Laser-påført skade av Sebrafisk Embryonic skjelettmuskulatur

Summary

Fremgangsmåten presenteres her omfatter den nøyaktige skade av levende sebrafisk embryoer med høyenergi laserpulser og den påfølgende analyse av disse skadene og deres utvinning med tid. Vi viser også hvordan genetisk merket single eller grupper av skjelett muskelceller kan spores under og etter laserlys indusert skade.

Abstract

Ulike eksperimentelle tilnærminger har vært brukt i mus for å indusere muskelskade med sikte på å studere muskelregenerasjonenen, inkludert myotoxin injeksjoner (bupivacaine, Cardiotoxin eller notexin), muskel transplantasjoner (denervering-devascularization indusert gjenfødelse), intensiv trening, men også murine muskeldystrofi modeller eksempel MDX mus (for en gjennomgang av disse tilnærmingene se ^1). I sebrafisk, genetiske metoder inkluderer mutanter som viser muskeldystrofi fenotyper (som runzel ² eller sapje ³⁾ og antisens oligonukleotid morpholinos som blokkerer uttrykk for dystrofi-tilknyttede gener ^4. Dessuten, kjemiske tilnærminger er også mulig, for eksempel med Galanthamine, en kjemisk forbindelse inhibere acetylkolinesterase, og dermed resulterer i hypercontraction, som til slutt fører til muskeldystrofi ^5. Men genetiske og farmakologiske tilnærminger generally påvirke alle musklene i et individ, mens omfanget av fysisk påført skader er lettere kontrolleres romlig og tidsmessig ^en. Lokalisert fysiske skader gjør at vurderingen av kontralaterale muskel som en intern kontroll. Faktisk har vi nylig brukte laser-mediert celle ablasjon å studere skjelettmuskelen regenerering i sebrafisk embryo ^6, mens en annen gruppe nylig rapportert bruk av en to-foton laser (822 nm) til å skade meget lokalt plasmamembranen av individuelle embryonale sebrafisk muskel celler ^7.

Her rapporterer vi en metode for å bruke micropoint laser (Andor Technology) for muskel-skjelettlidelser celle skade i sebrafisk embryo. Den micropoint laser er en høy energi laser som er egnet for målrettet celle ablasjon ved en bølgelengde på 435 nm. Laseren er koblet til et mikroskop (i vårt oppsett, et optisk mikroskop fra Zeiss) på en slik måte at mikroskopet kan brukes samtidig feller fokusere laserlys på prøven og for å visualisere effekten av sårene (lysfelt eller fluorescens). Parametrene for kontrollere laserpulser inkluderer bølgelengde, intensitet og antall pulser.

På grunn av sin åpenhet og eksterne embryoutvikling, er sebrafisk embryo svært mottagelig for både laser-indusert skade og for å studere den påfølgende utvinning. Mellom 1 og 2 dager etter befruktning, somitic skjelettmuskel celler progressivt gjennomgå modning fra anteriort for posteriore grunnet utviklingen av somitogenesen fra stammen til de ^{8 halen, 9.} På disse trinnene, embryo spontant rykk og initiere svømming. Sebrafisk har nylig blitt anerkjent som en viktig virveldyr modell organisme for studiet av vev gjenfødelse, som mange typer vev (hjerte, neuronal, vaskulær etc.) kan regenereres etter skade i voksen ^{10 sebrafisk, 11.}

Protocol

1. Merking enkeltceller

Injisere en-celle stadiet embryoer med et plasmid som koder GFP eller GFP-fusjonsprotein under kontroll av en β-Actin promotor. Under utviklingen er GFP deretter uttrykt i en mosaikk mote. Her, vi brukte transgene konstruktet Tg [β-aktin: α-actinin-GFP], som plasserer α-Actinin-GFP fusjonsprotein under kontroll av β-aktin promoter.

2. Embryo Embedding

1. Samle sebrafisk embryoer og vedlikeholde under normale forhold til 28 HPF (staging henhold til ^12).
2. Dechorionate embryoer under stereomikroskop med tang (Dumont # 5).
3. Forbered et objektglass med en vaselin ring.
4. Forberede en 1% lavtsmeltende agarose punkt / 10% løsning med Tricaine E3 medium: koke 100 mg agarose i 10 ml E3 løsning for å oppnå en flytende og homogen agarose løsning; alikvot og lagreubrukt agarose løsning ved -20 ° C for videre bruk. For umiddelbar bruk, la kokt løsningen avkjøles og vedlikeholde ved maks. 39 ° C. Legg Tricaine stamoppløsning for å oppnå en endelig konsentrasjon på 10% Tricaine. Både Tricaine og agarose er nødvendig for å hindre embryonale bevegelser.
5. Bygge inn en enkelt embryo i 1% lavtsmeltende agarose / 10% Tricaine / E3 medium innenfor vaselin ringen, med embryoet legging naturlig på siden; forsiktig dekke med et dekkglass bare for å opprettholde embryoet på plass og for å unngå en konveks overflate som ville bryte lyset. Ideelt sett bør embryonale muskelvev som vil være målrettet berøre dekkglasset.

3. Embryo Laser-såret

1. Klargjør micropoint laser og mikroskop:
   1. Vennligst referer til micropoint laser manualen for detaljerte instruksjoner om hvordan du setter opp og bruker laser i forbindelse med mikroskop.
   2. Velg riktigfargestoff for generering av en 435 nm bølgelengde laserstråle.
   3. Juster lasereffekten ved hjelp demping glidebryteren. Lasereffekten skal være sterk nok til å bryte et glass overflate med en enkelt puls (f.eks fokus på dekkglasset på prøve for å teste dette). Dette er lasereffekten nødvendig for celle ablasjon.
2. Fokus på regionen eller celle av interesse å bruke reticle installert i okulær av mikroskopet. Bruk en 20x objektiv (40x vil gi en mer presis skade, men ofte arbeidsavstanden er ikke tilstrekkelig for dette objektivet).

Note 1: Laseren vil ikke bare skade celler i fokusplanet, men også celler over og under som er innenfor laserstrålen. Kontroller før eksperimentet at laseren er optimalt satt opp og justert for en maksimal fokus i z-aksen. Det er best å bestemme dybden av laser skade før utfører eksperimentet for å vite hvilken celles nøyaktig vil bli skadet.

3. Sett opp lys som trengs for å visualisere eksperimentet: lysfelt for normal bruk, eller fluorescens hvis målrettet mot et fluorescently-merket celle.
4. Sende en puls av laserlys til målrettet region, eller flere pulser, avhengig av den ønskede grad av skade.

4. Analyse av såret og Recovery

1. Om ønskelig kan fremgangsmåten av laser skade føres levende (f.eks ved hjelp av strømmen kjøpet alternativet i MetaMorph programvare). ⁶
2. Umiddelbart etter såret, bør embryoet fjernes forsiktig fra agarosen med pinsett og plassert tilbake i eggevannet for utvinning.

Note 2: Kraftig aktivitet (svømming og rykninger) er spesielt viktig for muskel-skjelettlidelser utvinning. Siden embryo ikke kan flytte på grunn av Tricaine eksponering og stiv agarose innebygging, er det ikke recommended å opprettholde embryoene mellom lysbilde og dekkglass for lenge.

3. Etter utvinning, kan embryoet være fast og analyseres som ønsket av lys-, fluorescens-eller konfokalmikroskopi som angitt.

Representative Results

Laser-mediert skade ble utført på immobilisert en dag gamle embryoer. Som vist i figur 1, kan et par laserpulser generere et lite sår, lett gjenkjennelig ved de skadede, kveilet, Actin-rike myofibrils som normalt strukket mellom somitt grenser. Et høyere antall laser pulser vil imidlertid føre til et massivt skadet somitt blokk, der de fleste myofibrils er ødelagt. Likevel kan vi bokstavelig talt observere at "tiden leger alle sår", med små skader healing raskere enn større. Etter gjenoppretting Actin stainings viser at myofibrils igjen span somitt normalt, men kan tilleggsinformasjon oppnås ved farging for Xirp1. Den Xirp1 protein er en god markør for påvisning hvor skade og gjenvinning har oppstått, som det er ectopically lokalisert langs utvinne myofibrils innenfor tidligere skadde muskelceller ^6.

For noen formål er det viktig å bestemme hvilke celler som exactly er skadet med laseren, og derfor kan det være nyttig å genetisk merke noen celler (for eksempel ved mosaically uttrykker en GFP-merket protein) for å være i stand til å visualisere hvilke celle er rettet og deretter for å vurdere om sine nabocellene har blitt påvirket, så vel ved laserpulsen (figur 2). Etter skade utvinning og antistoffarging, blir det mulig å finne og analysere målrettet celle igjen takket være mønster av mosaically merkede celler som omgir den.

En interessant tilnærming er å overvåke regelmessig over tid hvordan laser-mediert skade påvirker somitic muskel. For dette, kan laseren skade av den immobiliserte embryoet registreres live til se de umiddelbare effekter, for eksempel innenfor de første øyeblikk (fig. 3). Videre kan timelapse innspillinger utføres med hvilken som helst ønsket tidsintervall (f.eks 5 min intervall), for å følge nøye hvordan cellene omorganisererundt såret.

Figur 1. Alvorlighetsgraden av skaden påført kan variere sterkt, avhengig av hvor mange laser pulser anvendt. Følgelig vil utvinning fra skade fortsette på forskjellen skritt, men til slutt er de fleste sår lukket. Vi har nylig vist at Xirp1 (grønn) er en god markør for muskel regenerasjon, siden det er oppregulert på skade og lokaliserer til ikke-sarcomeric Actin (rød) av skadede myofibrils ved 32 HPF ^6.

Figur 2. Merkede celler kan være spesielt målrettet (modifisert fra Ref ^6). CeLLS ble merket av mosaikk uttrykk for Tg [β-actin: α-actinin-GFP] (grønn eller svart-hvitt). En slik celle var rettet her på 32 HPF og alvorlig skadet av flere laserpulser, som indikert av den røde bolten. Den hvite pilen viser den skadde cellen, gule piler indikerer andre GFP-merkede celler. Bildet til høyre ble tatt etter utvinning og antistoffarging av samme såret.

Figur 3. Live stream oppkjøpet av laser skade avslører hvordan skaden påvirker hele somitt blokken. Montasje enkeltbilder tatt opp på Axioplan i live stream modus (dvs. ca 16 bilder / sek) med DIC. Den svarte pilen viser hvor laseren treffer somitic muskel ved 28 HPF. Røde piler indikerer tilbaketrekkingshåndtaket ender av en skadetmyofibril. Disse dynamiske endringene innenfor en somitt blokk inntraff innen 2,5 sek.

Discussion

Laser-mediert skade er en kraftig metode for å påføre sår ønsket størrelse ved ablating celler for å studere regenerering under kontrollerte forhold i sebrafisk embryo. Spesielt, kan cellene være målrettet presist (figur 2), og begge skaden området samt timing kan kontrolleres. Deretter blir skaden nettstedet og fornyelsesprosesser lett overvåkes, fart (fig. 3) og analyseres (figur 1). Imidlertid, selv om laseren er godt fokusert i x-og y-aksen, er det ikke fullstendig fokusert i z-aksen. Dette kan forårsake skade på celler lokalisert under eller over cellene av interesse. Likevel åpner denne tilnærmingen opp et stort felt av in vivo undersøkelser av muskel reparasjon.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heating block
Pair #5 forceps	Dumont
Glass slides	Menzel		76 x 26 mm
Coverslips	Roth		50 x 24 mm #1
Petroleum jelly
Stereomicroscope	Leica		MZFLIII
Micropoint laser	Andor Technology
Fluorescence microscope	Zeiss		Axioplan II
Metamorph software	Molecular devices
Reagents Low-melting point agarose ( #50081, Lonza) Tricaine stock solution: 400 mg Tricaine (#A-5040, Sigma-Aldrich ) / 100 ml dH2O pH 9.0 E3 medium (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)