Summary
सबूत नहीं जमा है, कि इस्कीमिक शर्त (पीसी) - मस्तिष्क के लिए एक गैर हानिकारक इस्कीमिक चुनौती - बाद में एक हानिकारक इस्कीमिक अपमान करने के लिए एक क्षणिक संरक्षण प्रदान करता है. हम C57BL6 / जम्मू चूहों में क्षणिक फोकल मस्तिष्क ischemia (मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा, MCAO द्वारा प्रेरित) को जल्दी इस्कीमिक सहिष्णुता (आईटी) उत्पन्न करने के लिए एक शर्त प्रोत्साहन के रूप में द्विपक्षीय आम मन्या धमनी रोड़ा (BCCAO) की स्थापना की.
Abstract
सबूत नहीं जमा है, कि इस्कीमिक शर्त - मस्तिष्क के लिए एक गैर हानिकारक इस्कीमिक चुनौती - बाद में एक हानिकारक इस्कीमिक अपमान करने के लिए एक क्षणिक संरक्षण प्रदान करता है. हम C57BL6 / जम्मू चूहों में क्षणिक फोकल मस्तिष्क ischemia के लिए जल्दी इस्कीमिक सहिष्णुता पैदा करने के लिए एक शर्त प्रोत्साहन के रूप में द्विपक्षीय आम मन्या धमनी रोड़ा की स्थापना की है. इस वीडियो में, हम इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया पद्धति का प्रदर्शन करेंगे.
Introduction
इस्कीमिक स्ट्रोक एक उच्च मृत्यु दर और एक विशाल सामाजिक - आर्थिक बोझ 1 के साथ एक बीमारी है. हाल के दशकों में गहन प्रयोगात्मक और नैदानिक वैज्ञानिक प्रयासों के बावजूद, तीव्र इस्कीमिक स्ट्रोक के मरीजों के लिए उपचार के विकल्प 2 बहुत ही सीमित रहते हैं. उस के विपरीत, विकसित देशों में बुजुर्ग लोगों के प्रतिशत में वृद्धि नाटकीय रूप से अगले दशकों में 3 इस्कीमिक स्ट्रोक के साथ रोगियों की घटनाओं और व्याप्तता बढ़ जाएगा. इसलिए, इस्कीमिक स्ट्रोक के साथ रोगियों में नए उपचार रणनीतियों के लिए एक दबाने की जरूरत है.
एक दृष्टिकोण एक हानिकारक उत्तेजना के साथ सामना करने के लिए मस्तिष्क की अंतर्जात अनुकूलन के तंत्र में आगे की समझ हासिल करने के लिए है. यह मस्तिष्क व्युत्पन्न neuroprotection भी इस्कीमिक शर्त (पीसी) या इस्कीमिक सहिष्णुता (आईटी) के रूप में जाना जाता है और मस्तिष्क के लिए आवेदन किया है एक गैर हानिकारक हानिकारक प्रोत्साहन, एक क्षणिक प्रतिरोध को प्रेरित करता है, जिनमें एक घटना का वर्णन करता हैबाद में एक हानिकारक इस्कीमिक अपमान 4 के खिलाफ. आईटी जल्दी, पीसी के बाद कुछ ही घंटों के लिए मिनट के भीतर होता है और 4 घटित करने के लिए घंटे के एक जोड़े की एक विलंबता की जरूरत है, जो आईटी देरी जो: आईटी दो अलग अलग समय खिड़कियों में होता है.
अब तक मस्तिष्क में आईटी पर अनुसंधान आईटी देरी पर ध्यान केंद्रित किया है. बहुत कम आईटी जल्दी के तंत्र पर जाना जाता है. इस अध्ययन का उद्देश्य एक पर्याप्त पीसी प्रोत्साहन के रूप में, आईटी में देरी को उत्पन्न करने के लिए एक स्थापित उत्तेजना उत्पन्न करने के लिए है जो द्विपक्षीय आम मन्या धमनी रोड़ा (BCCAO) स्थापित करने के लिए है क्षणिक फोकल मस्तिष्क ischemia (मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा द्वारा प्रेरित, MCAO) को आईटी जल्दी C57BL6 में / जम्मू चूहों.
दोनों शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के दौरान (BCCAO और MCAO), लेजर डॉपलर flowmetry (एलडीएफ) से मस्तिष्क में रक्त प्रवाह की निगरानी (CBF) का प्रदर्शन किया गया था.
BCCAO anesthetized और अनायास साँस लेने चूहों में प्रदर्शन किया गया था. दोनों आम मन्या धमनियों (सीसीए) के संपर्क में थेऔर 60 के लिए occluded सेकंड reperfusion के 5 मिनट के बाद. इस BCCAO / reperfusion के अनुक्रम में दो बार दोहराया गया था. सर्जरी के बाद, चूहों जल्दी से बरामद किया और कार्यात्मक हानि के कोई संकेत नहीं दिखाया. BCCAO प्रोटोकॉल मस्तिष्क में देरी कोशिका मृत्यु में परिणाम नहीं था कि ऊपर वर्णित, बाहर शासन करने के लिए, हम एक में BCCAO के बाद 72 घंटा धुंधला हो जाना एक TdT की मध्यस्थता dUTP बायोटिन निक अंत लेबलिंग (TUNEL के) (या नकली सर्जरी) का प्रदर्शन अलग समूह.
MCAO 5-7 कृन्तकों में फोकल मस्तिष्क ischemia के शामिल होने के लिए एक व्यापक रूप से स्थापित मॉडल है. सर्जिकल प्रक्रियाओं मानकीकृत संचालन प्रक्रिया (एसओपी) 8 का उपयोग किया जाता था. बाएं सीसीए को प्रकाश में लाने के बाद, एक सिलिकॉन से ढके monofilament जिससे पूर्वकाल मस्तिष्क धमनी (एसीए) तक विलिस के सर्किल में आंतरिक मन्या धमनी (आईसीए) के माध्यम से उन्नत किया है और बाहर का सीसीए, मध्य मस्तिष्क धमनी की उत्पत्ति (में पेश किया गया था एमसीए) समय का एक निर्धारित अवधि के लिए occluded था. इस अध्ययन में, हमआम तौर पर स्ट्रिआटल और cortical मस्तिष्क क्षेत्रों को शामिल एमसीए क्षेत्र में एक और इस्कीमिक घाव में जो परिणाम MCAO का इस्तेमाल किया 45 मिनट,.
हमारे अध्ययन में, हम जल्दी आईटी पीसी प्रोत्साहन के रूप में BCCAO का उपयोग करने का अस्थायी प्रोफाइल का विश्लेषण किया. हमारे डेटा BCCAO और MCAO के बीच इष्टतम समय देरी आईटी 30 मिनट है जल्दी प्रेरित करने के लिए है कि, संकेत दिया.
इस वीडियो में, हम दोनों शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं, अर्थात् BCCAO और MCAO के एक प्रदर्शन दे देंगे.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
इस आलेख में वर्णित सभी प्रक्रियाओं Landesamt फर Gesundheit अंड Soziales, बर्लिन, जर्मनी के दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
पूर्व शल्य प्रक्रियाओं
1. Monofilaments की तैयारी
- Intraluminal तंतु की तैयारी के लिए, 8-0 नायलॉन monofilament टांके इस्तेमाल किया गया और 13 मिमी प्रत्येक की लंबाई को काट रहे थे.
- Monofilaments की कोटिंग के लिए, Xantopren एम म्यूकोसा, (Heraeus Kulzer जीएमबीएच, हनाऊ, जर्मनी) उत्प्रेरक समाधान (उत्प्रेरक, यूनिवर्सल प्लस, Heraeus Kulzer जीएमबीएच, हनाऊ, जर्मनी) की एक बूंद को जोड़ने के द्वारा सक्रिय किया जाता था.
- यह पूरी तरह से इसके साथ कवर किया गया था जब तक monofilament धीरे सिलिकॉन के माध्यम से निकाला गया था. ऐसा करके, monofilament समान रूप से सिलिकॉन के साथ कवर किया जाएगा. सक्रिय कोटिंग सामग्री जल्दी फर्म और शुष्क हो जाएगा क्योंकि बहुत लंबा इंतज़ार कर रहा से बचें.
- सिलिकॉन जमना शुरू होने से पहले, यह कागज के एक पत्रक पर इसे खींच द्वारा फिलामेंट से अत्यधिक सिलिकॉन पट्टी बंद करने की सिफारिश की है. ऐसा करके, सिलिकॉन परत 200 माइक्रोन की एक अनुमानित मोटाई को बाहर thinned किया जा सकता है.
- सिलिकॉन से ढके monofilament के आधार यह रातोंरात सूखा क्रम में क्ले मॉडलिंग में फंस गया था.
टिप्पणी: आदर्श रूप में, केवल निष्फल या कम से कम कीटाणुरहित monofilaments शल्य साइट पर बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. Monofilaments की गुणवत्ता 9 खराब हो सकता है, क्योंकि व्यवहार में, हाथ से बनाई गई monofilaments की नसबंदी या कीटाणुशोधन बहुत मुश्किल है. इसलिए, यह बजाय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बाँझ monofilaments उपयोग करने के लिए बेहतर हो सकता है.
2. सर्जिकल उपकरणों की और पशु की तैयारी
- सभी शल्य चिकित्सा उपकरण 70% इथाइल अल्कोहल में रखा गया था. इसके अतिरिक्त, पूर्व प्रत्येक नई शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के लिए, सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों ध्यान से एक साफ कर रहे थेएन डी 70% एथिल शराब का उपयोग कर कीटाणुरहित.
- शल्य चिकित्सा के क्षेत्र को अच्छी तरह से transection से पहले सभी जानवरों में 70% एथिल शराब का उपयोग कर कीटाणुरहित किया गया था. कीटाणुरहित साइटों को पूरी तरह चीरों प्रदर्शन से पहले सूखे की अनुमति दी गई. इस microabrasions और बाद में त्वचा सूजन 9 कारण हो सकता है के रूप में फर के अतिरिक्त क्लिपिंग का प्रदर्शन नहीं किया गया था.
सर्जिकल प्रक्रियाओं
3. एलडीएफ जांच और एलडीएफ निगरानी की पोजिशनिंग
- संज्ञाहरण के शामिल होने के लिए, चूहों एक vaporizer का उपयोग कर 30% ऑक्सीजन, 70% एन 2 हे और 2.5 isoflurane% से मिलकर एक गैसीय मिश्रण से अवगत कराया गया. संज्ञाहरण के रखरखाव के लिए, isoflurane एकाग्रता 1.5% तक कम हो गया था. चूहे शल्य प्रक्रिया के दौरान मुखौटा साँस लेने के माध्यम से अनायास साँस ले रहे थे.
- एक गुदा तापमान जांच डाला गया था और चूहों पार्श्विका सिर उजागर स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम करने के लिए तय किया गया. सर्जरी के दौरान, चूहों एक पर आराम कर रहे थेथर्मोस्टेट नियंत्रित हीटिंग पैड, ± 0.5 डिग्री सेल्सियस 37.0 के एक निरंतर कोर तापमान सुनिश्चित करना एक बाण के समान midline चीरा (~ 1 सेमी लंबाई) पार्श्विका खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए प्रदर्शन किया था.
- खोपड़ी के बाईं ओर ध्यान से विच्छेदित किया गया था और एक fiberoptic जांच तुरंत गोंद का उपयोग पर्वबिन्दु से खोपड़ी 2 मिमी दुम और 5 मिमी पार्श्व को सीधे तय की गई थी. बाद में, घाव किनारों ध्यान से मस्तिष्क हाइपोथर्मिया के रूप में भी संक्रमण से बचने के लिए अनुकूलित किया गया.
- माउस गर्दन के उदर पक्ष को बेनकाब करने के लिए चारों ओर हो गया था. fiberoptic जांच जांच अनुकूलक (; Järfälla, स्वीडन मास्टर जांच 418-1, Perimed) को जोड़ने के माध्यम से एलडीएफ डिवाइस (PeriFLUX प्रणाली 5000, Perimed, Järfälla, स्वीडन) से जुड़ा था.
टिप्पणी: चारों ओर माउस मोड़ जबकि, fiberoptic जांच यह खोपड़ी से दूर टूट जाता है कि बचने के लिए सावधानी से तुला किया जाना चाहिए.
- एलडीएफ डिवाइस एक लैपटॉप कॉम से जुड़ा थाकंप्यूटर. एलडीएफ मूल्यों का सतत रिकॉर्डिंग विंडोज (संस्करण 2.50, Järfälla, स्वीडन) के लिए PeriSoft का उपयोग कर शुरू किया गया था. चित्रा 1 BCCAO और reperfusion के दौरान दस एलडीएफ रिकॉर्डिंग से प्राप्त मतलब CBF पाठ्यक्रम को दर्शाता है.
4. द्विपक्षीय आम मन्या धमनी आड़
- 3.1 में वर्णित के रूप में संज्ञाहरण बनाए रखा गया था. माउस अपनी पीठ पर रखा गया था. पशु की पूंछ और पंजे चिपकने वाला टेप का उपयोग हीटिंग पैड के लिए तय किया गया. एक बाण के समान उदर midline चीरा (~ 1 सेमी लंबाई) का प्रदर्शन किया गया था.
- दोनों salivatory ग्रंथियों को ध्यान से अलग कर दिया और अंतर्निहित सीसीए की कल्पना करने के लिए जुटाए गए थे.
- दोनों सीसीए ध्यान से इन संरचनाओं को नुकसान पहुँचाने के बिना संबंधित vagal नसों और साथ नसों से अलग हो गए थे. Vagal नसों की जोड़तोड़ महत्वपूर्ण हृदय आगमन की घटना के लिए क्षमता है जो parasympathetic तंत्रिका प्रणाली, का अस्थायी या स्थायी शिथिलता को जन्म दे सकता हैhythmia या भी अपरिवर्तनीय हृदय की गिरफ्तारी. इसलिए, यह vagal नसों के किसी भी जोड़तोड़ से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. एक ढीला 5-0 रेशम सीवन पाश प्रत्येक सीसीए के आसपास बनाया गया था.
- एक छोटे सिलिकॉन टयूबिंग (व्यास 2 मिमी) सीसीए और प्रत्येक पक्ष पर रेशम टांके के बीच में डाला गया था. इस ट्यूबिंग टांके (चित्रा 4) को कड़ा कर रहे थे जब धमनियों की दीवारों के हानिकारक से बचने के क्रम में सीसीए की एक splinting के रूप में इस्तेमाल किया गया था.
- दोनों सीसीए रेशम टांके कस द्वारा एक मिनट के लिए occluded गया. एलडीएफ संकेत आधारभूत संकेत के <10% तक कम हो गया था, जिसमें केवल चूहों, अध्ययन में शामिल थे. दोनों सीसीए की दोबारा खोलने के बाद, एक पांच मिनट reperfusion की अवधि शुरू किया गया था. एलडीएफ से एक पूरा reperfusion की यह सुनिश्चित किया गया था. अधूरा reperfusion (आधारभूत CBF की तुलना CBF यानी <90% वसूली) के साथ पशु निकाल दिए गए थे. BCCAO से एक मिनट और reperfusion के पांच मिनट के अनुक्रम एक कुल BCCAO durati के लिए दो बार दोहराया गया था3 मिनट के पर. चित्रा 1 BCCAO और reperfusion के दौरान दस एलडीएफ रिकॉर्डिंग से प्राप्त मतलब CBF पाठ्यक्रम से पता चलता है. प्रक्रिया के दौरान, यह गर्दन सामान्य नमक का उपयोग कर गीला घाव रखने की सिफारिश की है.
- पिछले reperfusion के बाद, सभी ट्यूबिंग और टांके के साथ ही खोपड़ी से जुड़ी fiberoptic जांच, हटा दिया गया घाव sutured थे और lidocaine मरहम (Xylocain 2%, एस्ट्राज़ेनेका जीएमबीएच, Wedel, जर्मनी) के लिए जरूरत के रूप में बार बार घावों को लागू किया गया था analgetic प्रबंधन.
- चूहे एक पूर्व गर्म करने के लिए हस्तांतरित किया गया (30 डिग्री सेल्सियस) वसूली बॉक्स (MediHEAT. यूके लिमिटेड ब्रो, कम्ब्रिया, PecoServives) वे पूरी तरह से होश आ गया था जब तक. इसके बाद, चूहों उनके पशु पिंजरों को लौट रहे थे.
5. मध्य प्रमस्तिष्क धमनी आड़
- चूहे फिर anesthetized थे, एक गुदा तापमान जांच डाला गया था और चूहों गर्दन के उदर पक्ष का पर्दाफाश करने के लिए एक हीटिंग पैड पर तैनात थे. बाद में, वे wअरे रूप BCCAO खंड में वर्णित तय की.
- एक लंबे समय तक 7-0 रेशम सीवन का उपयोग कर एक स्थायी संयुक्ताक्षर बाएं समीपस्थ सीसीए के आसपास बनाया गया था और धागा धीरे एक मच्छर दबाना (चित्रा 4) का उपयोग दुमदारी से निकाला गया था.
- एक अन्य स्थायी संयुक्ताक्षर बाएं बाह्य मन्या धमनी (ईसीए) और धागा (चित्रा 4) पशु के सही पक्ष की ओर खींच लिया था चारों ओर बनाया गया था.
- बाएं आईसीए आसपास संयोजी ऊतक ध्यान से जुटाए था और जिह्वा की प्रेरक तंत्रिका धीरे आईसीए के बाहर का पाठ्यक्रम का एक अच्छा सिंहावलोकन प्राप्त करने के लिए उठाया गया था. बाईं करने के लिए छोड़ दिया आईसीए झुकता pterygopalatine धमनी (पीपीए) सही (चित्रा 4) के लिए समीपस्थ आईसीए के पाठ्यक्रम का अनुसरण करता है.
टिप्पणी: दुम दिशा में सही करने के लिए बदल जाता है जो पहचान की जा करने के लिए एक धमनी है. इस फेर से सीसीए विभाजन से या जनसंपर्क से या तो निकलती है जो पश्चकपाल धमनी, हैईसीए के oximal हिस्सा (चित्रा 4).
- एक ढीला सीवन पाश 5-0 रेशम धागे का उपयोग समीपस्थ आईसीए के आसपास बनाया गया था.
- एक छोटे माइक्रोवैस्कुलर दबाना का प्रयोग, आईसीए अस्थायी रूप से 5-0 ढीला सीवन पाश (चित्रा 4) के लिए distally occluded था.
- एक छोटा सा चीरा सिर्फ माइक्रोवैस्कुलर कैंची (चित्रा 4) का उपयोग कर सीसीए विभाजन से पहले सीसीए के बाहर का भाग में बनाया गया था.
- एक चुने हुए सिलिकॉन से ढके monofilament छोटा सा चीरा के माध्यम से सीसीए में पेश किया और यह माइक्रोवैस्कुलर दबाना (चित्रा 4) में बंद कर दिया जब तक आईसीए में धकेल दिया गया था.
- यह (चित्रा 4) बंद कर दिया जब तक monofilament आईसीए में गहरी उन्नत किया गया था, जबकि microclamp ध्यान से, आईसीए से हटा दिया गया था. टिप्पणी: आप एक कलम की तरह इसे पकड़ नहीं है इसलिए इस बिंदु पर, बाएं हाथ में संदंश फ्लिप. यह और अधिक आसानी से संदंश के साथ रेशा हड़पने के लिए मदद करता है.दबाना applicator के संवहनी दाहिने हाथ में आयोजित किया जाना चाहिए. यह लगभग चीरा ओर से रक्तस्राव को रोकने के क्रम में आईसीए के आसपास ढीली 5-0 सीवन कसने के लिए आवश्यक हो सकता है.
- monofilament टिप का सही स्थान यह आईसीए में और नहीं पीपीए में उन्नत किया गया था अगर जाँच करने के लिए पहचान की गई थी. Monofilament टिप समीपस्थ पीपीए में पेश किया गया था, तो रेशा धीरे बस आईसीए / पीपीए विभाजन से पहले वापस खींच लिया था. यह धीरे सही पक्ष को समीपस्थ आईसीए एक सा खींच जबकि, फिर आईसीए में monofilament अग्रिम करने के लिए प्रयास किया गया था. ऐसा करके, बाहर का आईसीए की प्राकृतिक बेशक यह आसान आईसीए का उपयोग करने के लिए बना नकली था.
- Monofilament लगभग पूरी तरह से आईसीए में उन्नत किया गया था, समीपस्थ आईसीए के आसपास ढीली 5-0 सीवन पाश जगह में रेशा पकड़ के क्रम में कड़ा था. बाद में, सब रेशम धागे छोटा कर रहे थे और त्वचा घाव sutured था.
- सर्जरी के दौरान द्रव नुकसान replen थायह पूरी तरह से होश आ गया जब तक बाद में सामान्य नमक समाधान आईपी की 1.0 मिलीलीटर इंजेक्शन द्वारा दंडित, माउस पूर्व गर्म वसूली बॉक्स में स्थानांतरित किया गया.
- Reperfusion के लिए, चूहों फिर anaesthetized थे और monofilament ध्यान समीपस्थ आईसीए के आसपास 5-0 रेशम सीवन ढीला के बाद हटा दिया गया था. बाद में, 5-0 सीवन रक्तस्राव को रोकने के क्रम में ध्यान फिर से कड़ी कर दी गई थी.
- पूरा रक्तस्तम्भन की पुष्टि के बाद, गर्दन घाव sutured था.
- दर्द से राहत के लिए जरूरत के रूप में lidocaine मरहम बार बार त्वचा के लिए स्थानीय रूप से लागू किया गया था और यह पूरी तरह से होश में आ वसूली बॉक्स जब तक माउस पूर्व गर्म (° सी 30) को सौंप दिया गया था.
- एक सफल MCAO प्रक्रिया के लिए एक पहला संकेत, पशु का चक्कर एक घड़ी मनाया गया. कार्यात्मक घाटे की गंभीरता चूहों 10 के लिए संशोधित Bederson स्कोर का उपयोग मात्रा निर्धारित किया गया था. इस बार संशोधित Bederson स्कोर के अनुसार, स्नायविक स्कोर हम0 (सामान्य मोटर समारोह), 1 (माउस पूंछ से हटा लिया गया था जब धड़ और contralateral forelimb के मोड़), 2 (माउस के एक फ्लैट सतह पर पूंछ द्वारा आयोजित किया गया था जब contralateral ओर करने के चक्कर काटते हैं, लेकिन सामान्य: फिर निम्नानुसार श्रेणीबद्ध बाकी पर आसन), 3 (बाकी पर contralateral तरफ झुकाव), और 4 (कोई सहज मोटर गतिविधि या मृत).
6. BCCAO शाम सर्जरी
BCCAO दिखावा प्रक्रियाओं के लिए, चूहों एक असली BCCAO पीसी प्रक्रिया की अवधि के लिए anaesthetized थे, लार ग्रंथियों जुटाए थे और सीसीए के संपर्क में थे. यह मन्या धमनियों या vagal नसों को प्रत्यक्ष जोड़तोड़ दिखावा प्रक्रिया के दौरान परहेज कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है. सीसीए की जोड़तोड़ अन्तःचूचुक या धमनी लुमेन भीतर स्थानीय घनास्त्रता प्रेरित से vasoactive यौगिकों की एक विज्ञप्ति में परिणाम कर सकते हैं, जो अपने endothelial परत को नुकसान पहुंचा सकते हैं. एक परिणाम के रूप में, thromboembolic घटनाओं नकली सर्जरी के बाद हो सकता है. यह वीं में से एक प्रमुख confounder होगाई प्रक्रिया. दूसरी ओर, vagal नसों की जोड़तोड़ महत्वपूर्ण कार्डियक अतालता या भी अपरिवर्तनीय हृदय की गिरफ्तारी की घटना के लिए क्षमता है जो parasympathetic तंत्रिका प्रणाली, का अस्थायी या स्थायी शिथिलता को जन्म दे सकता है. इसलिए, यह BCCAO दौरान vagal नसों के किसी भी जोड़तोड़ से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.
शल्य चिकित्सा के बाद की प्रक्रियाओं
7. माप माप रोधगलितांश
रोधगलितांश आकार के आकलन के लिए, चूहों MCAO के बाद 72 घंटे तक जीवित रहे. बाद में जानवरों गहरा anesthetized थे, दिमाग को हटा रहे थे, रोधगलितांश मात्रा मापन के लिए hematoxylin (Papanicolau के प्रोटोकॉल का उपयोग) के साथ, methylbutan स्नैप जमी sectioned और दाग. ब्रेन वर्गों एक छवि विश्लेषक (MCID कोर 7.0 Rev.2.0, जीई हेल्थकेयर नियाग्रा इंक) का उपयोग करके निर्धारित और लिन एट अल की विधि के अनुसार शोफ के लिए सही थे 600 माइक्रोन अंतराल और रोधगलितांश मात्रा में एकत्र किए गए थे. 7,11
8. शामिल किए जाने के मानदंड
हम तीन BCCAO प्रकरणों में से प्रत्येक के दौरान अधिक से अधिक 90% द्वारा एक एलडीएफ मापा CBF कटौती की थी जो केवल जानवरों शामिल थे. आदर्श रूप में, एलडीएफ निगरानी BCCAO दौरान दोनों मस्तिष्क गोलार्द्धों में प्रदर्शन किया जाना चाहिए. साध्यता के लिए, हम केवल बाद में MCAO के अधीन हो जाएगा जो गोलार्द्धों छोड़, में एलडीएफ निगरानी प्रदर्शन किया. यह दृष्टिकोण 6,12 पहले वर्णित किया गया है. प्रत्येक BCCAO प्रकरण के बाद reperfusion (आधारभूत मूल्यों को यानी रिटर्न) पूरा होने के लिए आवश्यक था. अवधि चूहों संज्ञाहरण के अंतर्गत रखा गया समय को कम करने के कारणों के लिए, हम MCAO सर्जरी के दौरान CBF निगरानी नहीं था. लेकिन जानवरों का एक अलग समूह के साथ एक पायलट अध्ययन में, हम MCAO सर्जरी के दौरान एलडीएफ द्वारा CBF पर नजर रखी. चूहों के इस समूह में, हम लगातार सीसीए रोड़ा पहले आधारभूत की तुलना में 90% की CBF में कमी मापा. इसके अतिरिक्त, monofilaments CBF से हटाए जाने के बाद संबंधित के> 90% से बरामदसीसीए रोड़ा के बाद आधारभूत मूल्यों. ये एलडीएफ मापदंड के अनुरूप रोधगलितांश संस्करणों 7 में साहित्य और परिणाम में स्थापित कर रहे हैं. हम केवल कम से कम MCAO बाद संज्ञाहरण से वसूली के बाद से 1 के एक Bederson स्कोर था जो जानवरों शामिल थे. इसके अलावा, MCAO और जिसके बाद 72 घंटे के लिए बच गया है जो केवल जानवरों intracranial नकसीर के कोई संकेत अध्ययन में शामिल थे दिखाया.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
दोनों सीसीए (चित्रा 1) occluded थे जब हमारे BCCAO प्रोटोकॉल (> 90%) तत्काल और गहरा CBF कटौती में हुई. सीसीए के दोबारा खोलने एलडीएफ (चित्रा 1) द्वारा निगरानी के रूप में reperfusion के पूरा करने के लिए नेतृत्व किया है. पीसी के बाद, जानवरों कार्यात्मक विकलांगता के कोई संकेत नहीं दिखाया. इसके अलावा, कोई मृत्यु दर भी था. TUNEL के धुंधला जानवरों का एक अलग समूह में BCCAO के बाद 72 घंटे का प्रदर्शन किया BCCAO (नहीं दिखाया डेटा) के बाद मस्तिष्क में देरी कोशिका मृत्यु का कोई संकेत नहीं दिखाया.
आईटी (चित्रा 2) जल्दी के लिए BCCAO और MCAO के बीच इष्टतम समय में देरी के अस्थायी प्रोफ़ाइल का विश्लेषण करते हैं, हम शाम समूह (एन = 10) की तुलना में रोधगलितांश मात्रा में (65%, एन = 10 से कमी) में एक महत्वपूर्ण कमी पाई BCCAO MCAO से पहले 30 मिनट का प्रदर्शन किया गया था. BCCAO MCAO (एन = 10) के पहले 2 घंटे और 24 घंटे का प्रदर्शन किया गया था जब इसके अलावा, रोधगलितांश मात्रा में कम हो गई थी. 24 घंटा आईटी 6 की दूसरी (देरी) समय खिड़की का प्रतिनिधित्व करता है. >
इस प्रकार, यह जल्दी आईटी एक पीसी प्रोत्साहन के रूप में BCCAO का उपयोग करने के लिए इष्टतम समय खिड़की क्षणिक फोकल मस्तिष्क ischemia (MCAO) के शामिल होने से पहले 30 मिनट है कि यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है.
चित्रा 1. BCCAO और reperfusion (एन = 10) के दौरान एलडीएफ द्वारा मापा मतलब CBF मूल्यों का कोर्स.
चित्रा 2. BCCAO एन = 10/group बाद MCAO के विभिन्न समय देरी पर रोधगलितांश संस्करणों के अस्थायी प्रोफ़ाइल, रेखांकन प्रदर्शित मतलब ± मानक विचलन, दिखावा से * पी <0,05, दिखावा से ** पी <0,01 (एक तरह से एनोवा साथ Bonferroni के posthoc परीक्षण).
3 "src =" / "के लिए: सामग्री चौड़ाई =" files/ftp_upload/4387/4387fig3.jpg 6in "के लिए: src =" / files/ftp_upload/4387/4387fig3highres.jpg "/>
चित्रा 3. से व्युत्पन्न प्रतिनिधि hematoxylin से सना हुआ मस्तिष्क वर्गों एक BCCAO-preconditioned (ए) और BCCAO / दिखावा के बाद 45 मिनट MCAO 30 मिनट के लिए किए गए थे जो एक दिखावा संचालित पशु (बी),. दिमाग MCAO के बाद 72 घंटा हटाया और प्रोसेस किया गया.
4 चित्रा. BCCAO और MCAO के लिए प्रदर्शन किया प्रक्रिया सहित छोड़ दिया मन्या धमनी की नाड़ी शरीर रचना विज्ञान की योजना.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
हमारे अध्ययन में, हम BCCAO के तीन दृश्यों, हर एक मिनट के लिए स्थायी और पांच मिनट के लिए reperfusion की, जिसके बाद आईटी जल्दी प्रेरित करने के लिए एक पर्याप्त इस्कीमिक पीसी प्रेरणा हैं कि पता चला है.
इसके अलावा, हम इस्तेमाल शर्त प्रोटोकॉल कोई उल्लेखनीय पश्चात की रुग्णता के साथ एक सुरक्षित और मामूली आक्रामक प्रक्रिया, मस्तिष्क में apoptosis और कोई मृत्यु दर के कोई संकेत नहीं है कि प्रदर्शन किया है. कई अलग शर्त प्रोटोकॉल पहले 6-7,12 वर्णित किया गया है. दूसरों के लिए एक शर्त प्रोत्साहन 13-14 के रूप में BCCAO से 6 मिनट का इस्तेमाल किया है. हालांकि, तीन बार के लिए BCCAO के एक मिनट के किसी भी detectable इस्कीमिक मस्तिष्क की चोट के बिना आईटी के शुरुआती समय खिड़की में एक सुरक्षात्मक प्रभाव के परिणामस्वरूप है कि इस तथ्य के कारण, हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने का फैसला किया.
अनुरूप परिणाम, संज्ञाहरण और शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की अवधि के साथ ही पशु वजन, मस्तिष्क तापमान के रूप में अन्य चर के लिएसर्जरी के दौरान, postsurgical द्रव पुनःपूर्ति, postsurgical दर्द प्रबंधन के साथ ही पूर्व और postsurgical पिंजरे संवर्धन 15 मानकीकृत किया जाना चाहिए. हाइपोथर्मिया ही एक शर्त प्रभाव पड़ता है और इसलिए BCCAO प्रभाव 16 के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं क्योंकि विशेष रूप से ध्यान संज्ञाहरण की पूरी अवधि के दौरान चूहों के normothermic शर्तों के रखरखाव की आवश्यकता है. जाग और स्वतंत्र रूप से घूम रहा कृन्तकों में, कोर तापमान लगभग इसी मस्तिष्क तापमान 17 से अधिक सेल्सियस 0.5 के बीच और 1 डिग्री कर रहे हैं. जाग और स्वतंत्र रूप से चलती कृन्तकों में आराम मस्तिष्क तापमान 18 सेल्सियस लगभग 36.5 डिग्री कर रहे हैं. हम अपने प्रयोगों में मस्तिष्क तापमान उपाय नहीं था, हम 37.0 करने के लिए चूहों 'कोर तापमान समायोजित ± ऊपर उल्लेख आराम मस्तिष्क तापमान के समान है जो मस्तिष्क के तापमान को प्राप्त करने के लिए 0.5 डिग्री सेल्सियस दर्ज किया गया.
सैद्धांतिक रूप से, यह वाष्पशील एनेस्थेटिक्स का उपयोगयह अपने आप में isoflurane के आईटी पैदा कर सकते हैं कि प्रदर्शन किया गया है, क्योंकि स्वयं एक अतिरिक्त confounder हो सकता है. हालांकि, isoflurane संज्ञाहरण वर्तमान अध्ययन 19-21 में वर्णित प्रक्रियाओं में ऐसा नहीं था जो कई घंटे के लिए repetitively प्रशासित केवल जब एक प्रासंगिक पीसी प्रेरणा बन जाता है. इसके अलावा, हम भी isoflurane संज्ञाहरण के संभावित confounding प्रभाव के लिए नियंत्रित करने के लिए दिखावा संचालित जानवरों का विश्लेषण किया.
MCAO के शामिल होने के लिए इस्तेमाल किया monofilament के आकार और आकार एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. पा तंतु 22 गर्मी की तुलना में समान रूप से सिलिकॉन तंतु MCAO की सफलता की दर में सुधार और इस तरह subarachnoid हेमोरेज के रूप में जटिलताओं की दर में कमी शामिल है और इसलिए प्राथमिकता दी जानी चाहिए. एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु रेशा लंबाई है. 9-11 मिमी के बीच इष्टतम रेशा लंबाई 15 रिपोर्ट कर रहे हैं. हमारे चीरों सीसीए विभाजन को समीपस्थ किए गए थे कि इस तथ्य के कारण, हम एक monofilament लेन का इस्तेमाल किया13 मिमी और लगभग 200 माइक्रोन की मोटाई के gth.
साथ में ले ली, monofilament की कोटिंग और इसकी लंबाई के प्रकार और गुणवत्ता एमसीए की पर्याप्त रोड़ा सुनिश्चित करने के लिए और पूर्वकाल संवाद स्थापित धमनी के माध्यम से महत्वपूर्ण प्रतिप्रवाह से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैं. जिससे पर्याप्त रोधगलितांश मात्रा का एक अवांछित कमी में विलिस परिणाम के सर्किल के दाईं ओर से प्रतिप्रवाह और परिणाम 23 की परिवर्तनशीलता बढ़ जाती है. परिणाम परिवर्तनशीलता आगे को कम करने के इरादे से अतिरिक्त प्रक्रियात्मक standardizations एलडीएफ आधारित CBF MCAO दौरान निगरानी और reperfusion और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध औद्योगिक बने, मानकीकृत monofilaments का उपयोग शामिल है. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध monofilaments का उपयोग करके भी उनके बाँझपन सुनिश्चित किया जा सकता है.
इसके अलावा, जो जानवरों BCCAO या MCAO दौरान एक> 90% CBF कमी नहीं है, या धमनियों का फिर से खोलने shou के बाद एक> 90% reperfusion की जरूरत नहीं है जोld के अध्ययन से बाहर रखा जाएगा. इस दृष्टिकोण के आगे मुख्य रूप से मस्तिष्क जमानत संचलन में आम वेरिएंट का एक परिणाम के रूप में होता है जो रोधगलितांश संस्करणों में परिवर्तनशीलता को कम करने में मदद मिलेगी.
सारांश में, BCCAO जल्दी और देरी समय खिड़कियों में सूचना प्रौद्योगिकी के प्रभाव की जांच के लिए एक स्थापित और आसानी से लागू मॉडल है. आईटी की घटना का अध्ययन कर मस्तिष्क में अंतर्जात सुरक्षा अंतर्निहित तंत्र की एक बेहतर समझ पाने के लिए मदद करता है. परिप्रेक्ष्य में, इस तीव्र इस्कीमिक स्ट्रोक के साथ रोगियों के लिए वैकल्पिक उपचार के अवसरों को विकसित करने में मदद कर सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Light source for microscope | Zeiss | SteREO CL 1500 ECO | |
| Heating pad with rectal probe | FST | 21061-10 | |
| Stereotactic frame | David Kopf | Model 930 | |
| Scissors | FST | 91460-11 | |
| Dumont forceps #5 | FST | 11251-10 | |
| Dumont forceps #7 | FST | 11271-30 | |
| Mircovascular clamp | FST | 00398-02 | |
| Clamp applicator | FST | 00072-14 | |
| Springscissors | FST | 15372-62 | |
| Needle holder | FST | 12010-14 | |
| Needles | Feuerstein, Suprama | BER 562-20 | |
| 5-0 silk suture | Feuerstein, Suprama | ||
| 7-0 silk suture | Feuerstein,Suprama | ||
| 8-0 silk suture | Feuerstein, Suprama |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Khaja, A. M., Grotta, J. C. Established treatments for acute ischaemic stroke. Lancet. 369, 319-330 (2007).
- Foerch, C., Sitzer, M., Steinmetz, H., Neumann-Haefelin, T. Future demographic trends decrease the proportion of ischemic stroke patients receiving thrombolytic therapy: a call to set-up therapeutic studies in the very old. Stroke. 40, 1900-1902 (2009).
- Gidday, J. M. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat. Rev. Neurosci. 7, 437-448 (2006).
- Atochin, D. N., Clark, J., Demchenko, I. T., Moskowitz, M. A., Huang, P. L. Rapid cerebral ischemic preconditioning in mice deficient in endothelial and neuronal nitric oxide synthases. Stroke. 34, 1299-1303 (2003).
- Cho, S., et al. Obligatory role of inducible nitric oxide synthase in ischemic preconditioning. J. Cereb. Blood. Flow Metab. 25, 493-501 (2005).
- Kunz, A., et al. Neurovascular protection by ischemic tolerance: role of nitric oxide and reactive oxygen species. J. Neurosci. 27, 7083-7093 (2007).
- Dirnagl, U., et al. Standard operating procedures (SOP) in experimental stroke research: SOP for middle cerebral artery occlusion in the mouse. Nature Precedings. , (2010).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J. Vis. Exp. (47), e2423 (2011).
- Bederson, J. B., et al. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17, 472-476 (1986).
- Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
- Kawano, T., et al. iNOS-derived NO and nox2-derived superoxide confer tolerance to excitotoxic brain injury through peroxynitrite. J. Cereb. Blood Flow Metab. 27, 1453-1462 (2007).
- Qi, S., et al. Sublethal cerebral ischemia inhibits caspase-3 activation induced by subsequent prolonged ischemia in the C57Black/Crj6 strain mouse. Neurosci. Lett. 315, 133-136 (2001).
- Wu, C., et al. A forebrain ischemic preconditioning model established in C57Black/Crj6 mice. J. Neurosci. Methods. 107, 101-106 (2001).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent Stroke Model Guidelines for Preclinical Stroke Trials (1st Edition). J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).
- Nishio, S., et al. Hypothermia-induced ischemic tolerance. Ann. N.Y. Acad. Sci. 890, 26-41 (1999).
- DeBow, S., Colbourne, F. Brain temperature measurement and regulation in awake and freely moving rodents. Methods. 30, 167-171 (2003).
- Colbourne, F., Sutherland, G. R., Auer, R. N. An automated system for regulating brain temperature in awake and freely moving rodents. J. Neurosci. Methods. 67, 185-190 (1996).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism? Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).
- Li, L., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning improves short-term and long-term neurological outcome after focal brain ischemia in adult rats. Neuroscience. 164, 497-506 (2009).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesth. Analg. 96, 233-237 (2003).
- Spratt, N. J., et al. Modification of the method of thread manufacture improves stroke induction rate and reduces mortality after thread-occlusion of the middle cerebral artery in young or aged rats. J. Neurosci. Methods. 155, 285-290 (2006).
- Zarow, G. J., Karibe, H., States, B. A., Graham, S. H., Weinstein, P. R. Endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in rats: effect of suture insertion distance on cerebral blood flow, infarct distribution and infarct volume. Neurol. Res. 19, 409-416 (1997).
