Summary
Bir fare abdominal aort bir bölüm sadece bir allojenik veya sinjenik alıcı olarak renal arterler aşağıda orthotopically transplante edildiği bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, birörnek büyük arter nakli avantajlı olarak kabul edilir olan çalışmalarda yararlı olabilir.
Abstract
Fare anastomozlar içeren vasküler prosedürleri genellikle zordur ve cerrahın beceri bağımlı olduğu düşünülmektedir. Bu büyük ölçüde doğrudur, ancak bu işlemlerin zorluğu azaltmak ve tekrarlanabilirliği artırabilirsiniz önemli ilkeleri bir dizi vardır. Ortotopik aort nakli sadece iki uç-uca anastomoz içerir çünkü bu ilkeleri öğrenmek için hangi mükemmel bir yöntemdir, ancak tutarlı başarı için iyi bir dikiş tekniği ve gemilerin taşıma gerektirir. Bu işlem alıcının içinde yerli aorta bölümü tarafından izlenen bir donör hayvan abdominal aort uzunluğu, alımı ile başlar. Tedarik aorta sonra alıcının aort bölünmüş uçları arasına yerleştirilen ve uç uca anastomoz kullanarak yerine sütüre edilir. Bu hedefe başarıyla konsantrasyon yüksek derecede, iyi araçlar, sarsılmaz bir el ve bir takdir gerektirir gerçekleştirmek için ne kadar kolayBir fare damarlarda tromboz sonuçlanan, hasar görebilir. Bu önemli ilkeleri Öğrenme küçük kemirgenler mikrocerrahi öğrenme zaman en acemi zaman kaplar budur. Bu protokol boyunca, bu önemli noktaları bakın. Bu model, farklı deneysel sistemlerde 1-8, çeşitli damar hastalığı araştırmak için kullanılabilir. Burada gösterilen bağlamda, en sık transplant sonrası damar hastalığı, allograft intimal hiperplazi içinde meydana geldiği, organ naklinde bir ortak uzun süreli komplikasyon incelenmesi için kullanılmıştır. Modelin birincil avantajı kantitatif morfometrik analizler kolaylaştırır ve nakledilen damar ek bir denetim 9 olarak hizmet verebilir endojen gemi, bitişik yatıyor olmasıdır. Burada gösterilen teknik, genellikle 18-25 gram ağırlığındaki fareler için kullanılır. Biz C57BL/6J, BALB / CJ ve C3H/HeJ suşları kullanılarak tecrübemizi en birikmiştir.
Protocol
1. Preoperatif Hazırlık
- Cerrahi yöntemler, dikkatli yapılması ne olursa olsun, önemli bir stres sonucu. Bu tür stresin etkilerini en aza indirmek için ve rezerv maksimize etmek, hayvanların kullanımı 10,11 önce en az 72 saat süreyle vivaryum tutulmalıdır.
- Cerrahi aletler, gazlı bez ve bezlerden steril olmalıdır. Bu araçlar temas dikiş veya ameliyat alanının yalnızca kriteri sağlayan steril eldiven kullanmak için gerekli değildir.
- Hemostaz için, sıkma basınçları gerekli asgari şarttır. Aşırı basınç veya kaba kullanımdan dolayı geminin hasar 24 saat içinde arka-bacak felci, barsak iskemisi ve ölümle sonuçlanan, tromboz neden olacaktır. Bu en fazla 2 gm / cm 2 lik bir basınç ile kelepçeler kullanılarak sorunu ortadan kaldırır olduğunu bulduk. Bu kelepçeler Tablo 1'de belirtilmiştir. Kelepçe basınçları yüksek kaliteli cerrahi instrumen tarafından yapılan kelepçeleri şartnamesinde belirtilirt üreticileri. Biz ucuz kelepçeler veya atılabilir kelepçeleri evrensel çok fazla baskı uygulamayın bulduk.
- Kollateral damarların yanı sıra abdominal aorta göreli konumları ve inferior vena kava (İVC) yeri zorlanma bağlıdır. Ayrıca özellikle kollateral damarların konumu, bireysel fareler arasında küçük farklılıklar bulunuyor.
2. Donör Operasyonu
- Fareler isofluran (1.5-2.5% indüksiyon, hava içinde% 1.0 bakım) ya da (55-65 mg / kg) pentobarbital ile anestezi olabilir. Pentobarbital bir zaman sınırı (1,5 saat) dayatır, fakat istenirse, en iyi erişim için hayvan dönen seçeneği ile cerrah sağlar. Anestezi süresi ameliyat sırasında bağırsak veya karaciğer üzerine gerektiğinde anestezik 2-3 damla koyarak 2 kadar saat kadar uzatılabilir. Ketamin / ksilazin (Ketamin ve Ksilazin, ip için 7 mg / kg 100 mg / kg vücut ağırlığı), aynı zamanda iyi eğitimli cerrahlar ca tarafından kullanılabilirn, 1 ila 1.5 saat içinde bitirmek prosedür, ancak daha dar bir kasa doz aralığına sahiptir. ABD'de, pentobarbital kullanılması nedeniyle kısa kaynaklarının son yıllarda daha problemli hale gelmiştir. Bu anestezi derinliğinin yeterli olduğundan emin olmak için kontrol edilmesi şarttır. Toe-tutam refleks yeterli derinlikte en iyi göstergesi ama birisi de solunum hızı ve diğer hareketleri dikkat etmelisiniz.
- Anestezi indüksiyonundan sonra, ventral karın saç kaldırmak için tüy dökücü jel veya bir tıraş makinesi kullanın.
- Spread-eagled konumda tutun laboratuvar bant kullanarak işletim gemide hayvan monte edin. Metalik bir çalışma masası ameliyat sırasında sıcaklık destek sağlamak için bunun altında bir ısıtma yastığı kullanılmasına izin verir. Biz elle ev kullanımı için tüketici sınıf birim ısıtma yastığı, ve sıcaklığı kontrol eder. Isı 35-38 ° arasında tutulur. Metalik çalışma masası da prosedürleri arasındaki sterilize etmek kolaydır.
- Klorheksidin gibi bir dezenfektan kullanılarak alan dezenfekte, bir etanol ile yıkama takip etti. Yeterli dezenfeksiyon sağlamak için, bu prosedürü üç kez tekrarlayın. Varsa Bu aynı zamanda, saç kalan kesim parçalarını kaldırmak olacaktır.
- Kullanma makas abdominal organları açığa beden duvarından geçerek bir kesi yapmak.
- Karın büyük damarların maruz yan organlar defol, pamuklu bir bez kullanın. Viscera nemli tutmak için ılık serum fizyolojik ile ıslatılmış bir gazlı bez parçasının üzerine yerleştirilir.
- Künt diseksiyon kullanarak, çok dikkatli uzaklıkta çevreleyen dokudan abdominal aort teşrih. Inferior vena kava uzak damar Diseksiyon çok dikkatli olun. Dikkatlice kaldırılır ve dağlanmış gereken bu gibi bel arter olarak bir ya da daha fazla dal, olacaktır. Diseke aort bölümünde böbrek damarlarının altında ve femoral arterler içine aort çatallanma üzerinde olmalıdır. Bu bölüm, birçok için verici madde olarak hizmet edebilirgemiler var dallanma ve donör hayvanların boyutunu kaç bağlı s iki alıcıya.
- Sadece sadece çatallanma Yukarıdaki renal arterler ve başka aşağıda bir sütür bağla. Kullanma makas aort bölün, tam 200 U / ml heparin içeren serum fizyolojik ile greft durulayın. Çok dikkatli bir şekilde kabın bir ucundan tutmak ve yerçekimi ile damar içinden geçen, böylece tuz çözeltisi damla. Hava kabarcıkları damar yoluyla çalışmasına izin vermeyin. Aksi intima daha sonra tromboz ile sonuçlanan zarar görebilir mümkün olduğu kadar az damar ucu tutun. Alanından kaldırın ve hemen buz gibi tuzlu bir kaba koyun. Donör hayvanların exsanguinate izin verin.
3. Alıcı Operasyonu
- Yukarıda hayvan anestezisi ve tüy dökücü jel uygulamak veya karın üzerinde saç kaldırmak için bir tıraş makinesi kullanın. Sadece biz 0,1 mg / analjezi kurmak kg subkütan buprenorfin bir dozunu kesi öncesinde.
- Mlaboratuvar bant kullanarak işletim alanında ount hayvan. Hayvan operasyon sırasında vücut ısısını korumaya yardımcı olacak sıcak bir işletme aşamasında monte edilmelidir.
- Onları kurumasını önlemek için gözleri gentamisin oftalmik merhem uygulayın.
- Bir etanol yıkama ardından karın, dezenfekte edin. Yeterli dezenfeksiyon sağlamak için, bu prosedürü üç kez tekrarlayın.
- Bir sonraki adıma geçmeden önce tekrar anestezi yeterliliği kontrol edin.
- Altındaki dokulara çarpacak için dikkatli olmak, iki aşamada cilt ve vücut duvarı ile orta hat kesi olun.
- Abdominal kesi açık tutmak için bir dağıtıcı yerleştirin. Yol kelepçenin toplu tutmak için arka sonuna doğru vida montaj yöneltin.
- Serum fizyolojik ile steril gazlı bez bir kare ıslatın ve bağırsakların üzerine yerleştirin. Gazlı bez üzerine hafifçe parmağınızla, bağırsak altında bir pamuklu çubukla yerleştirin ve yavaşça s bağırsak üzerinde yansıtmakide yüzden gazlı bez üstüne oturuyor. Gazlı başka bir parça al, bağırsak üzerine yerleştirin ve salin ile ıslatın.
- Aorta ve inferior vena kava (İVC) kapsayan herhangi bir yağ dokusu çıkarın. Nazik olun. İVK çok kırılgandır.
- Yavaşça IVC gelen infrarenal aorta diseksiyonu forseps kullanın. Bunlar arasında yeterli bir kap ile iki kelepçe için oda sağlamak için yeterince büyük bir alan bu tür ayrılınca, greft dikilebilir için yeterli damar olacaktır, ki. Temizleme Diseksiyon yaparken, damar dalları arayın. Eğer gerekirse, bir düşük sıcaklık cauterizer ile yakmak.
- Sadece sadece çatallanma Yukarıdaki renal arter ve diğeri aşağıda bir vasküler klemp takın.
- Aorta kesin. Aort uçları genellikle yaklaşık 5 mm'lik bir boşluk bırakarak, geri çekilecektir. Hemostaz için kontrol edin. Kelepçeler düzgün çalıştığından, kanın sadece küçük bir miktar kesim sonrası öncelemelidir. Kanama devam ederse, emin bir şey olmak için kelepçelerini kontrol parazite olduğunuOnlarla ing. Aort hiçbiri kaldırılır unutmayın. Bu sadece bölünmesiyle elde edilir.
- Heparinize salin ile kesme ucu (200 U / ml) durulayın ve sonra bir bez ile ekstra çözüm çıkarın.
- Her ucunda üç süreksiz sütürler kullanılarak yerine Tack greft. Sadece iki ucundan da anastomoz bir tarafında dikiş, ve daha sonra bir sürekli çalışan dikiş ya da daha çok aralıklı dikişlerle kalan doldurun. Yedi sekiz süreksiz sütürler yeterlidir. Eğer çalışan bir dikiş kullanırsanız, damar duvarları rahat kalır ve anastomoz hattında darlık neden olmaz emin olun.
- Dikkatle kranial sonunda kelepçe çıkarın ve dikiş hatlarında sızıntı olup olmadığına bakın. Sızma küçük bir miktar Tamam bu konuda bir dakika içinde durur sağlamaktadır. Bundan daha fazla varsa, o kanamayı durdurma ile bir tek dikiş kullanmak mümkündür.
- Hafifçe ıslatılmış pamuk aplikatör ile anastomoz yukarıda aort basın ve ardından ikinci kelepçe çıkarın. Yavaşça basın vebirkaç kez bırakın ve aort Patent göründüğünü kontrol edin. Greft hemen perfüze olacak ve bir darbe görünür olmalıdır.
- Bağırsak kapsayan gazlı bez çıkarın ve yerine onları geri hareket ettirin. Bağırsak büküm kaçının ve normal anatomik yönünü korumak.
- 5-0 Vicryl kullanarak kas tabakası kapatın.
- 5-0 veya 6-0 prolen kullanarak cilt kapatın.
- 5 mg / anestezi sonlandırmadan önce analjezi artırmak için kg carprophen ile subkutan fare davranın.
- Fare 0.5-0.8 ml serum fizyolojik subkutan ver.
- Kurtarmak için ısıtılmış bir kafes içinde fare yerleştirin. Normal iyileşme olduğundan emin olmak için kurtarma sırasında dikkatle izleyin. Ameliyattan sonra 2-3 saat, fare nispeten normal olarak davranmak olmalıdır. 12 saat post-operatif olarak, analjezi için 2 mg / kg deri altından buprenorfin ile hayvan tedavi. Herhangi bir zamanda, hayvan yaslanmış, varsa, gürültü yapmak veya hareket sınırlı bir dizi sergileyen, sorunu araştırmak. Eğerkesin nedeni tespit ve tamir edilemez, hayvan kurumsal protokolleri başına ötenazi edilmelidir. 24 saat az hayvan 5 mg / kg 'da subkütan carprophen bir doz almak gerekir. Hind bacak felci başarısız anastomoz veya trombüs gösterir. Bu durumda, hayvan ötenazi olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 bir aort greft gösterir. Beyaz oklar dikiş hatları göstermektedir. Bir patent greft görünür bir darbe gösterecektir. Şekil 2. Alıcının sağkalım 56 gün süreyle takip edildiği tipik bir deney gösterir. Bir grup BALB / c aort ile nakledilen (C57BL / 6 x FVB) wild-tip alıcı fareler oluşuyordu. "KO" belirlenen diğer grup, 24 saat içinde greft trombozu sonuçlanan heme oksijenaz-1, ifade eksik alıcıları (C57BL / 6 x FVB) oluşmaktadır. Özellikle, tüm alıcıların ölüm bu sonuçlar gösterildiği gibi. Şekil 3 echo IVC ve normal bir hayvan ve bir transplant abdominal aorta ölçümleri. Greft patent ve olmayan nakledilen aorta görünüm olarak benzer olduğunu unutmayın.
Şekil 1.Bir nakledilen aortun bir görünüm. Beyaz oklar dikiş hatları göstermektedir.
Şekil 2. Bir BALB / c fare aort ile nakledilen farelerin iki grupta aort transplantasyonu sonrası sağkalım Kaplan-Meier tasvirleri. "KO" 24-48 saat içinde aort greft trombozu sonuçlanan heme oksijenaz-1, ifade eksikliği alıcıları belirler. "WT" vahşi-tip littermates atar. Den yeniden basılmıştır: Karbon monoksit allojenik aort nakli, Chen B, Guo L, Fan C, Bolisetty S, Joseph R, Wright MM, Agarwal A, George JF arteriyel trombozu heme oksijenaz-1-eksik farelerde kurtarır. J Pathol Am. Tem 2009; Elsevier izni ile 175 (1) :422-9.
Figüre 3. inferior vena kava (IVC) ve normal bir fare aracılığı (sol panel) ve aort nakli alıcı (sağ panel) in vivo olarak abdominal aorta görüntüleme Echo. Görüntüleri Visualsonics Vevo 660 cihazı ile üretilmiştir. Asteriskler damarlarının lümeninde gösterelim.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fareler çok iyi immunogenetically 9,12,13 tanımlanmış olup, istenirse kolayca, belirli genlerin kendi ifadesini değiştirmek için manipüle edilebilir, çünkü aort nakli Fare modellerinde bir çok avantaj sağlamaktadır. Girişte belirtildiği gibi, fare, vasküler cerrahi, çünkü gemilerin büyüklüğü en modelleri daha zordur. Böyle aorta gibi bile büyük arter, genellikle iç çapı 100-200 mikron fazla vardır; böylece bu gemilerin manipüle beceri ve maharet 8,14 önemli miktarda gerektirir. Sadece sistemi uygulamaya başlayan kişiler tarafından bu ameliyatı gözlenen en sık görülen komplikasyon genellikle kaba işleme veya sıkma ile intima hasarla sonuçlanan tromboz sonucu, arka bacak felci. Mikrocerrahi için araçlar uygun satan şirketler tarafından pazarlanan kelepçeler çoğu 25 g / cm 2 genellikle daha yüksek bir basınç ile, fareler için kullanılan çok fazla baskı oluşturabilir. ClaKullandığımız MPS 2 g / cm 2, hemostaz elde etmek ve damarları zarar vermeyen için yeterli bir basınç bir basınç ile, düzgündür. Bazı cerrahlar yerine kelepçeler daha sütür kullanmayı tercih ediyorum. Bu doğru basınç ölçmek için ve bizim görüşümüze göre, daha düşük bir başarı oranı katkıda bulunabilir cerrahın yeteneği bağımlı bir yöntemdir çünkü bu uygulama önermiyoruz. Uygulama ile,% 90 ya da daha iyi sağkalım oranları beklenmelidir.
Uçtan uca anastomoz tekniğini Sütür atmak deneyimi ile kazanılır kritik bir beceridir. Cerrahi teknikler ve el becerisi ile önceden deneyimine bağlı olarak, tam yeterlilik 50-100 işlemlerinden sonra elde edilebilir. Daha yeni çalışmalar anastomozlar için alternatif teknolojiler gelecekte 15 mevcut olabilir öneririz.
Bu yöntemin birinci sınırlama beceri yüksek seviyede olduğu, farelerde en mikrocerrahi prosedürleri gibi, birmükemmel ince motor becerileri olmadan başarılı bir şekilde yürütülmesi ve bireyler için gerekli yeterlilik yüksek düzeyde ulaşmak asla olabilir. Ancak, uygulama ile, en bireyler kabul edilebilir bir hayatta kalma oranlarını sağlayabilirler. Greft boyutu çok küçük olduğu için dokuların küçük boyutu, aynı zamanda ek kısıtlamalar ile sonuçlanır, böylece daha sonraki analiz için malzeme miktarını sınırlamaktadır. Modelin en büyük avantajı in vivo moleküler mekanizmaları ele çok yararlı deneyler için izin, farelerin de karakterize immünogenetik, çok sayıda doğal ırklar, transgenik fareler ve nakavt fareler geniş yer olduğunu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH P30 O'Brien merkezi (DK 079.337) çekirdek kaynak tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vascular Clamps | Fine Science Tools | 00396-01 (Size B-1) | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11293-00 | |
| 10-0 Needled microsuture | AROSurgical | TK-107038 | |
| Straight scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5620 | |
| Low temperature cauterizer | Beaver-Visitec International | 8441000 | |
| Self retaining retractor | World Precision Instruments | 14240 |
References
- Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18, 368-371 (1998).
- Dambrin, C., Calise, D., Pieraggi, M. T., Thiers, J. C., Thomsen, M. Orthotopic aortic transplantation in mice: a new model of allograft arteriosclerosis. J. Heart Lung Transpl. 18, 946-951 (1999).
- Calise, D., et al. Orthotopic aortic transplantation in rodents by the sleeve technique: a model system for the study of graft vascular disease. Transpl. Proc. 33, 2369-2370 (2001).
- Thomsen, M., et al. An orthotopic aortic graft mouse model to study the immunopathology of chronic vascular rejection. Transpl. Proc. 34, 2833-2835 (2002).
- Benza, R. L., George, J. F.
- Chereshnev, I., et al. Mouse model of heterotopic aortic arch transplantation. The Journal of surgical research. 111, 171-176 (2003).
- Cho, H. R., et al. Improved surgical technique for heterotopic aortic transplantation in mice. J. Korean Med. Sci. 22, 12-15 (2007).
- Zhong, R. Organ transplantation in mice: current status and future prospects. Microsurgery. 19, 52-55 (1999).
- George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease. J. Heart Lung Transpl. 24, 2003-2014 (2005).
- Gorska, P. Principles in laboratory animal research for experimental purposes. Med Sci Monit. 6, 171-180 (2000).
- Landi, M. S., Kreider, J. W., Lang, C. M., Bullock, L. P. Effects of shipping on the immune function in mice. Am. J. Vet. Res. 43, 1654-1657 (1982).
- Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18, 368-371 (1998).
- Chen, B., et al. Carbon monoxide rescues heme oxygenase-1-deficient mice from arterial thrombosis in allogeneic aortic transplantation. Am. J. Pathol. 175, 422-429 (2009).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transpl. Proc. 5, 733-735 (1973).
- Chang, E. I., et al. Vascular anastomosis using controlled phase transitions in poloxamer gels. Nature medicine. 17, 1147-1152 (2011).
