Summary
Un genoma único método eficaz mutación del gen se ha establecido utilizando
Abstract
Mutagénesis de transposones y deleción de un solo gen son dos métodos aplicados en knockout de genes en todo el genoma en 1,2 bacterias. Aunque mutagénesis de transposones consume menos tiempo, menos costoso, y no requiere la información completa del genoma, hay dos puntos débiles en este método: (1) la posibilidad de una mutantes dispares en la biblioteca mixta mutante que contra-selecciona mutantes con competencia disminuido; y (2) la posibilidad de la inactivación parcial del gen mediante el cual los genes no totalmente perder su función después de la inserción de un transposón. De un solo gen análisis de deleción puede compensar los inconvenientes asociados con la mutagénesis de transposones. Para mejorar la eficiencia de todo el genoma deleción del gen individual, tratamos de establecer una técnica de alto rendimiento para todo el genoma deleción del gen único usando Streptococcus sanguinis como organismo modelo. Cada supresión construcción génica en S. sanguinis genoma está diseñado para comprender 1-Kb aguas arriba del gen diana, el gen aphA-3, proteína que codifica resistencia a la kanamicina, y 1-kb aguas abajo del gen diana. Tres conjuntos de cebadores F1/R1, F2/R2, y F3/R3, respectivamente, se diseñaron y sintetizaron en un formato de placa de 96 pocillos para PCR-amplificaciones de los tres componentes de cada construcción de deleción. Cebadores R1 y F3 contiene 25-bp secuencias que son complementarias a las regiones del gen aphA-3 en su extremo 5 '. A gran escala amplificación por PCR del gen aphA-3 se realiza una vez para crear todas las construcciones de deleción de un solo gen. El promotor del gen aphA-3 está inicialmente excluidos para minimizar el potencial efecto polar de casete de kanamicina. Para crear las construcciones de deleción de genes, de alto rendimiento de la amplificación por PCR y la purificación se realizan en un formato de placa de 96 pocillos. Un amplicón de PCR recombinante lineal para cada gen de supresión se hace a través de cuatro reacciones de PCR de alta fidelidad utilizando ADN polimerasa. El expon inicialfase de crecimiento preferencial de S. sanguinis cultivadas en caldo Todd Hewitt suplementado con 2,5% de suero de caballo inactivado se utiliza para aumentar la competencia para la transformación de la PCR recombinante construcciones. Bajo esta condición, hasta el 20% de S. células sanguinis se puede transformar usando ~ 50 ng de ADN. Sobre la base de este enfoque, 2048 mutantes con deleción de un solo gen se obtuvieron en última instancia de los 2.270 genes en S. sanguinis excluyendo cuatro ORFs de genes contenida enteramente dentro de otros ORFs en S. sanguinis SK36 y 218 genes esenciales potenciales. La técnica en la creación de construcciones de genes de deleción es de alto rendimiento y podría ser fácil de usar en todo el genoma deleciones de genes individuales para cualquier bacteria transformables.
Protocol
1. Primer Diseño
- Los cebadores se diseñan utilizando en los guiones de las casas basado en el S. sanguinis SK36 secuencia del genoma. Tres conjuntos de cebadores, F1/R1, F2/R2, y F3/R3 están diseñados para la amplificación de la 1-kb secuencia arriba del gen diana, la aphA-3 gen que codifica la resistencia a la kanamicina (Km r) proteína 3 y 1 el -kb aguas abajo secuencia del gen diana, respectivamente (Figura 1). Entre estos cebadores, F1 y R3 están diseñados usando ePrimer3 en la suite de programas de EMBOSS ( http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html ) para amplificar las regiones flanqueantes aguas arriba o aguas abajo de la diana gen. Cebadores específicos de genes, R1 y F3, se han diseñado basándose en el 5 'y 3' secuencias del gen diana. Cebadores R1 y F3 contiene 25-bp secuencias de adaptador en su extremo 5 'que son complementarias a la aphA-3gen. Las temperaturas de fusión de cada cebador fueron diseñados para ser lo más cercano posible a 60 ° C para permitir el uso de una temperatura de recocido uniforme para todas las reacciones de PCR en 96-y formato.
- F1, R1, R3 F3 y cebadores se sintetizan en placas de 96 pocillos con base en una orden de genes. Cada placa contiene un tipo de cebadores en el orden mismo gen. Diluir los cebadores en 96-y la placa de cebador de trabajo a una concentración final de 10 mM para la amplificación por PCR utilizando una pipeta multicanal.
2. De alto rendimiento PCR amplificación y purificación
- Para alto rendimiento amplificar 1-kb aguas arriba o aguas abajo de la diana S. genes sanguinis, montar una mezcla de cóctel PCR en hielo en un tubo cónico de 15-ml que contiene 1640 l ddH 2 O, 250 l 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 l de 10 mM de mezcla dNTP, 100 l de 50 mM MgSO 4, 100 l de 10 ng / l S. sanguinis SK36 de ADN genómico y 10 l Platinum Taq ADN polymerase alta fidelidad y la transferencia de 23 l de la mezcla en cada pocillo en placas de 96 pocillos PCR usando una pipeta multicanal. Transferir 1 l de cada F1 y R1 (o F3 y R3) a partir de los 10 mM de trabajo placas de cebadores para la placa de PCR usando una pipeta multicanal. Sellar la placa de PCR y realizar la amplificación a 94 ° C durante 1 min, y 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 54 ° C durante 30 seg y 68 ° C durante 1,5 min.
- Preparar un 1% en gel de agarosa que contengan bromuro de etidio con 48 pozos de ajuste de carga pipeta multicanal. Mezclar 4 l producto de PCR con 1 l de tampón de carga 5xDNA en placa de 96 pocillos y cargar las muestras en un gel de agarosa utilizando una pipeta multicanal 10-l. Ejecutar la electroforesis a 135 V durante 30 min. Examine la banda en el gel bajo UVP documentación y sistema de análisis.
- Purificar los productos de PCR por PureLink 96 kit de purificación de PCR usando centrifugación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para eluir el ADN, añadir 40 l estéril ddH 2 O para el bienestar de la bncontrar plato.
- Escoger al azar varios amplicones purificados en la placa para examinar las concentraciones de ADN utilizando espectrofotómetro NanoDrop. Ajustar la concentración de los amplicones en la placa a ~ 10 ng / ul.
- Un plásmido que contiene kilometros casete r es digerido usando EcoR I como molde de PCR. El plásmido digerido se purificó por kit de purificación de PCR QIAquick y el ADN del plásmido lineal se ajusta a la concentración de ADN final de 10 ng / ul. Ensamble mezcla 25 l para amplicón kilometros casete r incluyendo 16.4 l O ddH 2, 2,5 l 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 l de 10 mM dNTP mezcla, 1 l de 50 mM Mg SO 4, 1 l de 10 mM F2, 1 l de 10 mM R2, 1 l de ADN plásmido lineal y 0,1 l de platino Taq ADN polimerasa de alta fidelidad. Realizar la amplificación de PCR a 94 ° C durante 1 min, y 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg y 68 ° C durante 1 min. Examine el producto de la PCR por electroforesis en gel de agarosa al 1%. Poola mayor parte de la amplificación de casete de 10 kilometros r individuo PCR purificado con el kit de purificación de PCR QIAquick. Ajustar la concentración de amplicón a 10 ng / ul.
- Para obtener la última lineal amplicón PCR recombinante, tres amplicones de PCR se combinan con cada l 1 (en cantidades casi iguales-molar) en una placa de PCR así como la plantilla para la PCR. Otros componentes de la PCR se añade incluyendo 14.4 l O ddH 2, 2,5 l 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 l de 10 mM dNTP mezcla, 1 l de 50 mM Mg SO 4, 1 l de 10 mM F1, 1 l de 10 R3 mu M, 0,1 l Platinum Taq DNA polimerasa de alta fidelidad. Amplificación por PCR se realizó a 94 º C durante 2 min, 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg 55 ° C durante 30 seg y 68 ° C durante 3,5 min, y finalmente 68 ° C durante 4 min.
- Examinar los amplicones de PCR en gel de agarosa. Purificar y cuantificar los amplicones de la PCR como se describe anteriormente. Congelar los recombinados amplicones de la PCR a -20 ° C.
3. ComCélulas Preparación competente
- Caldo Todd Hewitt se preparó, pH ajustado a 7,6 con NaOH 10 N, se calienta a ebullición y después se enfrió a temperatura ambiente y se esterilizó usando poliestireno 0,22 micras filtro 4. Añadir 300 l caballo inactivado por calor suero (concentración final de 2,5%) a 11,7 ml de caldo Todd Hewitt en 15-ml tubo cónico para compensar TH + HS medio. TH alícuota + HS medio a 2 ml y 10 ml en tubos.
- Inocular 5 l de existencias S. sanguinis SK36 congelado a -80 ° C en 2 ml de medio de TH + HS e incubar el cultivo durante la noche con tapado herméticamente a 37 º C, acompañada de pre-incubación de la 10 ml-TH + tubo HS.
- Después de toda la noche, transferir 50 cultura l en 10 ml TH + HS y se incuba el tubo a 37 º C durante 3 h (correspondiente a OD 660 de 0.07 hasta 0.08), de usar inmediatamente para la transformación.
4. Celular Transformación y selección de antibióticos
- Añadir 2 l de 70 ng S. sanguinis SK36 competenciatencia péptido estimulante (CSP) y 2 l lineal de amplificación de PCR recombinante (~ 50 ng) a tubos Eppendorf de 96 pocillos bloque y los pre-calentamiento a 37 º C. Transferir 330 l de 3 hr-incubado SK36 cultura en cada tubo. Incubar a 37 ° C durante 1 hr. Reemplazar con ADN estéril O ddH 2 como control.
- Colocar el bloque de hielo y se extendió en 100 l de cada transformación en infusión de cerebro corazón (BHI) placa de agar con 500 mg / ml de kanamicina. Incubar las placas a 37 ° C durante 2 días bajo condiciones microaeróbicas.
5. Confirmación mutante y almacenamiento
- Para cada mutante de reemplazo, escoger al azar hasta 2 colonias individuales, inocular la colonia en 5 ml de BHI que contenía 500 ug / ml de kanamicina y se incuba el inóculo microaerobically durante la noche a 37 ° C. Criopreservar cada cultivo en 30% de glicerol a -80 ° C
- Para examinar si el mutante que contiene el reemplazo de genes de esperar, realizar la PCR de colonias para cada mutante utilizando F1 y R3cebadores en placas de 96 pocillos PCR. Acerca de 1-l cultivo de una noche de colonia individual se utiliza como el molde de ADN en 25-l PCR-amplificación de la reacción. PCR se realizó a 94 º C durante 5 min, 35 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg y 68 ° C durante 3,5 min, y finalmente 68 ° C durante 4 min.
- Para identificar con precisión doble banda mutantes o contaminante amplificación PCR, examine la amplificación de PCR mediante electroforesis durante 4 horas a> 12 cm de largo 2% en gel de agarosa con tinción de bromuro de etidio. Bajo esta condición, la electroforesis en gel de agarosa, los amplicones con ≥ 100 pb se diferencia claramente identificados. Cuando las bandas resultantes de la amplificación de la casete r kilometros y el gen de tipo salvaje se prevé que difieren en <100 pb, se utiliza un cebador T1 interna para determinar si un gen de tipo salvaje puede ser detectada por PCR.
- Para confirmar aún más la eliminación, los amplicones se purificó por PureLink 96 kit de purificación de PCR y se secuenciaron usando el cebador P1 cualse une a la casete r kilometros. Mantener sólo mutantes correctos confirmados por secuenciación.
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Representative Results
Después de la amplificación por PCR usando los cebadores F1 y R1, R3 y F3 y, aproximadamente 1-kb aguas arriba y aguas abajo de cada S. sanguinis gen se obtuvieron en formato de 96-pocillos, respectivamente (Figura 2A). Bajo nuestras condiciones de PCR y usando cebadores diseñados, un producto específico se amplificó a partir de S. sanguinis de ADN genómico en cada reacción de PCR. Este resultado indica los cebadores eran altamente específicos para los objetivos de S. sanguinis. Mediante la PCR de re-amplificación usando cebadores F1 y R3 y tres amplicones de ADN, como plantillas lineales constructos recombinantes PCR (~ 3 kb) fueron de alto rendimiento creado en la placa de 96-pocillos, compuesta de una región aguas arriba del gen diana cada uno, un kanamicina cassette, y una región aguas abajo de cada gen diana en ese orden (Figura 2B). Los constructos recombinantes de PCR se transformó después en S. sanguinis SK36 y seleccionadas por kanamicina en placa de agar BHI. Para la mayoría de transformations, más de 1000 colonias fueron obtenidas en cada placa después de una microaerobia 2 d-incubación. Cuando estas colonias se amplificaron por PCR usando F1 y R3, una banda de ADN único correspondiente al tamaño esperado mutante (~ 3 kb) se observó por electroforesis en gel (Figura 2C). Al intentar eliminar los posibles genes esenciales, no hay colonias se podría obtener en la mayoría de las transformaciones. Para la supresión de otros genes esenciales, sin embargo, las colonias se obtuvieron todavía transformación siguiente. Después de la amplificación por PCR de estas colonias utilizando F1/R3, dos bandas de ADN correspondientes al tamaño esperado mutante y el tamaño de tipo salvaje apareció como se revela por electroforesis en gel (Figura 2C). Para algunos mutantes, el tamaño esperado mutante y la de tipo salvaje de tamaño de amplificación de PCR fueron demasiado cerca de ser separados por largo gel de agarosa. En este caso, un T1 cebador interno fue diseñado basándose en la secuencia del gen de tipo salvaje. PCR se realizó usando el cebador interno de un T1nd F1 cebador (Figura 2D). El SK36 de tipo salvaje se utilizó como cepa de control positivo para esta PCR. Si una banda con el tamaño esperado se amplificó a partir del mutante utilizando el cebador interno, se identificó el gen como gen esencial (doble banda mutante) ya que la presencia de casete de kanamicina en el mutante fue confirmado previamente por secuenciación de ADN usando el cebador P1. Sobre la base de este protocolo, que finalmente recogió 2048 no esencial S. sanguinis mutantes del gen excluyendo esos cuatro ORFs contenidas enteramente dentro de otros ORF (Tabla 1). Se identificaron 218 genes que son esenciales para S. sanguinis supervivencia en las condiciones experimentales.
| Clase | Open-marcos de lectura (ORF) |
| * Total genes | 2270 |
| Estos genes | 2266 |
| No esencial (sin promotor aphA-3) | 1973 |
| No esencial (promotor aphA-3) | 75 |
| Esencial (no transformante) | 60 |
| Essential (doble banda) | 158 |
* Cuatro ORFs contenidas enteramente dentro de otros ORF.
Tabla 1. S. sanguinis gen mutante resumen.
Figura 1. PCR recombinante. Tres conjuntos de cebadores (F1/R1, F2/R2 y F3/R3) están diseñados para amplificar la secuencia aguas arriba, un gen de resistencia a los fármacos (Km r) y la secuencia de abajo, respectivamente. Ambos extremos 5 'de los cebadores F3 R1 y contener secuencias de complementary con el casete de un gen resistente a los antibióticos. Un producto final de PCR de ADN recombinante que contiene el marcador de selección de antibióticos flanqueado con S. ADN genómico sanguinis se produce usando F1/R3. El ADN recombinante se integrará en S. sanguinis genoma vía doble cruce de recombinación.
Figura 2. Electroforesis en gel de Representante de amplicones de PCR en agarosa. A, 1-kb PCR amplicones de aguas arriba o aguas abajo de la meta de S. genes sanguinis. B, los ADN recombinantes PCR compuestas de aguas arriba y aguas abajo de los genes diana y promotor aphA-3. C, PCR de colonias de los amplicones de la transformación de S. sanguinis con PCR ADN recombinante; bandas dobles en el carril 4, 10, 14, 15, 20 y 24. D, la amplificación por PCR de las colonias de tipo salvaje y mutante utilizando cebadores F1/T1; M,mutante, W, de tipo salvaje.
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Discussion
Para minimizar los posibles efectos polares de la sustitución de un gen diana con el gen exógeno antibióticos en los genes vecinos, dos pasos se toman mientras imprimación inicial de diseñar. Para la mayoría de los genes suprimidos, la cebadores R1 y F3 están diseñadas para eliminar la región de codificación de 6 pb después del codón de inicio a 30 pb antes del codón de parada. Los últimos 30 pares de bases se mantienen para proteger potencial sitio de unión ribosómica utilizado por el gen corriente abajo adyacente. La región retenido entre dos genes vecinos se extiende a 100 pb cuando se encuentra en orientaciones opuestas y los N-terminales de ambas proteínas es cerca unos de otros para evitar la eliminación de una región promotora potencial. El promotor del gen aphA-3 se excluye en la construcción recombinante para la deleción del gen 5. Un sitio de unión ribosómica se introduce en el aphA-3 gen para la traducción. Para poner a prueba nuestra estrategia, construido al azar 10 y luego 96 mutantes de cambio alélicas. Nosotros obtained 10 y 93 mutantes, respectivamente, en placas de selección con kanamicina, lo que sugiere que el promotor de menos aphA-3 gen se expresaba bien en la mayoría de los casos. Luego diseñó y sintetizó el cebador para promotor de menos aphA-3 gen para todas las deleciones de genes en el S. sanguinis genoma. Sin embargo, hemos encontrado algunos genes en S. sanguinis se expresaron bajo o no expresada que es probable que afecten la expresión del promotor aphA-3 gen y por lo tanto la selección con kanamicina. Para resolver este problema, el promotor del gen aphA-3 a partir del plásmido se introdujo en el casete r kilometros. Una mayor parte de la amplicón kilometros promotor casete r se obtuvo de 10 individuo PCR usando cebadores F2p/R2. Salvo que R1 nuevo promotor R1P cebadores fueron diseñados para complementar con el amplicón kilometros promotor casete r, todos los pasos de construcción otros fueron los mismos que para la construcción sin promotor.
Para mejorar la una eficienciay de la recombinación homóloga, se selecciona largos (1 kb) secuencias flanqueantes aguas arriba y aguas abajo de la S. sanguinis gen diana en la fabricación de construcciones de deleción de genes. El tamaño de la secuencia de flanqueo estaba limitado a 1 kb sobre la base de dos puntos: (1) la longitud de los fragmentos de ADN (~ 3 kb) permitió listo amplificación por PCR del gen aphA-3 (~ 1 kb) más 2 kb de secuencias de flanqueo utilizando de alta fidelidad de ADN polimerasa, y (2) la viabilidad de secuenciación de regiones flanqueantes por ABI método de secuenciación desde los dos extremos (~ 1 kb). Los altos números de los transformantes en la mayoría de S. sanguinis supresiones de genes indica una secuencia kb aguas arriba y aguas abajo, respectivamente, fueron suficientes para extraer los genes diana.
Para conectar el éxito aguas arriba y aguas abajo del gen diana con los dos extremos de aphA-3 gen recombinante en la amplificación por PCR, los cebadores R1, F2, F3 y R2 se añadirá en sus extremos 5 'una secuencia extra que es complementario con el connecting extremo de la otra parte en muchos casos bacterianas supresión de genes 6,7. Los estudios preliminares mostraron que la secuencia adicional podría reducirse a 25 pb para este protocolo de PCR recombinante. En este protocolo, se han eliminado las secuencias adicionales de cebadores F2 y R2 en aphA-3 gen y se añadió 25-pb secuencia extra al extremo 5 'de R1 y F3 en aguas arriba y aguas abajo de la S. sanguinis gen diana. Este diseño se reducirá la longitud y la cantidad de cebadores y por lo tanto reducir el costo y los tiempos de PCR para mejorar la eficacia de supresión de un solo gen. En nuestro laboratorio, este diseño también se ha demostrado con éxito por las supresiones de genes en los microbios tales como Streptococcus mutans y Streptococcus pneumoniae, y Porphyromonas gingivalis.
En este protocolo, la especificidad de los cebadores de PCR es crítica. La temperatura de fusión de imprimación fue alta (> 58 ° C), el tamaño del cebador fue largo (> 21 pb), y el cebador binding sitio único en el genoma de S. sanguinis. Este diseño produce individuales de genes específicos de productos en casi cada una de las amplificaciones de PCR. Un solo gen específico de producto de amplificación por PCR es crítico para la amplificación por PCR última. De lo contrario, el final de la amplificación por PCR que da como resultado la formación del compuesto final, recombinante de regiones aguas arriba y aguas abajo de cada gen y gen casete antibiótico, respectivamente, sería difícil.
Densidad de células dependencia de transformación se ha demostrado en muchos estreptococos, como S. 8 sanguinis, S. 9 mutans y S. pneumoniae 10. Cuando la densidad de células de S. sanguinis llegado a un OD 660 de 0,07 a 0,08 (que corresponde a ~ 5x10 6 UFC / ml) en medio TH + HS, la más alta eficiencia de transformación de S. sanguinis con un amplicón de PCR recombinante lineal y se obtuvo hasta el 20% de S. sanguinis célulaspodría ser transformado. Tras la finalización de las supresiones de genes en todo el genoma en S. sanguinis, se encontró que el número de los transformantes para la supresión de otros genes no esenciales fue baja (~ 10). No hay duda de que la eficiencia de transformación de alta de bacterias es importante cumplir con todas las supresiones de genes no esenciales en los golpes de gracia del gene de todo el genoma.
Excepto para la creación constructo recombinante por PCR, también existen otras técnicas para la inactivación de un solo gen. Por ejemplo, la creación de plásmido suicida ha sido extensamente aplicable para inactivar genes bacterianos en una escala pequeña. Sin embargo, esta técnica no se ha utilizado para todo el genoma inactivación del gen único, ya que la creación a gran escala del plásmido es mucho tiempo y es laborioso, y algunas bacterias necesitan ser creados suicidio plásmido específico. Aunque marcador menos deleción del gen puede evitar el posible efecto polar del gen de resistencia a los antibióticos tradicionales marcadores método menos deleción del gen es más tiempo-conSuponiendo y difícil de inactivar un gen que el método plásmido suicida. En Escherichia coli, el genoma marca-menos supresiones de genes se han obtenido a través de sustitución con el gen de resistencia a los antibióticos y, a continuación eliminación de la casete de resistencia 6. Sin embargo, este E. coli cepa requiere el fago λ recombinasa Red. Antes de la transformación de genes eliminación, el plásmido auxiliar pKD46 Red debe ser introducido en E. coli 11. En nuestra técnica, hemos eliminado el promotor del gen aphA-3 resistencia en la gran mayoría de los genes mutantes con deleción y diseñado los dos extremos de aphA-3 ORF seguir la estructura de la expresión del gen delecionado región, para evitar la polar efecto cuestión de la casete de resistencia. Hasta ahora, no hemos encontrado la cuestión efecto polar después de examinar la función de muchos mutantes creados por esta tecnología. Un conjunto de todo el genoma y clara de los genes esenciales adquirido en S. sanguinis utilizando thSe técnica 12 también implican baja posibilidad del efecto polar de casete de antibiótico en el sistema. Hemos demostrado promotor de menos otros genes de resistencia a antibióticos, como la eritromicina y cloranfenicol genes de resistencia, se podría aplicar en esta técnica (datos no mostrados). Además, esta técnica no necesita anfitrión plásmido suicida y reconstruida. En general, esta técnica es de alto rendimiento para crear en todo el genoma construcciones de deleción de genes y podría ser fácil de realizar en el genoma sola mutación genética de una bacteria.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas R01DE018138 de los Institutos Nacionales de Salud (PX) y, en parte, por la Virginia Commonwealth University Programa Presidencial de Incentivos de Investigación (PRIP) 144602-3 (PX). Agradecemos a los Dres. Lei Chen, Yuetan Dou y Wang Xiaojing para ayudar con la construcción de mutantes del genoma de ancho. Agradecemos también a la facilidad de la base de ADN en la Universidad Virginia Commonwealth University para la secuenciación del ADN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
| Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
| Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
| Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
| Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
| Primer 5' end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
| Primer 5' end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
| Primer 5' end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
| CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
| DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
| EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
| Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
| Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
| Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
| TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
| PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
| QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
| Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
| Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
| Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
| Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
| Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
| Labnet's Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet's Gel XL |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
| Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |
References
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