Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Fastställande av gasfas Acidities av Oligopeptider

Published: June 24, 2013 doi: 10.3791/4348
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, University of the Pacific

Summary

Fastställandet av gas-fas acidities av cysteininnehållande oligopeptider beskrivs. Experimenten utförs med användning av en trippel kvadrupol masspektrometer. De relativa acidities av peptiderna mäts med kollisionen-dissociation experiment, och de kvantitativa acidities fastställs med utökade Cooks kinetisk metod.

Abstract

Aminosyrarester belägna vid olika positioner i veckade proteiner uppvisar ofta olika grader av acidities. Till exempel är en cysteinrest belägen vid eller nära N-terminalen av en helix ofta surare än den vid eller nära C-terminalen 1-6. Även om omfattande experimentella undersökningar i syra-bas-egenskaper hos peptider har utförts i den kondenserade fasen, i synnerhet i vattenlösningar 6-8, är resultaten ofta kompliceras av lösningsmedelseffekter 7. I själva verket är de flesta av de aktiva ställena i proteiner beläget nära det inre region där lösningsmedelseffekter har minimerats 9,10. För att förstå inneboende syra-bas egenskaper hos peptider och proteiner, är det viktigt att utföra studierna i en lösningsmedelsfri miljö.

Vi presenterar en metod för att mäta de acidities av oligopeptider i gasfas. Vi använder ett cysteininnehållande oligopeptid, Ala 3 CysNH 3 CH), som modell föreningen. Mätningarna är baserade på väletablerade förlängda Cooks kinetisk metod (figur 1) 11-16. Experimenten utförs med användning av en trippel-kvadrupol masspektrometer gränssnitt med en elektrospray (ESI) jonkälla (figur 2). För varje peptid prov, finns flera referenspunkter syror valt. De referensnivåer syrorna är strukturellt liknande organiska föreningar med kända gas-fas acidities. En lösning av blandningen av peptiden och en referens-syra införes i masspektrometern, och en gas-fas proton-bunden anjonisk kluster av peptid-referens syra bildas. Den proton-bundna kluster massa isoleras och därefter fragmenterad via kollision-dissociation (CID) experiment. De resulterande fragmentjon abundances analyseras med en relation mellan acidities och klustret jon dissociation kinetik. Den gasfas surhet av peptiden är sedan obtaiNed genom linjär regression av termo-kinetiska tomter 17,18.

Metoden kan tillämpas på en mängd olika molekylära system, däribland organiska föreningar, aminosyror och deras derivat, oligonukleotider och oligopeptider. Genom att jämföra gas-fas acidities mätt experimentellt med de beräknade värdena för olika konformerer kan konformationella effekter på acidities utvärderas.

Introduction

De acidities av aminosyror är bland de viktigaste termokemiska egenskaper som påverkar strukturer, reaktivitet, och den fällbara-utspelas processer proteiner 9,19. Individuella aminosyrarester visar ofta olika effektiva acidities beroende på sina platser i proteiner. I synnerhet resterna belägna vid de aktiva ställena uppvisar ofta störs avsevärt acidities. Ett sådant exempel är cysteinresten som är bosatt i de aktiva ställena i thioredoxin super-familj av enzymer 20,21. Den aktiva cystein är ovanligt surt jämfört med dem i ovikta proteiner 3-5. Det har föreslagits att den spiralformiga konformationen kan ha ett betydande bidrag till den ovanliga surhet. Det finns omfattande experimentella undersökningar i syra-bas-egenskaper av peptider som utförs i lösningar, särskilt i vattenlösningar 2,6-8. Resultaten var ofta kompliceras av lösningsmedelseffekter7. I själva verket är de flesta av de aktiva ställena i proteiner beläget nära det inre region där lösningsmedelseffekter minimeras 9,10.

För att förstå inneboende syra-bas-egenskaper av peptider och proteiner, är det viktigt att genomföra studier i ett lösningsmedel-fri miljö. Här presenterar vi en masspektrometri-metod för bestämning av gasfas-surhet. Den metod kallas den förlängda Cooks kinetisk metod. Denna metod har med framgång tillämpas på ett brett spektrum av kemiska system för bestämning av olika termokemiska egenskaper, såsom gasfas-surhet, protonen affinitet, metalljonen affinitet, elektronstrålekanonen affinitet och den joniseringsenergi 11-15, 22-26. Vi har tillämpat denna metod för att bestämma de gas-fas acidities av en serie av oligo cystein-polyalanin och cystein-polyglycin peptiderna 17,18,27. Dessa studier visar att den N-terminala cysteinet peptides är betydligt surare än motsvarande C-terminala sådana. De höga acidities av den tidigare är sannolikt på grund av de spiralformade konformationella effekterna där tiolatanjon starkt stabiliseras genom interaktion med Helix makro-dipol. På grund av den icke-flyktiga och termiskt labila naturen av peptider, är den kinetiska metoden den mest praktiska tillvägagångssätt tillgängliga för närvarande för att producera någorlunda korrekt syra-bas termokemiska mängder av peptider 28.

Den allmänna ordningen och ekvationen associerat med den kinetiska metod visas i figur 1. Fastställandet av gas-fas surhet en peptid (AH) börjar med bildandet av en serie av proton-bundna kluster anjoner, [A • H • A i] ¯ (eller [A ¯ • H + • En i ¯] ¯), i jonkällan regionen av masspektrometer, där A ¯ och Aj ¯ är de deprotonerade former av peptiden ochde referensnivåer syror, respektive. De referensnivåer syror är organiska föreningar med kända gas-fas acidities. Referensvärdena syror bör ha strukturer som liknar varandra (men inte nödvändigtvis liknande den av peptiden). Likheten av strukturerna mellan referens syror säkerställer likheten mellan entropies av avprotonering bland dem. Den proton-bundna kluster anjoner är massproducerade väljs och collisionally aktiveras och därefter dissocieras användning kollision-dissociation (CID) experiment för att ge de motsvarande monomera anjoner, A ¯ och Aj ¯, med konstanterna för k och k i, respektive, som visas i fig 1a. Om sekundära splittringarna är försumbara, mängdförhållandet mellan de CID fragmentjoner, [A ¯] / [Aj ¯], representerar ett ungefärligt mått på förhållandet mellan konstanterna, k / k i. Under antagandet att det inte finns någon omvänd aktiveradion hinder för både dissociation kanaler, CID produktjon grenkvoter, ln [A ¯] / [A Jag ¯], kommer linjärt korrelerad till gasfas surhet av peptiden (Δ acid H) och för de referens-syror (Δ acid H I), som visas i figur 1b. I denna ekvation är Δ syra H avg den genomsnittliga gas-fas surhet av referens-syror, är Δ (Δ S) entropin sikt (vilket kan antas vara konstant om referens syrorna är strukturellt lika varandra), R universella gaskonstanten, och T eff är den effektiva temperaturen i systemet. Den effektiva temperaturen är en empirisk parameter som beror på flera experimentella variabler, inklusive kollisionsenergin.

Värdet på gasfas-surhetsgrad bestäms genom att konstruera två uppsättningar av termo-kinetiska tomter. Den första uppsättningen är obupprätthålls genom plottning ln ([A ¯] / [Ai ¯]) mot Δ acid H i - Δ syra H avg, såsom visas i fig. 4a. Linjär regression kommer att ge en uppsättning av raka linjer med sluttningarna av X = 1 / RT EFF och fångar i Y = - [Δ acid H - Δ acid H avg] / RT eff - Δ (Δ S) / R. Den andra uppsättningen tomter erhålls genom att plotta de resulterande fångar (Y) från den första uppsättningen mot motsvarande backar (X), som visas i figur 4b. Linjär regression ger en ny linje med en lutning av Δ acid H - Δ acid H avg och en skärningspunkt Δ (Δ S) / R. Värdet av Δ syra H erhålls sedan från lutningen och entropi sikt Δ (Δ S), erhålls fråninterceptet.

Experimenten utförs med användning av en trippel kvadrupol masspektrometer gränssnitt till en elektrospray (ESI) jonkälla. Ett schematiskt diagram över masspektrometern visas i figur 2. De CID experiment utförs i massa välja proton-bundna kluster anjoner med den första kvadrupol enheten och låta dem genomgå kollisioner med argonatomer läckte av kollisionen kammare som hålls vid ett tryck av ca 0,5 mTorr. Dissociation produkt joner massa analyseras med den tredje quadrupole enheten. CID-spektra registreras vid flera kollisionsenergier med m / z-intervall tillräckligt bred för att täcka alla möjliga sekundära fragment. CID produkt jonintensiteter mäts genom att ställa instrumentet i den valda reaktion övervakning (SRM) läge där skanningen är inriktad på utvalda produktområden joner. CID experiment utförs vid fyra olika kollisionsenergier, motsvarandecentrum-of-massa energier (E cm) av 1,0, 1,5, 2,0, och 2,5 eV, respektive. I mitten-av-massa energi beräknas enligt följande ekvation: E cm = E lab [m / (M + m)], där E ​​lab är kollisionsenergin i laboratoriet ram, m är massan av argon, och M är massan av den proton-bundna kluster jon.

I den här artikeln använder vi oligopeptiden Ala 3 CysNH 2 (A 3 CH) som modell föreningen. C-terminalen är amiderad och tiolgruppen (SH) i cysteinresten blir det sura området. Valet av lämpliga referensvärden syrorna är avgörande för en framgångsrik mätning av gas-fas surhet. Den idealiska referens syrorna är strukturellt likartade (varandra) organiska föreningar med väletablerade gas-fas surhetsgrad värden. Referensvärdena syror bör ha syra värden nära den hos peptiderna. För peptid A 3 CH, halogenerade sex carboxylic syror väljs som referens syror. De sex referenspunkter syror är klorättiksyra (MCAH), bromättiksyra (Mbah), difluorättiksyra (DFAH), diklorättiksyra (DCAH), dibromoacetic syra (DBAH), och tri (TFAH). Två av dem, kommer DFAH och Mbah, användas för att illustrera protokollet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ett. Beredning av provet Solutions

  1. Först förbereder stamlösningarna av peptiden och de sex syror Referens Använd ett blandat lösningsmedel av metanol och vatten i ett 01:01 volymförhållande. De stamlösningar bör ha en koncentration av ca 10 -3 M.
  2. Väg upp ett mg av den fasta peptiden prov, A 3 CH, i ett 1,5 ml Eppendorf-rör och tillsätt 1,0 ml av blandat lösningsmedel av metanol och vatten, och blanda med hjälp av en virvel.
  3. Väg upp ett mg av difluorättiksyra (DFAH) och tillsätt 1,0 ml av det blandade lösningsmedlet av metanol och vatten, och blanda med hjälp av en virvel.
  4. Använd samma procedur för att göra stamlösningarna för de andra fem referens syror klorättiksyra (MCAH), bromättiksyra (Mbah), diklorättiksyra (DCAH), dibromoacetic syra (DBAH), och trifluorättiksyra (TFAH).
  5. Rita omkring 50 | il av peptiden stamlösning i ett 1,5 ml Eppendorf-rör, och dra om 50 | il av stamlösningen av DFAH in i sa-mig Eppendorf-rör. Späd den blandade lösningen med 900 | il av det blandade lösningsmedlet av metanol och vatten för att uppnå en slutlig koncentration av ca 10 -4 M. Denna utspädda lösning kommer att användas som provlösningen för masspektrometriska mätningar. Det faktiska förhållandet mellan peptiden till referens syran samt den slutliga koncentrationen av provlösningen kommer att justeras baserat på de jonsignal abundances observerats i masspektrometern.
  6. Använd samma procedur för att preparera provet lösningar av peptiden med de övriga fem referens syror.

2. Masspektrometri Mätning 1: Proton-bundna Cluster jonbildning

  1. Det första steget av masspektrometri mätningen är att generera stabila proton-bundna kluster joner av peptiden med en referens syra.
  2. Ställ instrumentet i negativ jon MS-läge med ESI nålen spänningen vid -4,5 kV, den kapillära spänningen vid ca -35 V, samt torkgasen temperaturhölls vid 150 ° C. Ställ in bredden Q1 topp och Q3 toppbredden både till den kalibrerade skalan (Toppens bredd är ett instrument parameter som kan användas för att justera upplösningen av topparna. "Den kalibrerade skalan" inställning gör att visa smala toppar för bättre toppseparationen ). Det kapillära spänning och den torkande gasen temperatur kan justeras för att förbättra de observerade jon abundances.
  3. Ingjuta ca 0,5 ml av provlösningen i peptid-DFAH i en 1 ml Hamilton spruta och anslut sprutan till ESI nålen inlopp med PEEK slang. Placera sedan sprutan till sprutpump. Slå på sprutpumpen att infundera provlösningen in i ESI nålen med flödet vid 10 ul / min.
  4. Slå på ESI nålen spänningen att aktivera ESI processen. Slå på detektorn. Ett mass-spektrum display bör observeras i profilen. Om displayen är i Centroid läget, växla till profilen. Titta på proton-bundna formation kluster jon från monitoring toppen vid m / z 428. Signalen överflöd av klustret jonen kan justeras genom att finjustera instrumentet. En viktig parameter är den kapillära spänning. Man kan manuellt ändra kapillär spänning (typiskt i området av -20 till -50 V) för att maximera mängden av toppen vid m / z 428.

Tre. Masspektrometri Mätning 2: CID Alternativexponeringsfunktioner Experiment

  1. Nästa steg är att utföra CID bracketing experimentet.
  2. När överflödet av klustret jonen når önskat värde (ca 100 mV), växlar instrumentet till MS / MS-läge. I detta läge, Q1 fungerar som ett massfilter att isolera klustret jon, Q2 fungerar som kollisionscell och fungerar Q3 som massanalysatorn.
  3. Ställ kollisionen gas (argon, i det här fallet) tryck vid 0,5 mTorr och kollisionen energi vid 17 eV. Tre toppar bör observeras i masspektrum teckenfönstret. Toppen vid m / z 428 motsvarar klustret jon, [DFA • H • A 3 CS] ¯. De två toppar vid m / z 332 och m / z 95 motsvarar den deprotonerade peptiden (A 3 CS ¯) och deprotonerade difluorättiksyra (DFA ¯), respektive. Den mindre topp vid m / z 298 är en sekundär fragment från deprotonerad peptiden. Skaffa en CID-spektrum för 2 min, figur 3a.
  4. Utföra liknande CID experiment och skaffa en CID-spektrum för provlösningen av peptiden med bromättiksyra (Mbah), Figur 3b.
  5. Utföra liknande CID experiment och förvärva CID-spektra för de urvalsundersökningar lösningar av peptiden med alla andra referenspunkter syror. Den erhållna CID-spektra kommer att vara kvalitativt jämförbar med fig. 3a och 3b, men de m / z-värden och de relativa topphöjderna kommer att vara annorlunda.

4. Masspektrometri Mätning 3: Kinetic Method

  1. Det sista steget är att förvärva SRM spektra.
  2. Växla spektrum display för att centroid och ställ in instrumentet till den valda reaktionen övervakning (SRM) läget. Håll m / z 428 som den isolerade jon av den första quadrupole (Q1), och fyll i fyra massorna (mass-till-laddningsförhållanden) som skall övervakas av tredje quadrupole (Q3). De fyra massorna är m / z 428 (klustret jon), m / z 332 (peptiden jon), m / z 298 (fragmentet av peptiden jon), och m / z 95 (DFA ¯ jon). Håll trycket kollision gas vid 0,5 mTorr.
  3. Ställ in kollisionsenergin till 11,7 eV och förvärva spektra för 5 min.
  4. Ändra kollisionsenergin till 17,6 eV och förvärva spektra för 5 min.
  5. Ändra kollisionsenergin till 23.4 eV och 29.3 eV, och förvärva spektra vid båda kollisionsenergier i 5 min.
  6. Utföra liknande mätningar för peptiden med alla andra referens syror.

Fem. Data Analysis

  1. Kopiera värdena för de jonintensiteter från all SRM spektra på ett Excel-kalkylblad.
  2. Beräkna CID produktjon grenkvoter, ln ([A ¯] / [A i ¯]), mättes för alla sex proton-bundna kluster på alla fyra kollisionsenergier. Sample värden visas i tabell 1.
  3. Pricka in värdena ln ([A ¯] / [A i ¯]) mot värdet av Δ acid H I - Δ acid H Avg. Detta kommer att ge fyra tomter motsvarande data vid fyra kollisionsenergier, Figur 4A.
  4. Extrahera värden för backarna och de fångar genom linjär regression av de fyra tomter. I detta fall, backarna är positiva värden och fångar är negativa värden. Ge symbolen "X" till backarna och symbolen "Y" för avlyssningar. Resultaten visas i tabell 2. Multiplicera värdena för Y med -1 och använder symbolen Y "för att representera de positiva värden (detta gör att y-axeln till disspela positiva värden). OBS, denna omvandling frivillig så länge motsvarande värden används för att göra tomten för nästa steg.
  5. Pricka in värdena för Y "mot värdet av X, figur 4b. Linjär regression av tomten ger en lutning på 1.706 och en skärningspunkt -0,536. Lutningen motsvarar Δ acid H - Δ acid H Avg. Värdet av Δ syra H avg är känt att vara 330,5 kcal / mol, som bestäms av den uppsättning av valda referensföreningar syror. Värdet på gasfas-surhet av peptiden erhålles sedan från lutningen: Δ acid H (A 3 CH) = 332,2 kcal / mol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

  1. CID gafflingsinställningarna experiment ger information om de relativa acidities av peptiden jämfört med de valda referens syror. Två representativa CID spektra av peptiden (A 3 CH) med två referens syror, DFAH och Mbah, visas i figur 3. I fig. 3a jonen överflöd (topphöjd) av peptiden jon är svagare än den för DFA ¯, och i figur 3b, är den jon överflöd av peptiden jon starkare än MBA ¯. De två spektra tyder på att gasfas surhet av peptiden är inom området mellan acidities av dessa två referens syror.
  2. Den kvantitativa värdet för gasfas-syrahalt av peptiden bestäms från de kvantitativa CID experiment. De termo-kinetiska kurvor för dissociationen av de proton-bundna kluster av peptiden med de sex referens syrorna visas i Figur 4. Linjär regression av tomterna enligt termo-kinetiska relationship mellan gasfas-syrorna och CID produktjon förgrening förhållande (figur 1b) ger värdet för gasfas-syrahalt av peptiden A 3 CH, som är 332,2 kcal / mol. Sampelvärden av backarna och fångar visas i tabellerna 1 och 2.

Figur 1
Figur 1. Den övergripande planen för den utökade Cooks kinetisk metod. A) Ordningen för proton-bundna kluster jon dissociation. B) termo-kinetiska förhållandet mellan gas-fas acidities och CID produkten jon förgrening ratio. I denna ekvation är Δ syra H I gasfas surhet värdet av de individuella referenskvantiteter syrorna är Δ syra H avg på ettverage gasfas-syrahalt av referensvärdena syrorna, är Δ syra H gasfas surhetsgrad för peptiden, är Δ (Δ S) entropin sikt, R är den universella gaskonstanten, och T eff är den effektiva temperaturen i systemet .

Figur 2
Figur 2. En schematisk ritning av en trippel-kvadrupol masspektrometer. ESI är elektrosprayjonisering jonkällan. Q1 och Q3 representerar den första och tredje quadrupole enheter, respektive. Vid utförande av CID experimentet är de proton-bundna kluster joner massa utvalda av Q1, och styrs in i kollisionscell att kolliderar med argon (Ar) atomer läckt in i kollisionscell och de resulterande fragmentjonerna analyseras genom Q3.

Figur 3 Figur 3. Den CID-spektra för proton-bundna kluster joner av peptiden med två referens syror, a) [DFA • H • A 3 C] ¯ och b) [MBA • H • A 3 C] ¯. Är spektra ritas som den relativa ion överflöd mot m / z-värde.

Figur 4
Figur 4. Thermo-kinetiska tomter för peptiden med sex referenspunkter syror samlats vid fyra kollisionsenergier a) Handlingen i Y = ln ([A ¯] / [A i ¯]) mot X = Δ acid H i -. Δ acid H avg . b) Handlingen i Y '= [Δ acid H - Δ acid H </ Em> avg] / RT eff - Δ (Δ S) / R mot X = 1 / RT eff.

Tabell 1. Värden för CID förgrenade produkt jonförhållanden, ln ([A ¯] / [A i ¯]), för klustret joner av peptiden med DFAH och Mbah.

HA I 11,7 eV 17,6 eV 23,4 eV 29,3 eV
MCAH 3,68 3,50 3,39 3,45
Mbah 2,83 2,65 2,45 2,24
DFAH -0,442 -0,268 -0,0921 0,167
DCAH -2,60 -2,41 -2,22 -2,13
DBAH -2,43 -2,44 -2,49 -2,60
TFAH -5,41 -5,02 -4,71 -4,44
Tabell 2. Värden på backarna (X) och de fångar (Y) till följd av linjär regression av den första uppsättningen av termo-kinetiska plottar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den framgångsrika mätning av gas-fas surhet en peptid bygger till stor del på valet av lämpliga referensvärden syror. Den idealiska referens syrorna är strukturellt liknande organiska föreningar med väletablerade gas-fas surhetsgrad värden. Referensvärdena syror bör ha liknande strukturer till varandra. Detta kommer att säkerställa en likartad entropi deprotonation för varje referens syrorna i uppsättningen. Referensvärdena syror bör ha syra värden nära de av peptiderna. För kortare cysteininnehållande oligopeptider med amiderad C-terminalerna, den halogenerade karboxylsyror är lämpliga referenspunkter syror. Ett avgörande steg mot framgångsrik CID experiment är bildandet av stabila proton-bundna kluster joner med hög överflöd. Stabiliteten och överflödet kan till stor del förbättras genom att justera förhållandet av peptiden mot referensplanet syra, koncentrationen av provlösningen, och förhållanden för instrumenten (såsom nålen spänning, det torkandegastemperatur, och det kapillära spänning). En avgörande instrumentella skick är den kapillära spänning (eller konspänningen för vissa andra typer av instrument). En varning är att undvika att använda prov lösningar som också är koncentrerade.

Den beskrivna metoden är inte begränsad till oligopeptider. Metoden kan tillämpas på en mängd olika molekylära system, inklusive polära organiska föreningar, aminosyror och deras derivat, metallorganiska föreningar, oligonukleotider, och peptid-härma polymerer. Förutom att använda den trippel-kvadrupol masspektrometer, kan försöket också utföras med användning av jon-fällor och Q-TOF masspektrometrar.

Den peptid som används i detta experiment syntetiserades i vårt laboratorium med användning av standardmetod för fastfaspeptidsyntes 29-31. The Rink amidharts användes som den fasta bäraren för att ge amid-C-terminal. Fördelen med kockar kinetiska metod är att mindre föroreningar i than peptid prov påverkar inte surheten mätningarna, så länge föroreningarna inte har samma massa som peptiderna eller syror referens.

De experimentella mätningar kan kopplas med computational studier för att undersöka konformationella effekter på acidities. Computational studier ger förutsägelser om konformationerna av peptiderna som matchar deras beräknade acidities. Genom att jämföra acidities uppmätts experimentellt med de beräknade värdena, kan konformationerna av peptiderna utvärderas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inget att lämna ut.

Acknowledgments

Materials

E Colli, eV

X

1 / RT eff

Y

- [(Δ acid H - Δ acid H avg) / RT eff - Δ (Δ S) / R]

11,7 0,744 -0,728
17,6 0,700 -0,665
23,4 0,665 -0,611
29,3 0,645 -0,553
Name Company Catalog Number Comments
Mass Spectrometer Varian 1200 L and 320 L
Chloroacetic acid Sigma-Aldrich 402923
Bromoacetic acid Sigma-Aldrich B56307
Difluoroacetic acid Sigma-Aldrich 142859
Dichloroacetic acid Sigma-Aldrich D54702
Dibromoacetic acid Sigma-Aldrich 242357
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins. Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).
  2. Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide. Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).
  3. Takahashi, N., Creighton, T. E. On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin. Biochemistry. 35 (25), 8342-8353 (1996).
  4. Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. Yeast thioltransferase - the active site cysteines display differential reactivity. Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).
  5. Philipps, B., Glockshuber, R. Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).
  6. Joshi, H. V., Meier, M. S. The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate. J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).
  7. Kortemme, T., Creighton, T. E. Ionization of cysteine residues at the termini of model α-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family. J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).
  8. Gallo, E. A., Gellman, S. H. Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between α-Helical Turn and β-Turn in a Model Depsipeptide. J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).
  9. Honig, B., Nicholls, A. Classical electrostatics in biology and chemistry. Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).
  10. Warshel, A. Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins. Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).
  11. Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. Thermochemical determinations by the kinetic method. Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).
  12. Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. The kinetic method of making thermochemical determinations. J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).
  13. Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides. J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).
  14. Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers. J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).
  15. Cooks, R. G., Wong, P. S. H. Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications. Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).
  16. Armentrout, P. B. Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).
  17. Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4. J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).
  18. Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).
  19. Fersht, A. Structure and mechanism in protein science. , W.H. Freeman & Co. New York. (1999).
  20. Martin, J. L. Thioredoxin-a fold for all reasons. Structure. 3 (3), 245-250 (1995).
  21. Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).
  22. Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method. J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).
  23. Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine. J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).
  24. Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid. J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).
  25. Zheng, X., Cooks, R. G. Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction. J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).
  26. Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids. Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).
  27. Tan, J. P., Ren, J. Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).
  28. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).
  29. Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. Gutte, B. , (1995).
  30. Barany, G., Merrifield, R. B. Solid-phase peptide synthesis. The Peptides. 2, Academic Press. New York. 1-284 (1979).
  31. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Chan, W. C., White, P. D. , (2000).

Tags

Chemistry Biochemistry Molecular Biology surhetsgrad kinetisk metod sammanstötning-dissociation trippel-kvadrupol masspektrometri oligopeptider peptider masspektrometri MS
Fastställande av gasfas Acidities av Oligopeptider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ren, J., Sawhney, A., Tian, Y.,… More

Ren, J., Sawhney, A., Tian, Y., Padda, B., Batoon, P. Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides. J. Vis. Exp. (76), e4348, doi:10.3791/4348 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter