Summary
La méthode présentée ici comprend la blessure précise des embryons de poisson zèbre en direct avec des impulsions laser de haute énergie et l'analyse subséquente de ces blessures et leur récupération avec le temps. Nous montrons aussi comment génétiquement étiquetés simple ou groupes de cellules musculaires squelettiques peuvent être suivis pendant et après la lumière laser dommages induits.
Abstract
Diverses approches expérimentales ont été utilisées dans la souris pour induire une lésion musculaire dans le but d'étudier la régénération des muscles, y compris les injections myotoxine (bupivacaïne, cardiotoxine ou notexin), les transplantations musculaires (dénervation-dévascularisation régénération induite), l'exercice intensif, mais aussi des modèles murins atteints de dystrophie musculaire tels que la souris mdx (pour une revue de ces approches voir 1). Chez le poisson zèbre, les approches génétiques comprennent des mutants qui présentent des phénotypes dystrophie musculaire (tels que runzel 2 ou sapje 3) et antisens morpholinos oligonucléotidiques qui bloquent l'expression des gènes associés à la dystrophie 4. En outre, les approches chimiques sont également possibles, par exemple avec galanthamine, une inhibition de l'acétylcholinestérase composé chimique, ce qui entraîne hypercontraction, ce qui conduit finalement à la dystrophie musculaire 5. Approches Cependant, génétiques et pharmacologiques généralement affecter tous les muscles dans un individu, alors que la gravité des blessures infligées sont physiquement plus facile à contrôler spatialement et temporellement 1. Localisée blessure physique permet l'évaluation de muscle controlatéral comme contrôle interne. En effet, nous avons récemment utilisé laser médiée par ablation cellulaire pour étudier la régénération du muscle squelettique chez l'embryon de poisson zèbre 6, tandis qu'un autre groupe a récemment rapporté l'utilisation d'un laser à deux photons (822 nm) à des dommages très localement la membrane plasmique du muscle du poisson zèbre individu embryonnaire cellules 7.
Ici, nous présentons une méthode pour utiliser le laser micropoint (Andor Technology) pour une lésion musculaire squelettique cellulaire dans l'embryon de poisson zèbre. Le laser à micropointes est un laser à haute énergie, qui est adapté pour l'ablation de cellules ciblée à une longueur d'onde de 435 nm. Le laser est relié à un microscope (dans notre configuration, à partir d'un microscope optique Zeiss) de telle sorte que le microscope peut être utilisé à la fois fou focaliser la lumière laser sur l'échantillon et pour visualiser les effets de la blessure (fond clair ou fluorescence). Les paramètres de commande comprennent des impulsions laser de longueur d'onde, de l'intensité et du nombre d'impulsions.
En raison de sa transparence et externes du développement embryonnaire, l'embryon du poisson zèbre se prête très bien à la fois induite par laser blessures et pour l'étude de la reprise ultérieure. Entre 1 et 2 jours post-fécondation, les cellules musculaires squelettiques somitiques subir une maturation progressive d'avant en arrière en raison de la progression de somitogenèse du tronc à la queue 8, 9. A ces stades, les embryons se contracter spontanément et de lancer la natation. Le poisson-zèbre a récemment été reconnue comme un organisme modèle vertébré important pour l'étude de la régénération des tissus, comme de nombreux types de tissus (cardiaques, neuronales, vasculaires, etc) peuvent être régénérés après une blessure chez l'adulte poisson zèbre 10, 11.
Protocol
1. Étiquetage cellules isolées
Injecter embryons au stade une cellule-avec un plasmide codant pour la GFP ou de toute protéine de fusion GFP-sous le contrôle d'un promoteur β-actine. Au cours du développement, la GFP est alors exprimée d'une façon mosaïque. Ici, nous avons utilisé la construction transgénique Tg [β-actine: α-actinine-GFP], ce qui place la protéine de fusion α-actinine-GFP sous le contrôle du promoteur β-actine.
2. Embedding embryon
- Recueillir des embryons de poisson zèbre et de maintenir dans des conditions normales jusqu'au 28 hpf (mise en scène d'après 12).
- Embryons Dechorionate sous le stéréomicroscope avec une pince (Dumont # 5).
- Préparer une lame de microscope avec un anneau de gelée de pétrole.
- Préparer un 1% à bas point de fusion d'agarose / 10% tricaïne solution avec un milieu E3: faire bouillir 100 mg d'agarose dans 10 ml E3 solution pour obtenir un liquide homogène et la solution d'agarose, et aliquote magasinutilisé solution d'agarose à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. Pour une utilisation immédiate, laisser la solution bouillie refroidir et conserver au max. 39 ° C. Ajouter la solution mère tricaïne pour obtenir une concentration finale de 10% tricaïne. Les deux tricaïne et d'agarose sont nécessaires pour empêcher des mouvements embryonnaires.
- Intégrer un seul embryon à 1% d'agarose à faible point de fusion / 10% tricaïne / E3 moyenne dans l'anneau de la vaseline, de l'embryon pose naturellement sur le côté, couvrir soigneusement avec une lamelle juste pour maintenir l'embryon en place et d'éviter un convexe surface qui briserait la lumière. Idéalement, le tissu musculaire embryonnaire qui seront ciblés devraient toucher la lamelle.
3. Embryon laser blessures
- Préparer le laser micropoint et le microscope:
- S'il vous plaît se référer au manuel micropoint laser pour obtenir des instructions détaillées sur la façon de configurer et d'utiliser le laser en collaboration avec le microscope.
- Sélectionnez le bonColorant pour la génération d'un faisceau laser de longueur d'onde 435 nm.
- Réglez la puissance du laser en utilisant le curseur d'atténuation. La puissance du laser doit être assez fort pour briser une vitre avec une seule impulsion (mise au point, par exemple sur la lamelle de l'échantillon à tester cette). C'est la puissance du laser nécessaire pour l'ablation de cellules.
- Concentrer sur la région d'intérêt ou d'une cellule à l'aide du réticule installé dans l'oculaire du microscope. Utilisez un objectif 20x (40x permettra dommages plus précis, mais souvent la distance de travail ne suffit pas pour cet objectif).
Note 1: Le laser ne sera pas seulement de blesser les cellules dans le plan focal, mais aussi des cellules au-dessus et au-dessous qui sont dans le faisceau laser. Assurez-vous avant l'expérience que le laser est parfaitement monté et ajusté pour une mise au point maximale dans l'axe z. Il est préférable de déterminer la profondeur de la blessure au laser avant d'effectuer le test afin de savoir quelle celluleC'est exactement seront blessés.
- Mettre en place la lumière nécessaire à la visualisation de l'expérience: fond clair pour une utilisation normale, ou de fluorescence si le ciblage d'une cellule marquée par fluorescence.
- Envoyer une impulsion de lumière laser à la zone cible, ou de plusieurs impulsions, en fonction du degré souhaité de blessure.
4. Analyse des Traumatismes et de récupération
- Si vous le souhaitez, la procédure de blessure laser peut être enregistré en direct (par exemple, en utilisant l'option d'acquisition flux du logiciel Metamorph) 6.
- Immédiatement après la blessure, l'embryon doit être enlevé doucement de l'agarose avec une pince et replacée dans l'eau d'œuf pour la récupération.
Note 2: L'activité musculaire (natation et tics) est particulièrement important pour la récupération des muscles squelettiques. Depuis l'embryon ne peut pas bouger à cause de l'exposition tricaïne et l'ancrage rigide agarose, il n'est pas recommended pour maintenir les embryons entre lame et lamelle trop longtemps.
- Après récupération, les embryons peuvent être fixées et analysées comme souhaité par la lumière, la microscopie à fluorescence confocale, ou comme il est indiqué.
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Representative Results
Blessures laser à médiation a été réalisée sur immobilisées 1 jour embryons âgés. Comme le montre la figure 1, un peu impulsions laser peut générer une petite plaie, facilement reconnaissable par les endommagés, enroulés, actine riches en myofibrilles qui sont normalement tendus entre les limites de somites. Un plus grand nombre d'impulsions laser va cependant conduire à un bloc somite gravement endommagés, où la plupart des myofibrilles sont détruits. Néanmoins, nous pouvons littéralement observer que «le temps guérit toutes les blessures", avec les petites blessures de guérison plus rapide que les grandes. Après la récupération, colorations actine montrent que myofibrilles à nouveau s'étendre sur le somite normalement, mais des informations complémentaires peuvent être obtenues par coloration pour Xirp1. La protéine Xirp1 est un bon marqueur pour détecter lorsque des blessures et la récupération ont eu lieu, comme il est ectopique localisée le long de la récupération de myofibrilles dans les cellules musculaires autrefois blessés 6.
Pour certaines applications, il est important de déterminer quelles cellules exactly sont blessés au laser, par conséquent, il pourrait être utile de marquer génétiquement certaines cellules (par exemple mosaically exprimant une protéine GFP-étiqueté) afin d'être en mesure de visualiser précisément la cellule qui est ciblé, puis d'évaluer si ses cellules voisines ont été affectée aussi bien par l'impulsion laser (Figure 2). Après la lésion et la récupération d'anticorps coloration, il devient possible de trouver et analyser à nouveau la cellule cible, grâce à l'agencement de cellules mosaically marqués qui l'entourent.
Une approche intéressante consiste à surveiller régulièrement au fil du temps comment la blessure laser à médiation affecte le muscle somitique. Pour ce faire, la blessure au laser de l'embryon immobilisé peut être enregistré en live pour voir les effets immédiats, par exemple, dans la première minute (figure 3). En outre, les enregistrements timelapse peut être effectuée avec n'importe quel intervalle de temps souhaité (par exemple 5 min d'intervalle), afin de suivre de près la façon dont les cellules réorganiserautour de la plaie.
Figure 1. La gravité de la blessure infligée peut varier considérablement, en fonction du nombre d'impulsions laser appliquée. Par conséquent, la récupération d'une blessure procédera à des rythmes de différence, mais par la suite, la plupart des blessures se referment. Nous avons récemment montré que Xirp1 (vert) est un bon marqueur pour la régénération musculaire, car elle est régulée à la hausse sur les blessures et se localise à la non-sarcomérique actine (rouge) de myofibrilles endommagés à 32 hpf 6.
Figure 2. Les cellules marquées peuvent être spécifiquement ciblées (modifié d'après Ref 6). Cells ont été marqués par l'expression mosaïque de Tg [β-actine: α-actinine-GFP] (vert ou noir et blanc). Une telle cellule a été la cible ici au 32 hpf et gravement endommagé par plusieurs impulsions laser, comme indiqué par le boulon rouge. La flèche blanche indique la cellule lésée; flèches jaunes indiquent d'autres cellules GFP-marqués. L'image de droite a été prise après coloration de récupération et d'anticorps de la même blessure.
Figure 3. Acquisition flux en direct de blessure laser révèle comment la blessure affecte le bloc somite entier. Montage des images individuelles enregistrées à la Axioplan en mode live stream (soit environ 16 images / sec) avec DIC. La flèche noire indique l'endroit où le laser frappe le muscle somitique à 28 hpf. Les flèches rouges indiquent la rétraction des extrémités d'une endommagémyofibrille. Ces changements dynamiques au sein d'un bloc somite eu lieu à moins de 2,5 sec.
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Discussion
Laser à médiation blessure est une méthode puissante pour infliger des blessures d'une taille désirée par l'ablation des cellules afin d'étudier la régénération dans des conditions contrôlées dans l'embryon de poisson zèbre. Notamment, les cellules peuvent être ciblées avec précision (figure 2) et à la fois le domaine des blessures ainsi que le calendrier peut être commandé. Par la suite, le site de la lésion et les processus de régénération sont facilement contrôlées, enregistrées (figure 3) et analysées (figure 1). Toutefois, bien que le laser est bien centré dans le plan x-y et de l'axe, il n'est pas complètement concentré dans l'axe z. Cela peut causer des dommages aux cellules situées en dessous ou au-dessus des cellules d'intérêt. Néanmoins, cette approche ouvre un vaste champ d'investigations in vivo de la réparation des muscles.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Bob Nowak (Andor Technology) de l'aide et des conseils techniques. SA-S. est soutenu par une bourse de Heisenberg de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Ce travail a été soutenu par la DFG subvention SE2016/7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating block | |||
| Pair #5 forceps | Dumont | ||
| Glass slides | Menzel | 76 x 26 mm | |
| Coverslips | Roth | 50 x 24 mm #1 | |
| Petroleum jelly | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | |
| Micropoint laser | Andor Technology | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan II | |
| Metamorph software | Molecular devices | ||
Reagents
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References
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