Summary
Die hier vorgestellte Methode umfasst die genaue Verletzung des Lebens Zebrafischembryonen mit hochenergetischer Laserpulse und der anschließenden Analyse dieser Verletzungen und deren Wiederherstellung mit der Zeit. Wir zeigen auch, wie genetisch markierten einzelne oder Gruppen von Skelettmuskelzellen kann während und nach der Laser-Licht induzierten Schäden verfolgt werden.
Abstract
Verschiedenen experimentellen Ansätze wurden in Maus verwendet worden, um Muskelverletzung mit dem Ziel, Muskelregeneration studieren, einschließlich myotoxin Injektionen (Bupivacain, Cardiotoxin oder notexin), Muskel Transplantationen (Denervierung-devascularization induzierte Regeneration), intensive Bewegung zu induzieren, sondern auch murine Modelle Muskeldystrophie wie der mdx-Maus (für eine Überprüfung dieser Ansätze siehe 1). Im Zebrafisch beinhalten genetische Ansätze Mutanten, die Phänotypen Muskeldystrophie (wie Runzel 2 oder sapje 3) aufweisen und Antisense-Oligonukleotid, das die Expression Morpholinos der Dystrophie-assoziierten Genen 4 blockieren. Außerdem sind chemische Ansätze auch möglich, z. B. mit Galanthamin, eine chemische Verbindung Hemmen Acetylcholinesterase, wodurch hypercontraction, die schließlich führt zu Muskeldystrophie 5. Allerdings, genetische und pharmakologische Ansätze generally betreffen alle Muskeln innerhalb eines einzelnen, während das Ausmaß der körperlich zugefügten Verletzungen leichter kontrolliert werden räumlich und zeitlich ein. Lokalisierte Körperverletzung erlaubt die Beurteilung der kontralateralen Muskel als interne Kontrolle. Tatsächlich haben wir kürzlich Laser-vermittelte Zell-Ablation zur Skelettmuskel Regeneration im Zebrafischembryo 6 studieren, während eine andere Gruppe kürzlich berichteten über die Verwendung eines Zwei-Photonen-Laser (822 nm) bis sehr lokal beschädigt Plasmamembran der einzelnen embryonalen Zebrafisch Muskel Zellen 7.
Hier berichten wir über eine Methode für die Verwendung der Mikrospitze Laser (Andor Technology) für Skelettmuskel Zellschädigung im Zebrafisch. Die Mikrospitze Laser ein Hochenergielaser die geeignet Zielzelle Ablation bei einer Wellenlänge von 435 nm ist. Der Laser ist mit einem Mikroskop verbunden (in unserem Setup, einem optischen Mikroskop von Zeiss) auf solche Weise, dass das Mikroskop gleichzeitig f genutzt werden kannoder Fokussierung des Laserlichts auf der Probe und zur Visualisierung der Auswirkungen der Verwundung (Hellfeld oder Fluoreszenz). Die Parameter zur Steuerung Laserpulse umfassen Wellenlänge, Intensität und Anzahl der Impulse.
Aufgrund seiner Transparenz und externe Embryonalentwicklung, ist die Zebrafisch-Embryos sehr zugänglich sowohl für Laser-induzierten Verletzungen und zur Untersuchung der anschließenden Erholung. Zwischen 1 und 2 Tagen nach der Befruchtung, somitic Skelettmuskelzellen fortschreitend unterziehen Reifung von anterior nach posterior durch die Progression der Somitogenese aus dem Kofferraum zum Heck 8, 9. Bei diesen Stufen, Embryonen spontan zucken und zu initiieren Schwimmen. Der Zebrafisch vor kurzem als ein wichtiges Wirbeltier Modellorganismus zur Untersuchung der Geweberegeneration erkannt worden, da viele Arten von Geweben (Herz, neuronale, vaskulären etc.) kann nach einer Verletzung im erwachsenen Zebrafisch 10, 11 regeneriert werden.
Protocol
Ein. Kennzeichnung Einzelzellen
Injizieren Eins-Zellen-Embryos mit einem Plasmid oder einem GFP GFP-Fusionsprotein unter der Kontrolle eines β-Actin-Promotor. Während der Entwicklung wird GFP dann in einem Mosaik Weise exprimiert. Hier haben wir das transgene Konstrukt Tg [β-Aktin: α-actinin-GFP], welche Orte die α-Actinin-GFP-Fusionsprotein unter der Kontrolle des β-Aktin-Promotors.
2. Embryo Embedding
- Sammle Zebrafischembryonen und pflegen unter normalen Bedingungen bis 28 hpf (Staging nach 12).
- Dechorionate Embryonen unter dem Stereomikroskop mit einer Pinzette (Dumont # 5).
- Bereiten Sie einen Objektträger mit einer Vaseline Ring.
- Eine 1% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose / 10% Tricain Lösung mit E3-Medium: 100 mg Sieden Agarose in 10 ml E3-Lösung, um eine flüssige und homogene Agarose Lösung zu erhalten; Aliquot und lagernunbenutzten Agarose-Lösung bei -20 ° C für die weitere Verwendung. Für den sofortigen Einsatz, lassen Sie die gekochte Lösung abkühlen und halten bei max. 39 ° C. Hinzufügen Tricain Stammlösung, um eine Endkonzentration von 10% Tricain erhalten. Beide Tricain und Agarose sind notwendig, um embryonale Bewegungen zu verhindern.
- Einbetten eines einzigen Embryos in 1% niedrig schmelzender Agarose / 10% Tricain / E3 Medium innerhalb der Vaseline Ring, mit der Embryo über natürlich auf der Seite; vorsichtig mit einem Deckglas abdecken, nur um den Embryo in Position zu halten und um eine konvexe vermeiden Oberfläche, die das Licht brechen würde. Idealerweise sollte der embryonalen Muskelgewebe, die gezielt werden berühren das Deckglas.
3. Embryo Laser-Verwundung
- Bereiten Sie die Mikrospitze Laser und Mikroskop:
- Bitte beachten Sie die Mikrospitze Laser Handbuch für detaillierte Anleitungen zum Einrichten und Verwenden der Laser in Verbindung mit dem Mikroskop.
- Wählen Sie den richtigenFarbstoff zur Erzeugung einer Wellenlänge 435 nm Laserstrahl.
- Passen Sie die Laserleistung durch die Dämpfung Schieberegler. Die Laserleistung sollte stark genug sein, um eine Glasoberfläche mit einem einzigen Impuls (zB Fokus auf dem Deckglas Ihrer Probe, dies zu testen) brechen. Dies ist die Laserleistung für Ablation Zelle erforderlich.
- Konzentrieren Sie sich auf die Region oder Zelle von Interesse über das Absehen in das Okular des Mikroskops eingebaut. Verwenden Sie ein 20x-Objektiv (40x wird genauer Schäden ermöglichen, aber oft der Arbeitsabstand ist nicht ausreichend für dieses Objektiv).
Anmerkung 1: Der Laser wird nicht nur schädigen Zellen innerhalb der Fokusebene, aber auch Zellen, oberhalb und unterhalb, die innerhalb des Laserstrahls sind. Stellen Sie sicher vor dem Experiment, dass der Laser optimal aufgebaut und angepasst für eine maximale Fokus innerhalb der z-Achse. Am besten ist es, um die Tiefe des Lasers Schädigung vor der Durchführung des Experiments, um zu wissen, zu bestimmen, welche Zelles genau verletzt werden.
- Richten Sie das Licht für die Visualisierung des Experiments benötigt: Hellfeld für den normalen Gebrauch oder Fluoreszenz, wenn Targeting einen fluoreszenzmarkierten Zelle.
- Senden eines Impulses von Laserlicht an die Zielregion oder mehrere Impulse, abhängig von dem gewünschten Grad der Verletzung.
4. Analyse der Verwundung und Recovery
- Falls gewünscht, kann das Verfahren der Laser-Schädigung lebenden (zB unter Verwendung des Stroms Akquisition Option des Metamorph Software). 6 aufgezeichnet werden
- Unmittelbar nach der Verletzung sollte der Embryo vorsichtig aus dem Agarose entfernt werden mit einer Pinzette und zurück in Ei Wasser für Erholung gelegt.
Anmerkung 2: Muskulös Aktivität (Schwimmen und Zuckungen) ist besonders wichtig für Skelettmuskel Erholung. Da der Embryo kann nicht wegen Tricain Exposition und der steifen Agarose Einbettung zu bewegen, ist es nicht EMPFEHLUnded die Embryonen zwischen Objektträger und Deckglas zu lange zu halten.
- Nach der Bergung kann der Embryo fixiert und analysiert werden, wie gewünscht durch Licht-, Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopie, wie angegeben.
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Representative Results
Laser-vermittelte Verletzung wurde an immobilisiertem 1 Tag alten Embryonen durchgeführt. Wie in 1 gezeigt, kann ein paar Laserimpulse erzeugen eine kleine Wunde, leicht erkennbar an der beschädigten, gedreht, Actin-reiche Myofibrillen, die normalerweise zwischen den somite Grenzen gestreckt wird. Eine höhere Anzahl von Laserpulsen wird jedoch in einem massiv geschädigt somite Block, wo die meisten Myofibrillen zerstört führen. Dennoch können wir buchstäblich beobachten, dass "Zeit alle Wunden heilt", mit kleinen Verletzungen heilen schneller als größere. Nach der Erholung zeigen Actin Färbungen, dass Myofibrillen wieder umspannen den Somiten der Regel, jedoch zusätzliche Informationen kann durch Färbung für Xirp1 gewonnen werden. Die Xirp1 Protein ein guter Marker zur Erfassung und Wiederherstellung wo Verletzung aufgetreten ist, wie es entlang ektopisch Wiedergewinnen Myofibrillen innerhalb ehemals verletzt Muskelzellen 6 lokalisiert.
Für manche Zwecke ist es wichtig, zu bestimmen, welche Zellen exactly werden mit dem Laser verletzt, daher kann es sinnvoll sein, genetisch bezeichnen einige Zellen (zB durch Exprimieren einer mosaikmäßig GFP-markierten Protein), um in der Lage, genau die Zelle bestimmt sind, und dann visualisieren zu beurteilen, ob die benachbarten Zellen wurde ebenso durch den Laserpuls (Abbildung 2) beeinflusst. Nach Verletzungen Rückgewinnung und Antikörperfärbung, wird es möglich, zu finden und zu analysieren Zielzelle erneut dank des Musters von mosaikmäßig markierten Zellen umgibt.
Ein interessanter Ansatz ist es, regelmäßig im Laufe der Zeit, wie der Laser-vermittelte Schädigung den somitic Muskeln auswirkt. Dafür kann der Laser Verletzungen des immobilisierten Embryo live aufgenommen, um die unmittelbaren Auswirkungen, z. B. in der ersten Minute (Abbildung 3) zu sehen. Weiterhin kann timelapse Aufzeichnungen mit einem beliebigen Zeitintervall (z. B. 5 min Intervall) durchgeführt werden, um genau zu verfolgen, wie die Zellen neu anordnenum die Wunde.
Abbildung 1. Die Schwere der Verletzung zugefügt kann stark variieren, abhängig von der Zahl der Laserpulse aufgebracht. Dementsprechend Erholung von Verletzungen erscheinen an Differenz Schritte gehen, aber schließlich meisten Wunden sind geschlossen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Xirp1 (grün) ein guter Marker für die Regeneration der Muskulatur ist, da es auf Verletzungen hochreguliert wird und lokalisiert nicht sarcomeric Actin (rot) von beschädigten Muskelfasern bei 32 hpf 6.
Abbildung 2. Markierten Zellen können gezielt werden (modifiziert nach Ref. 6). Cells wurden von Mosaik Ausdruck Tg mit [β-Aktin: α-actinin-GFP] (grün oder monochrom). Eine solche Zelle wurde hier bei 32 hpf gezielte und stark durch mehrere Laserpulse beschädigt, wie dies durch den roten Bolzens. Der weiße Pfeil zeigt den verletzten Zelle; gelben Pfeile zeigen andere GFP-markierten Zellen. Das Bild auf der rechten Seite wurde nach Erholung und Antikörper-Färbung von derselben Wunde genommen.
Abbildung 3. Live stream Akquisition von Laser Verletzungen zeigt, wie die Verletzung den gesamten Somiten Block beeinflusst. Montage der einzelnen Bilder auf dem Axioplan im Live-Stream-Modus (dh etwa 16 Frames / sec) mit DIC aufgezeichnet. Der schwarze Pfeil zeigt an, wo der Laser trifft somitic Muskeln bei 28 hpf. Rote Pfeile zeigen die Zurückziehen Enden eines beschädigtenMyofibrillen. Diese dynamischen Veränderungen innerhalb eines Somiten Block traten innerhalb von 2,5 Sekunden.
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Discussion
Laser-vermittelte Verletzung ist eine leistungsfähige Methode zur zuzufügen Wunden einer gewünschten Größe durch Abtragen Zellen, um die Regeneration unter kontrollierten Bedingungen in der Zebrafisch-Embryos zu studieren. Bemerkenswert ist, können die Zellen genau ausgerichtet werden (Abbildung 2) und beide die Verletzung Bereich sowie Zeitpunkt gesteuert werden kann. Anschließend werden die verletzte Stelle und Regeneration Prozesse einfach überwacht, aufgezeichnet (Abbildung 3) und analysiert (Abbildung 1). Obwohl der Laser ist in der x-und y-Achse ausgerichtet ist es nicht vollständig in der z-Achse ausgerichtet. Dies kann zu Schäden an Zellen unterhalb oder oberhalb der Zellen des Interesses. Dennoch, öffnet dieser Ansatz ein weites Feld von in vivo Untersuchungen an Muskel-Reparatur.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Bob Nowak (Andor Technology) für technische Hilfe und Beratung. SA-S. wird durch ein Heisenberg-Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt. Diese Arbeit wurde von der DFG Gewährung SE2016/7-1 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating block | |||
| Pair #5 forceps | Dumont | ||
| Glass slides | Menzel | 76 x 26 mm | |
| Coverslips | Roth | 50 x 24 mm #1 | |
| Petroleum jelly | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | |
| Micropoint laser | Andor Technology | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan II | |
| Metamorph software | Molecular devices | ||
Reagents
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References
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