 1654-1657 (1982).
- Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18, 368-371 (1998).
- Chen, B., et al. Carbon monoxide rescues heme oxygenase-1-deficient mice from arterial thrombosis in allogeneic aortic transplantation. Am. J. Pathol. 175, 422-429 (2009).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transpl. Proc. 5, 733-735 (1973).
- Chang, E. I., et al. Vascular anastomosis using controlled phase transitions in poloxamer gels. Nature medicine. 17, 1147-1152 (2011).
