Fremgangsmåten presenteres her omfatter den nøyaktige skade av levende sebrafisk embryoer med høyenergi laserpulser og den påfølgende analyse av disse skadene og deres utvinning med tid. Vi viser også hvordan genetisk merket single eller grupper av skjelett muskelceller kan spores under og etter laserlys indusert skade.
Ulike eksperimentelle tilnærminger har vært brukt i mus for å indusere muskelskade med sikte på å studere muskelregenerasjonenen, inkludert myotoxin injeksjoner (bupivacaine, Cardiotoxin eller notexin), muskel transplantasjoner (denervering-devascularization indusert gjenfødelse), intensiv trening, men også murine muskeldystrofi modeller eksempel MDX mus (for en gjennomgang av disse tilnærmingene se 1). I sebrafisk, genetiske metoder inkluderer mutanter som viser muskeldystrofi fenotyper (som runzel 2 eller sapje 3) og antisens oligonukleotid morpholinos som blokkerer uttrykk for dystrofi-tilknyttede gener 4. Dessuten, kjemiske tilnærminger er også mulig, for eksempel med Galanthamine, en kjemisk forbindelse inhibere acetylkolinesterase, og dermed resulterer i hypercontraction, som til slutt fører til muskeldystrofi 5. Men genetiske og farmakologiske tilnærminger generally påvirke alle musklene i et individ, mens omfanget av fysisk påført skader er lettere kontrolleres romlig og tidsmessig en. Lokalisert fysiske skader gjør at vurderingen av kontralaterale muskel som en intern kontroll. Faktisk har vi nylig brukte laser-mediert celle ablasjon å studere skjelettmuskelen regenerering i sebrafisk embryo 6, mens en annen gruppe nylig rapportert bruk av en to-foton laser (822 nm) til å skade meget lokalt plasmamembranen av individuelle embryonale sebrafisk muskel celler 7.
Her rapporterer vi en metode for å bruke micropoint laser (Andor Technology) for muskel-skjelettlidelser celle skade i sebrafisk embryo. Den micropoint laser er en høy energi laser som er egnet for målrettet celle ablasjon ved en bølgelengde på 435 nm. Laseren er koblet til et mikroskop (i vårt oppsett, et optisk mikroskop fra Zeiss) på en slik måte at mikroskopet kan brukes samtidig feller fokusere laserlys på prøven og for å visualisere effekten av sårene (lysfelt eller fluorescens). Parametrene for kontrollere laserpulser inkluderer bølgelengde, intensitet og antall pulser.
På grunn av sin åpenhet og eksterne embryoutvikling, er sebrafisk embryo svært mottagelig for både laser-indusert skade og for å studere den påfølgende utvinning. Mellom 1 og 2 dager etter befruktning, somitic skjelettmuskel celler progressivt gjennomgå modning fra anteriort for posteriore grunnet utviklingen av somitogenesen fra stammen til de 8 halen, 9. På disse trinnene, embryo spontant rykk og initiere svømming. Sebrafisk har nylig blitt anerkjent som en viktig virveldyr modell organisme for studiet av vev gjenfødelse, som mange typer vev (hjerte, neuronal, vaskulær etc.) kan regenereres etter skade i voksen 10 sebrafisk, 11.
Laser-mediert skade er en kraftig metode for å påføre sår ønsket størrelse ved ablating celler for å studere regenerering under kontrollerte forhold i sebrafisk embryo. Spesielt, kan cellene være målrettet presist (figur 2), og begge skaden området samt timing kan kontrolleres. Deretter blir skaden nettstedet og fornyelsesprosesser lett overvåkes, fart (fig. 3) og analyseres (figur 1). Imidlertid, selv om laseren er godt fokusert i x-og y-aksen, er det ikke f…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Bob Nowak (Andor Technology) for teknisk hjelp og råd. SA-S. støttes av en Heisenberg fellesskap av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Dette arbeidet ble støttet av DFG stipend SE2016/7-1.
Heating block | |||
Pair #5 forceps | Dumont | ||
Glass slides | Menzel | 76 x 26 mm | |
Coverslips | Roth | 50 x 24 mm #1 | |
Petroleum jelly | |||
Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | |
Micropoint laser | Andor Technology | ||
Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan II | |
Metamorph software | Molecular devices | ||
Reagents
|