Laser-vållad skada av Zebrafish embryonala skelettmuskulatur

Summary

Den metod som presenteras här omfattar exakta skada levande zebrafisk embryon med hög energi laserpulser och efterföljande analys av dessa skador och deras återhämtning med tiden. Vi visar också hur genetiskt märkta enstaka eller grupper av skelettmuskelceller kan spåras under och efter laserljus inducerad skada.

Abstract

Olika experimentella metoder har använts i musen för att framkalla muskelskada i syfte att studera muskler förnyelse, inklusive myotoxin injektioner (bupivakain, cardiotoxin eller notexin), transplantationer muskler (denervering-devascularization inducerad regenerering), intensiv träning, men också murina muskeldystrofi modeller såsom MDX musen (för en genomgång av dessa metoder se ^1). I zebrafisk, genetiska tillvägagångssätt inkluderar mutanter som uppvisar muskeldystrofi fenotyper (t.ex. runzel ² eller sapje ³⁾ och antisens oligonukleotid morpholinos som blockerar uttrycket av dystrofi-associerade gener ^4. Dessutom, kemiska metoder är också möjliga, t ex med Galantamin, en kemisk förening som inhiberar acetylkolinesteras, vilket resulterar i hypercontraction, vilket slutligen leder till muskeldystrofi ^5. Men genetiska och farmakologiska metoder generally påverkar alla muskler i en individ, medan omfattningen av fysiskt förorsakat skador lättare att kontrollera rumsligt och tidsmässigt ^1. Lokaliserad fysiska skador möjligt att bedöma om kontralaterala muskeln som en intern kontroll. Faktiskt använde vi nyligen laser-medierad cell-ablation för att studera skelettmuskulaturen regenerering i zebrafisk embryot ^6, medan en annan grupp nyligen rapporterat användningen av en två-foton laser (822 nm) för att skada mycket lokalt plasmamembranet enskilda embryonala zebrafisk muskel celler ^7.

Här rapporterar vi ett förfarande för användning av micropoint lasern (Andor Technology) för skelettmuskulatur cellskada i zebrafisk embryot. Den micropoint laser är en hög energi laser som är lämplig för målsökt cell ablation vid en våglängd av 435 nm. Lasern är ansluten till ett mikroskop (i vår inställning, ett optiskt mikroskop från Zeiss) på ett sådant sätt att mikroskopet kan användas samtidigt feller fokusera laserljuset mot provet och för att visualisera effekterna av sårskada (ljusfält eller fluorescens). Parametrarna för styrning laserpulser inkluderar våglängd, intensitet och antalet pulser.

På grund av dess öppenhet och extern embryonal utveckling är zebrafisk embryot mycket mottaglig för både laser-inducerad skada och för att studera den efterföljande återhämtningen. Mellan 1 och 2 dagar efter gödsling, somitic skelettmuskelceller genomgår successivt mognad från främre till posterior grund av utvecklingen av somitogenesis från stammen till svansen ^{8, 9.} Vid dessa stadier, embryon rycka spontant och initiera simning. Zebrafisk har nyligen erkänts som en viktig ryggradsdjur modellorganism för att studera vävnadsregenerering, eftersom många typer av vävnader (hjärt-, neuronal, vaskulär etc.) kan regenereras efter skada i den vuxna zebrafisk ^{10, 11.}

Protocol

1. Märkning enskilda celler

Injicera en-cellstadiet embryon med en plasmid som kodar GFP eller någon GFP-fusionsprotein under kontroll av en β-aktin-promotorn. Under utvecklingen, är GFP uttrycks sedan i en mosaik sätt. Här har vi använt den transgena konstruktionen Tg [β-aktin: α-aktinin-GFP], vilket placerar α-aktinin-GFP fusionsprotein under kontroll av β-aktinpromotorn.

2. Embryo Inbäddning

1. Samla zebrafisk embryon och underhålla under normala förhållanden förrän 28 HPF (stadieindelning enligt ^12).
2. Dechorionate embryon i stereomikroskop med pincett (Dumont # 5).
3. Förbered ett objektglas med vaselin ring.
4. Bered en 1% låg-smältpunkt agaros / 10% tricaine lösning med E3-medium: koka 100 mg agaros i 10 ml E3 lösning för att erhålla en vätska och homogen agaroslösning, alikvot och lagraoanvänd agaroslösning vid -20 ° C för vidare användning. För omedelbar användning, låt kokt lösningen svalna och underhålla vid max. 39 ° C. Lägg tricaine stamlösning för att erhålla en slutlig koncentration av 10% tricaine. Både tricaine och agaros är nödvändiga för att förhindra embryonala rörelser.
5. Bädda in en enda embryo i 1% lågsmältande agaros / 10% tricaine / E3-medium i vaselin ringen, med embryot om naturligt på sidan, försiktigt täcka med ett täckglas bara för att hålla embryot på plats och för att undvika en konvex yta som skulle bryta ljus. Helst ska den embryonala muskelvävnad som kommer att riktas vidrör täckglaset.

3. Embryo Laser sårskada

1. Förbered micropoint laser och mikroskopet:
   1. Se till micropoint laser manualen för detaljerade instruktioner om hur du ställer in och använder laser i samband med mikroskop.
   2. Välj rättfärgämne för generering av en 435 nm våglängd laserstråle.
   3. Justera lasern strömmen med dämpning reglaget. Lasereffekten bör vara stark nog för att bryta en glasyta med en enda puls (t.ex. fokus på täckglaset på ditt prov för att testa detta). Detta är den lasereffekt som krävs för cell-ablation.
2. Fokus på området eller cellen av intresse med användning hårkorset installerad i den okulära av mikroskopet. Använd en 20x objektiv (40x kommer att ge mer precisa skada, men ofta arbetsavståndet inte är tillräcklig för det här objektivet).

Anmärkning 1: Lasern kommer inte bara skadar celler i fokus planet, men också celler ovanför och under som finns inom laserstrålen. Se innan experimentet att lasern optimalt inrättat och justerat för en maximal fokus inom z-axeln. Det är bäst att bestämma djupet av laser skada innan utför experimentet för att veta vilken cellär precis kommer att skadas.

3. Ställ in ljuset som behövs för att visualisera experimentet: ljusfält för normal användning, eller fluorescens vid inriktning en fluorescensmärkt cellen.
4. Sänd en puls av laserljus till målregionen, eller flera pulser, beroende på den önskade graden av skada.

4. Analys av sårbildning och återställning

1. Om så önskas, kan förfarandet av laser skada registreras direkt (t.ex. genom att använda alternativet strömmen förvärvet av Metamorph programvara). ⁶
2. Omedelbart efter sårskada, bör embryot tas bort försiktigt från agarosen med pincett och placeras tillbaka i ägg vatten för återvinning.

Not 2: muskelaktivitet (simning och ryckningar) är särskilt viktigt för skelettmuskulatur återhämtning. Eftersom embryot inte kan flytta på grund av tricaine exponering och styva agaros inbäddning, är det inte REKOMMEnded att hålla embryon mellan bild och täckglas för länge.

3. Efter återhämtning, kan embryot fixeras och analyseras såsom önskas genom ljus-, fluorescens-eller konfokalt mikroskop som anges.

Representative Results

Laser-medierad skada utfördes på immobiliserade 1 dagar gamla embryon. Såsom visas i figur 1, kan ett par laserpulser genererar ett litet sår, lätt identifieras av de skadade, lindade, aktin-rika myofibriller som normalt sträckta mellan somit gränser. Ett större antal laserpulser kommer dock att resultera i en kraftigt skadad somit blocket, där de flesta myofibriller förstörs. Ändå kan vi konstatera bokstavligen att "tiden läker alla sår", med små skador healing snabbare än större. Efter återhämtning, aktin färgningar visar att myofibriller igen spänner över somit normalt, men kan ytterligare information fås genom färgning för Xirp1. Den Xirp1 proteinet är en bra markör för att upptäcka där skada och återhämtning har skett, eftersom det ektopiskt lokaliserad längs återhämta myofibriller inom tidigare skadade muskelceller ^6.

För vissa ändamål är det viktigt att avgöra vilka celler exactly skadas med lasern, och därför kan det vara bra att genetiskt märka vissa celler (t.ex. genom mosaically uttrycker en GFP-märkt protein) för att kunna visualisera exakt vilken cell är riktad och därefter bedöma om dess angränsande celler har påverkats liksom av laserpulsen (figur 2). Efter skada återhämtning och antikropp färgning blir det möjligt att hitta och analysera målcellen igen tack vare mönstret av mosaically märkta celler som omger den.

En intressant metod är att regelbundet övervaka tiden hur laser-medierad skada påverkar somitic muskeln. För detta kan lasern skada den immobiliserade embryot in live att se de omedelbara effekterna, t.ex. inom den första minuten (Figur 3). Vidare kan timelapse inspelningar utföras med vilken som helst önskad tidsintervall (t.ex. 5 min intervall), i syfte att noggrant följa hur cellerna ordnarunt såret.

Figur 1. Svårighetsgraden av vållad skada kan variera kraftigt, beroende på antalet laser används pulser. Följaktligen kommer återhämtningen från skada fortsätta på skillnaden steg, men så småningom är de flesta sår stängda. Vi har nyligen visat att Xirp1 (grön) är en bra markör för muskel regenerering, eftersom det uppregleras vid skada och lokaliserar till icke-sarkomeriskt aktin (rött) av skadade myofibriller vid 32 HPF ^6.

Figur 2. Märkta celler kan specifikt riktade (modifierad från ref ^6). CeLLS märktes genom mosaik uttryck av Tg [β-aktin: α-aktinin-GFP] (grön eller monokrom). En sådan cell riktade här på 32 HPF och allvarligt skadas av flera laserpulser, såsom indikeras av den röda bulten. Den vita pilen indikerar den skadade cellen, gula pilar indikerar andra GFP-märkta celler. Bilden till höger togs efter återvinning och antikropp färgning av samma såret.

Figur 3. Live stream förvärv av laser skada avslöjar hur skadan påverkar hela somit blocket. Montage av enstaka bilder som spelats in på Axioplan i live stream läge (dvs. ca 16 bilder / sek) med DIC. Den svarta pilen visar var lasern träffar somitic muskeln vid 28 HPF. Röda pilar indikerar indragning ändarna på en skadadmyofibril. Dessa dynamiska förändringar inom en somit kvarter inträffade inom 2,5 sek.

Discussion

Laser-medierad skada är en kraftfull metod för att tillfoga sår av en önskad storlek genom ablation celler för att studera regenerering under kontrollerade förhållanden i zebrafisk embryot. Noterbart kan celler riktas exakt (figur 2) och både skadan området samt timing kan styras. Därefter skadan webbplats och för att återhämta sig lätt övervakas, registreras (Figur 3) och analyserades (figur 1). Även lasern fokuserade i x-och y-axeln, är det inte helt fokuserad i z-axeln. Detta kan orsaka skada på celler belägna under eller ovanför cellerna av intresse. Ändå öppnar detta synsätt upp ett stort fält av in vivo undersökningar av muskel reparation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heating block
Pair #5 forceps	Dumont
Glass slides	Menzel		76 x 26 mm
Coverslips	Roth		50 x 24 mm #1
Petroleum jelly
Stereomicroscope	Leica		MZFLIII
Micropoint laser	Andor Technology
Fluorescence microscope	Zeiss		Axioplan II
Metamorph software	Molecular devices
Reagents Low-melting point agarose ( #50081, Lonza) Tricaine stock solution: 400 mg Tricaine (#A-5040, Sigma-Aldrich ) / 100 ml dH2O pH 9.0 E3 medium (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)