פגיעת הליזר הביא על שריר שלד עוברי דג זברה

Summary

השיטה שהוצגה כאן מהווה פגיעה המדויקת של עוברי דג זברה לחיות עם פעימות ליזר באנרגיה גבוהה ועל ניתוח בדיעבד של פגיעות אלה וההתאוששות שלהם עם זמן. אנו גם מראים איך שכותרת גנטית בודדה או קבוצות של תאי שריר שלד יכולות להיות במעקב בזמן ואחרי ניזק מושרה אור ליזר.

Abstract

גישות ניסיוניות שונות שמשו בעכבר כדי לגרום לפגיעה בשרירים במטרה ללמוד התחדשות שרירים, לרבות זריקות myotoxin (bupivacaine, cardiotoxin או notexin), השתלות שרירים (התחדשות המושרית denervation-devascularization), פעילות גופנית אינטנסיבי, אלא גם מודלי ניוון שרירי Murine כגון עכבר MDX (לסקירה של גישות אלה ראו ^1). בדג הזברה, גישה גנטית, כוללת מוטציות שמראות פנוטיפים ניוון שרירים (כגון runzel ² או sapje ³⁾ וantisense morpholinos oligonucleotide שחוסם את הביטוי של גנים הקשורים למחלת ניוון ^4. חוץ מזה, גישות כימיות גם אפשריות, למשל עם Galanthamine, acetylcholinesterase עיכוב תרכובת כימית, ובכך וכתוצאה מכך hypercontraction, שסופו של דבר מוביל לניוון שרירים ^5. גישות עם זאת, גנטיות ותרופתיות גרמוenerally משפיעים על כל השרירים בתוך אדם, ואילו את ממד הניזק שנגרם מבחינה פיזית נשלטים מרחב ובזמן ¹ בקלות רבה יותר. פגיעה פיזית מקומית מאפשרת הערכה של שריר נגדי כבקרה פנימית. ואכן, השתמש לאחרונה אבלציה תא ליזר בתיווך ללמוד התחדשות שרירי שלד בעובר דג הזברה ^6, ואילו קבוצה אחרת דיווחה לאחרונה את השימוש בשני פוטוני ליזר (822 ננומטר) לפגוע בקרום הפלזמה של שריר דג זברה עוברי בודד מאוד באופן מקומי תאים ^7.

כאן, אנו מדווחים על השימוש בשיטת micropoint הליזר (יידור טכנולוגיה) לפציעת תא שריר שלד בעובר דג הזברה. ליזר micropoint הוא ליזר באנרגיה גבוה אשר מתאימה לאבלציה תא הממוקדת באורך גל של 435 ננומטר. הליזר מחובר למיקרוסקופ (בהגדרה שלנו, מיקרוסקופ אופטי מZeiss) באופן כזה שמיקרוסקופ ניתן להשתמש באותו הזמן ואו התמקדות אור הליזר על המדגם ולדמיין את ההשפעות של הפציעה (brightfield או פלואורסצנטי). הפרמטרים לשליטת פעימות ליזר כוללים אורך גל, עצמה, ומספר הפעימות.

בשל שקיפותו והתפתחותו של עובר חיצונית, עובר דג הזברה הוא נוח מאוד לצרכי פגיעת ליזר מושרה וללימוד ההתאוששות שלאחר מכן. בין 1 ו 2 ימים לאחר הפריה, תאי שריר שלד somitic הדרגה לעבור התבגרות מקדמית לאחורי עקב התקדמות somitogenesis מהגזע עד הזנב ^{8, 9.} בשלבים אלה, עובר באופן ספונטני להתעוות וליזום שחייה. דג הזברה לאחרונה הוכר כאורגניזם מודל חוליות חשובה למחקר של התחדשות רקמות, כמו סוגים רבים של רקמות (לב, עצבים, כלי דם וכו ') יכול להיות מחדש לאחר פציעה בדג הזברה המבוגר ^{10, 11.}

Protocol

1. תיוג תאים בודדים

הזרק עוברי שלב אחד תאים עם GFP פלסמיד קידוד או כל חלבון GFP היתוך תחת השליטה של ​​אמרגן β-תקטין. במהלך פיתוח, GFP הוא אז הביע בצורת פסיפס. הנה, השתמש במבנה מהונדס Tg [β-יקטין: α-actinin-GFP], מה שמציב את חלבון היתוך α-Actinin-GFP תחת השליטה של אמרגן β-תקטין.

2. הטבעת עובר

1. לאסוף עוברי דג זברה ולשמור על תנאים נורמלים עד 28 hpf (בימוי פי ^12).
2. עוברי Dechorionate תחת stereomicroscope עם מלקחיים (דומון # 5).
3. הכן שקופית מיקרוסקופ עם טבעת ג'לי נפט.
4. הכן 10% פתרון tricaine עם מדיום E3 1% נקודת התכה נמוכה agarose /: הרתיחה 100 מ"ג agarose בפתרון E3 10 מ"ל כדי להשיג פתרון agarose הומוגנית ונוזלי; aliquot וחנותפתרון אינו בשימוש agarose ב -20 ° C לשימוש נוסף. לשימוש מיידי, תנו הפתרון המבושל להתקרר ולשמור במקסימום. 39 ° C. הוסף פתרון מניית tricaine להשיג ריכוז סופי של 10% tricaine. שניהם tricaine וagarose נחוצים כדי למנוע תנועות עובריות.
5. שבץ עובר יחיד ב1% בינוניים נמוך היתוך agarose / 10% tricaine / E3 בתוך טבעת ג'לי הנפט, עם עובר הנחת טבעית בצד; עדינות לכסות עם coverslip רק כדי לשמור את העובר במקום ולהימנע מקמור משטח שישבור את האור. באופן אידיאלי, רקמת השריר העוברית שיהיה ממוקדות צריכה לגעת coverslip.

3. עובר ליזר פציעה

1. הכן ליזר micropoint והמיקרוסקופ:
   1. אנא עיין במדריך ליזר micropoint להוראות מפורטות כיצד להגדיר ולהשתמש בליזר בשיתוף עם מיקרוסקופ.
   2. בחר הנכוןצבע עבור הדור של קרן ליזר 435 ננומטר אורך גל.
   3. התאם את עוצמת הליזר באמצעות מחוון ההנחתה. כוח הליזר צריך להיות חזק מספיק כדי לשבור משטח זכוכית עם דופק יחיד (פוקוס למשל על coverslip של המדגם שלך כדי לבדוק את זה). זה כוח הליזר נדרש לאבלציה של תאים.
2. להתמקד באזור או התא של ריבית באמצעות reticle המותקן בעינית של המיקרוסקופ. השתמש 20x אובייקטיבי (40X יאפשר פגיעה מדויקת יותר, אך לעתים קרובות מרחק העבודה הוא לא מספיק לעדשה).

הערת 1: הליזר לא רק לפגוע בתאים בתוך מטוס המיקוד, אלא גם תאים שמעל ומתחת, הנמצאים בקרן הליזר. ודא לפני הניסוי שהליזר מוגדר בצורה אופטימלית ומותאם למיקוד מקסימאלי בתוך ציר Z-. זה הכי טוב כדי לקבוע את עומק פגיעת הליזר לפני ביצוע הניסוי כדי לדעת שתאזה בדיוק להיפגע.

3. הגדר את האור הדרוש להמחשת הניסוי: brightfield לשימוש רגיל, או פלואורסצנטי אם מיקוד תא מסומן-fluorescently.
4. שלח דופק של אור ליזר לאזור הממוקד, או כמה פעימות, בהתאם לרמה הרצויה של פציעה.

4. ניתוח של פציעה והתאוששות

1. אם תרצה, את ההליך של פגיעת ליזר ניתן הוקלט בהופעה חיה (למשל באמצעות אפשרות רכישת הזרם של תוכנת Metamorph). ⁶
2. מייד לאחר פציעתו, העובר צריך להסיר בעדינות מagarose עם מלקחיים והניח חזרה למי ביצה להתאוששות.

שימו לב 2: פעילות שרירים (שחייה ומתעוות) היא חשובה במיוחד להתאוששות שרירה שלד. מאז העובר לא יכול לזוז בגלל חשיפת tricaine והטבעת agarose הנוקשה, זה לא recommended לשמור את העוברים בין שקופיות וcoverslip במשך זמן רב מדי.

3. לאחר התאוששות, העובר יכול להיות קבוע ונותח כרצוי על ידי מיקרוסקופ אור, פלואורסצנטי או confocal כפי שצוין.

Representative Results

פציעה בתיווך הליזר בוצעה על 1 עוברים משותקים בת יום. כפי שניתן לראות בתרשים 1, בכמה פעימות ליזר יכולות ליצור פצע קטן, קל לזיהוי על ידי המפותל myofibrils הפגום, תקטין העשיר שבדרך כלל מתוחים בין גבולות somite. מספר גבוה יותר של פעימות ליזר יהיה עם זאת לגרום לחסימת somite ניזוק בצורה מסיבית, שבו רוב myofibrils נהרסות. עם זאת, אנחנו יכולים ממש לראות כי "זמן מרפא את כל הפצעים", עם פציעות קטנות ריפוי מהיר יותר מאלה גדולים יותר. לאחר התאוששות, stainings יקטינו להראות שmyofibrils שוב span somite בדרך כלל, עם זאת, מידע נוסף ניתן להשיג על ידי ההכתמה לXirp1. חלבון Xirp1 הוא סמן טוב לזיהוי שבו פציעה והתאוששות שחלו, כפי שהוא מקומית ectopically יחד מתאושש myofibrils בתוך תאי שריר שנפגעו בעבר ^6.

למטרות מסוימות, זה חשוב כדי לקבוע אילו תאי exactly נפגעו עם הליזר, ולכן זה עשוי להיות שימושי גנטי לתייג תאים מסוימים (למשל על ידי הבעת חלבון ה-GFP-tagged mosaically) כדי להיות מסוגל לחזות בדיוק איזה תא הוא ממוקד ולאחר מכן להעריך האם התאים השכנים לי הושפע גם על ידי ליזר הדופק (איור 2). לאחר התאוששות ונוגדן מכתים פציעה, ניתן יהיה למצוא ולנתח את התא הממוקד שוב מודה לדפוס של תאים שכותרת mosaically המקיפים אותה.

גישה מעניינת אחת היא לעקוב באופן קבוע לאורך הזמן כיצד פגיעת ליזר בתיווך משפיעה על שרירי somitic. לשם כך, פגיעת הליזר של העובר המשותק ניתן הוקלטה בהופעה חיה כדי לראות את ההשפעות המיידיות, למשל בתוך הדקה הראשונה (איור 3). יתר על כן, הקלטות timelapse יכולות להתבצע בכל פרק זמן רצוי (5 דקות הפסקה לדוגמה), על מנת לעקוב מקרוב כיצד לארגן מחדש את התאיםבאזור הפצע.

איור 1. חומרת הפגיעה שנגרמה יכולה להשתנות במידה רבה, בהתאם למספר פעימות ליזר מיושמות. בהתאם לכך, החלמה מפציעה תמשיך בקצב שונה, אבל בסוף, רוב הפצעים סגורים. אנחנו הראינו לאחרונה שXirp1 (ירוק) הוא סמן טוב להתחדשות שרירים, שכן הוא upregulated על פציעה וlocalizes ליקטין הלא sarcomeric (אדום) של myofibrils הפגום ב32 ⁶ hpf.

איור 2. תאים שכותרתו יכולים להיות ממוקדים במיוחד (שונה מ ⁶ מס). CeLLS תויג על ידי ביטוי פסיפס של Tg [β-תקטין: α-actinin-GFP] (ירוק או בצבע אחד). תא אחד כזה היה ממוקד כאן ב 32 hpf וניזוקו קשות על ידי מספר פעימות ליזר, כפי שצוין על ידי הריח האדום. החץ הלבן מצביע על התא הפגוע; חצים צהובים מצביעים על תאים אחרים שכותרתו GFP-. התמונה מהימין נלקחה לאחר צביעת התאוששות ונוגדנים מאותו הפצע.

איור 3. רכישת זרם חייה של פגיעת ליזר מגלה כיצד משפיעה פציעת בלוק somite כולו. מונטאז' של תמונות בודדות שנרשמו בAxioplan במצב הזרם החי (כלומר כ 16 מסגרות / השני) עם דסק"ש. החץ השחור מציין היכן הליזר פוגע בשרירים בגיל 28 somitic hpf. חיצים אדומים מציינים retracting מסתיים בפגוםmyofibril. שינויים דינמיים אלה בתוך בלוק somite 1 התרחשו בתוך 2.5 שניות.

Discussion

פגיעת ליזר בתיווך היא שיטה רבה עצמה לגרימת פצעים בגודל רצוי על ידי ablating תאים כדי ללמוד התחדשות בתנאים מבוקרים בעובר דג הזברה. יש לציין, תאים יכולים להיות ממוקדים בדיוק (איור 2) והן באזור הפציעה, כמו גם העיתוי יכול להיות נשלט. כתוצאה מכך, פגיעה באתר ותהליכי התחדשות מנוטר בקלות, נרשמו (איור 3) ונותחו (איור 1). עם זאת, למרות שהליזר הוא גם התמקד ב- X וציר ה-y, הוא לא ממוקד לחלוטין בציר ה-z. דבר זה עלול לגרום לניזק לתאים הנמצאים מתחת או מעל לתאים של עניין. עם זאת, גישה זו פותחת שדה עצום של חקירות בvivo של תיקון רקמות שרירות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heating block
Pair #5 forceps	Dumont
Glass slides	Menzel		76 x 26 mm
Coverslips	Roth		50 x 24 mm #1
Petroleum jelly
Stereomicroscope	Leica		MZFLIII
Micropoint laser	Andor Technology
Fluorescence microscope	Zeiss		Axioplan II
Metamorph software	Molecular devices
Reagents Low-melting point agarose ( #50081, Lonza) Tricaine stock solution: 400 mg Tricaine (#A-5040, Sigma-Aldrich ) / 100 ml dH2O pH 9.0 E3 medium (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)