Summary
Xenopus Eiextrakt ist ein nützliches Modellsystem, um die DNA-Schäden Prüfpunkt untersuchen. Dieses Protokoll ist für die Herstellung von Xenopus Ei-Extrakten und DNA-Schaden induzierenden Prüfpunkt Reagenzien. Diese Techniken sind an eine Vielzahl von DNA-schädigenden Ansätze in der Untersuchung der DNA-Schädigung Prüfpunkt Signalisierung.
Abstract
Auf einer täglichen Basis, werden die Zellen zu einer Vielzahl von endogenen und Umwelteinflüssen ausgesetzt. Um diese Beleidigungen zu bekämpfen, haben Zellen DNA damage checkpoint Signalisierung als Überwachungs-Mechanismus, um DNA-Schäden und direkte zelluläre Antworten auf DNA-Schäden spüren entwickelt. Es gibt mehrere Gruppen von Proteinen namens Sensoren, Wandlern und Effektoren in DNA damage checkpoint-Signalisierung (Abbildung 1) beteiligt. In diesem komplexen Signalwegs ist ATR (ATM und Rad3-bezogen) einer der wichtigsten Kinasen, die zu DNA-Schädigungen und Replikation Streß reagieren. Activated ATR kann phosphorylieren seine nachgelagerten Substrate wie Chk1 (Checkpoint Kinase 1). Folglich phosphoryliert und aktiviert Chk1 führt zu viele stromabwärts Wirkungen in der DNA-Schädigung Prüfpunkt einschließlich Zellzyklusarrest, Transkriptionsaktivierung, DNA-Schäden zu reparieren und Apoptose oder Seneszenz (Abbildung 1). Wenn DNA beschädigt ist, es nicht die DNA damage checkpoint Ergebnisse in UNREP aktivierenausgestrahlt Schäden und anschließend genomische Instabilität. Die Untersuchung der DNA damage checkpoint wird klären, wie Zellen genomischen Integrität zu erhalten und ein besseres Verständnis davon, wie Krankheiten, wie Krebs, zu entwickeln.
Xenopus laevis Ei Extrakte werden als starke zellfreien Extrakt Modellsystem in DNA-Schädigung Prüfpunkt Forschung entstehen. Low-Speed-Extrakt (LSE) wurde ursprünglich von der Masui Gruppe 1 beschrieben. Die Zugabe von demembranated Spermienchromatin LSE Ergebnisse in Keimbildung, wo DNA in einem semikonservativen fashion einmal pro Zellzyklus repliziert wird.
Die ATR/Chk1-mediated Checkpoint-Signalweg ist durch DNA-Schädigung oder Replikation Stress 2 ausgelöst. Zwei Methoden werden derzeit verwendet, um die DNA damage checkpoint induzieren: DNA-schädigende Ansätze und DNA-Schäden-ähnlichen Strukturen 3. DNA-Schädigung durch Ultraviolett (UV)-Bestrahlung, γ-Bestrahlung, induziert werden Methyl methanesulfonate (MMS), Mitomycin C (MMC), 4-nitrochinolin-1-oxid (4-NQO) oder Aphidicolin 3, 4. MMS ist ein Alkylierungsmittel, das DNA-Replikation hemmt und aktiviert der DNA-Schädigung ATR/Chk1-mediated Prüfpunkt 4-7. UV-Bestrahlung löst auch die ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. Die DNA-Schädigung nachahmende Struktur AT70 ist ein Komplex aus zwei getemperten Oligonukleotide Poly-(dA) 70 und Poly-(dT) 70. Die AT70 System wurde Bill Dunphy Labor entwickelt und wird häufig verwendet, um ATR/Chk1 Checkpoint Signalisierung 9-12 induzieren.
Hier beschreiben wir Protokollen (1) bis zellfreie Extrakte Ei (LSE) herzustellen, (2) an Xenopus Spermienchromatinstruktur mit zwei verschiedenen DNA schädigen Ansätze (MMS und UV), (3) zu behandeln, um die DNA-Schäden-nachahmende Struktur vorzubereiten AT70, und (4) die DNA-Schädigung ATR/Chk1-mediated Prüfpunkt in LSE mit beschädigten Spermienchromatinstruktur oder einem DNA-Schaden-nachahmende Struktur auslösen.
Protocol
Ein. LSE Vorbereitung
- Female Fröschen (Xenopus laevis) zweimal für Eiersammlung injiziert. Die erste Injektion (Grundierung) 100 U PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) pro Frosch. Frösche muss grundiert mindestens zwei Tage vor induzierende Eiablage und grundiert Frösche sind geeignet für bis zu zwei Wochen. Um prime Frösche, injizieren PMSG subkutan in die dorsale Lymphsäcke mit einem 3 ml-Spritze und 27 G Nadel.
- Um Eiablage zu induzieren, zu injizieren 500 U hCG (humanes Chorion Gonadotropin) pro grundiert frog subkutan in die dorsale Lymphsäcke mit einer 27 G Nadel. Inkubieren injizierten Frösche in separaten Eimer mit 2 Liter 1x Marcs modifizierte Ringer-Lösung (MMR). Lassen Frösche 14-20 hr Eier vor der Abholung zu legen.
- Entfernen Sie die Frösche aus den Eimern und gießen Sie das MMR-Lösung bis etwa 100 ml übrig ist. Erhalten Eier von den Schaufeln durch Übertragen Eier in einen 250 ml-Becher.
- Dejelly Eier durch Zugabe von 100 ml 2% Cystein (EinstellungpH-Wert auf 7,8 mit 10 M KOH). Vorsichtig schwenken die Eier mit einem umgekehrten Glas Pasteur Pipette (0,7 cm Durchmesser) etwa alle 30 Sekunden. Dekantieren und ersetzen mit frischen Cystein zweimal während der Inkubation. Die dejellying abgeschlossen ist in etwa 5-15 Minuten, wenn die Eier einen kondensierten Schicht am Boden des Bechers zu bilden.
- Entsorgen Sie die Cystein-Lösung und waschen Eier dreimal mit 0,25 x MMR. Swirl die Eier in der Lösung durch eine Glaspipette. "Bad" Eier werden durch einfache Sichtprüfung bestimmt und sind "puffy" weißes Aussehen. Die "schlechten" Eier in der Mitte des Bechers nach wirbelnden ansammeln. Entfernen Sie "schlechte" Eier von einer Pasteur-Pipette.
- Waschen Sie Eier mit Ei Lysis Buffer (ELB) dreimal. Entfernen Sie alle zusätzlichen "schlechte" Eier von einer Pasteur-Pipette. Gießen Eier in eine 14 ml-Falcon-Röhrchen.
- Drehen Sie das Falcon-Röhrchen für 55 sec bei 188 xg (1.100 rpm) mit dem CL2 IEC klinischen Tischzentrifuge mit einem Ausschwingrotor, um die Eier zu verdichten. Entfernen Sie das überschüssige Puffer aus derSpitze des Ei-Schicht. Fügen Sie 0,5 ul Aprotinin / Leupeptin Lager und 0,5 ul Cytochalasin B Bestand pro ml des verdichteten Eier.
- Zentrifuge Eier bei 16.500 × g (10.000 UpM) für 15 min bei 4 ° C unter Verwendung des Sorvall RC6 zuzüglich superspeed Zentrifuge mit HB6 Ausschwingrotor. Nach Zentrifugation fraktioniert sind Eier in drei Schichten in der Röhre: Lipid-Extrakt, und Dotter / Pigment von oben nach unten sind. Punktieren der Seite des Falcon-Röhrchen in dem unteren Abschnitt der mittleren Schicht mit einem Extrakt 21 G Nadel. Entfernen Sie vorsichtig die Nadel die Punktionsnadel durch Kunststoff verbaut werden kann. Legen einen neuen 21 G Nadel, die an einer 1 ml-Spritze in die Punktionsstelle, um den Extrakt zu sammeln. Langsam absaugen Extrakt in die Spritze, um Luftblasen und Verunreinigungen mit der Lipid-und Eigelb / Pigment Schichten zu vermeiden.
- Legen Sie die Extrakte in ein gekühltes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Für jeden Milliliter Ei-Extrakt, fügen Sie die folgende chemische Stammlösungen der insyndizierte Endkonzentration (in Klammern): (1) 10 ul Cycloheximid (100 ug / ml); (2) 1 ul Aprotinin / Leupeptin (10 ug / ml); (3) 1 ul Cytochalasin B (5 pg / ml ); (4) 1 ul Dithiothreitol (1 mM) und (5) 0,33 ul Nocodazol (3 pg / ml). Invert das Ei zu extrahieren mindestens 10 mal sanft. Dies ist die LSE, die frisch zubereitet werden müssen und innerhalb von 4 Stunden. Die Qualität der LSE wird nach 4 h oder Frost-Tau beeinträchtigt.
2. Treatment of Sperm Chromatin mit DNA-schädigenden Approaches
- Planen normalen Spermienchromatinstruktur gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren 13.
- Bereiten Sie MMS-behandelten Spermienchromatin
- Resuspendieren normalen Spermienchromatin in 0,5 ml Puffer X.
- Fügen Sie ~ 5,5 ul von MMS (9,1 M in stock) zu 500 ul resuspendiert Chromatin zu einer Endkonzentration von 100 mM.
- Inkubieren Spermienchromatinstruktur in Mikrozentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur für 30 min mit der Drehung.
- Drehen Sie das microcentrifuge Rohr bei 686 xg (2.100 rpm) für 10 min bei Raumtemperatur mit dem IEC CL2 klinischen Zentrifuge mit Ausschwingrotor und Rohradapter.
- Überstand verwerfen und das Pellet in 0,5 ml Puffer X plus BSA (3%), DTT (0,1 mM) und Aprotinin / Leupeptin (10 ug / ml).
- Wiederholen Sie die Schritte (4) und (5) zweimal, um die Spermienchromatin waschen.
- Bestimmung der Konzentration von Spermien Chromatin mit einem Hämozytometer und verdünnt auf 100.000 Spermien / ul. Sparen mit 5 ul Aliquots in -80 ° C Gefrierschrank zur weiteren Verwendung.
- Bereiten UV-behandelten Spermienchromatin
- Hinzufügen gewünschter Betrag (z. B. 10 ul) von normalen Spermienchromatinstruktur auf der Oberfläche eines Stücks Parafilm.
- Legen Sie die Parafilm in einem UV-Crosslinker. Stellen Sie die gewünschte Energie-Parameter, je nach Experiment, und beginnen, die Spermienchromatin via UV-Licht beschädigt werden. Beispielsweise dauert es etwa 21 Sekunden bis 1.000 J / m 2 zu erreichen.
- Nach der UV-Bestrahlungsstrahlung, UV-behandelten Spermienchromatin sollten Ei Extrakte sofort gutgeschrieben.
3. Herstellung eines DNA-Damage-nachahmende Struktur (AT70)
- Aufzulösen zwei synthetische Oligonukleotide Poly-(dA) 70 (bezeichnet als A70) und Poly-(dT) 70 (bezeichnet als T70) in Wasser auf eine Konzentration von 2 ug / ul sind.
- Fügen Sie 100 ul A70 und 100 ul T70 zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Sieden gemischten synthetischen Oligo-Lösung für 5 min bei 95 ° C in einem heatblock.
- Nehmen Sie die Trockenbad Block aus (mit dem Rohr mit AT Mischung davon), und lassen Sie es abkühlen auf Raumtemperatur auf einem Labortisch. Diese Temperatureinstellung dauert etwa 45-60 min.
- Das abgekühlte Gemisch wird AT70 mit einer endgültigen Konzentration von 2 ug / ul. Shop 10 ul AT70 Aliquots bei -20 ° C Gefrierschrank zur weiteren Verwendung.
4. Das Auslösen der DNA Damage Checkpoint in LSE mit Damaged Sperm Chromatin oder DNA-Schäden-Ähnlichen Struktur
- DNA-Schädigung induziert Checkpoint in LSE mit beschädigten Spermienchromatin
- Fügen Sie 50 ul LSE zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und ergänzen Sie es mit 1 ul of Energy Mischung und 2 ul beschädigten Spermien Chromatin (Endkonzentration ~ 4.000 Spermien / ul Reaktion).
- Inkubieren das Reaktionsrohr bei Raumtemperatur für 90 min und Flick das Rohr alle 10 min.
- Dispense 1 ul Reaktionsgemisch auf einen Objektträger mit 1 ul der nuklearen Farbstofflösung nach 30-minütiger Inkubation ergänzt. Legen Sie ein Deckglas über dem Reaktionsgemisch und überprüfen Keimbildung über Fluoreszenz-Mikroskop. Typischerweise wird rundkernigen nach 30 min Inkubation bilden, der angibt, DNA-Replikation initiiert.
- Nehmen Sie sich 10 ul des Reaktionsgemisches in 90 ul Probenpuffer. Die Proben werden mittels Immunoblot mit anti-Chk1 P-S344 oder Anti-Chk1 Antikörpern analysiert.
- DNA-Schädigung induziert Checkpoint in LSE mit derAT70
- Fügen Sie 50 ul LSE zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ul of Energy Mischung und 1,6 ul Tautomycin Lager ergänzt.
- Hinzufügen 1,25 ul von vorgefertigten AT70 (2 ug / ul) oder Wasser (als negative Kontrolle) zu jeder Reaktion. Inkubieren der Reaktionen bei Raumtemperatur für 90 min. Flick die Reaktionsrohre alle 10 min.
- Fügen Sie 10 ul des Reaktionsgemisches in 90 ul Probenpuffer. Die Proben werden mittels Immunoblot mit anti-Chk1 P-S344 oder Anti-Chk1 Antikörper untersucht.
5. Repräsentative Ergebnisse
Die beschädigten Spermien Chromatin oder DNA-Schäden-ähnlichen Struktur kann die ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in der Xenopus Ei-Extrakt auszulösen. 2A zeigt, dass MMS Chk1 Phosphorylierung an Ser344 (Chk1 P-S344), die ein Indikator für ist induziert ATR-Kinase-Aktivierung. 2B zeigt, dass AT70, als DNA-Schäden-ähnlichen structure, löst auch Chk1 Phosphorylierung. Insgesamt Chk1 Proben werden als Be-Kontrollen in beiden Beispielen verwendet.
Abbildung 1. Ein Diagramm der DNA-Schädigung Prüfpunkt Signalisierung.
Abbildung 2. Chk1 Phosphorylierung wird durch entweder MMS oder AT70 Behandlungen in Xenopus-Extrakten Ei induziert. (A) MMS-geschädigter Spermienchromatinstruktur (MMS) oder normale Spermienchromatinstruktur (Con) in Ei Extrakte werden für 90 min inkubiert. Chk1 Phosphorylierung an Ser344 (Chk1 P-S344) und insgesamt Chk1 in Ei-Extrakte werden über Immunoblot untersucht. (B) AT70 oder Wasser (Con) in Ei-Extrakten zugegeben. Proben werden auch über Immunoblotting, wie in (A) analysiert.
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Discussion
Es gibt mehrere Vorteile bei der Untersuchung der DNA-Schädigung unter Verwendung Prüfpunkt Xenopus Ei-Extrakten. Die Verwendung von Ei-Extrakten stellt eine große Menge von zellfreien Extrakten in Interphase des Zellzyklus synchronisiert. Die Ei-Extrakten kann leicht und kostengünstig hergestellt werden. Es ist relativ leicht zu DNA oder Chromatin beschädigen und einen Defekt in der DNA-Schädigung Checkpoint nach immunodepleting eines Zielproteins aus Eiextrakt offenbaren. Anschließend kann eine potentielle Funktion Defekt "gerettet" werden, indem addback von Wildtyp-oder mutierten rekombinanten Proteinen. Daher ist Xenopus Ei-Extrakt ein leistungsfähiges Modellsystem für Struktur und Funktion Analyse von DNA damage checkpoint.
Die LSE Zubereitung wurde bisher 14 zeigte aber unser Protokoll hat einige Änderungen. Die Temperatur der Inkubation Fröschen nach hCG-Injektion (18 ° C) ist sehr wichtig für die Eiablage. Mehr Ressourcen der Handhabung und Injizieren Frösche gefunden werden könnenaus früheren Studien 13,14 und über das Internet, wie tropicalis.berkeley.edu / home / obtaining_embryos / hcg / hCG.html . Generell kann 1-3 ml LSE aus Eiern von einem Frosch abgeleitet vorbereitet werden. Es dauert etwa eine Stunde, um die LSE vorzubereiten und es ist in der Regel auf Eis stabil ca. 4 Stunden. LSE muss frisch hergestellt werden, wenn sie seit Einfrieren und Auftauen Kompromisse die Qualität des LSE zur Verwendung in DNA-Schädigung Prüfpunkt Versuche benötigt wird. In Schritt 1,9, empfehlen wir, Stammlösungen, spart Aliquots in Gefrierschränken und mit gefrorenen aliquotierten Aktien für jede Chemikalie. Nach unserer Erfahrung sind diese Aliquots nutzbar für bis zu 3 Gefrier-Auftau-Zyklen.
DNA-schädigende Reagenzien wie MMS wurden in LSE worden zum Auslösen Chk1 Phosphorylierung (siehe 2A) untersucht. DNA-schädigende Reagenzien können entweder direkt an LSE hinzugefügt werden oder verwendet werden, um sp beschädigenerm Chromatin vor der Zugabe zu LSE. Die Konzentration von DNA-schädigenden Reagenzien werden wahrscheinlich brauchen, um nach bestimmten Experimenten optimiert werden, um die besten Voraussetzungen, um Chk1 Phosphorylierung auslösen zu erhalten. UV-Bestrahlung können auch zu Beschädigungen und Spermienchromatinstruktur Studie Aktivierung der DNA-Schädigung über Prüfpunkt Chk1 Phosphorylierung (Daten nicht gezeigt) verwendet werden. Die Chk1 Phosphorylierungsstelle Ser344 in Xenopus ist das konservierte Website analog Chk1 Ser345 beim Menschen 8.
Das synthetische Oligo AT70 Mischung ahmt die Struktur der DNA-Schäden. In Gegenwart Tautomycin (eine Phosphatase-Inhibitor) wird AT70-induzierte Phosphorylierung Chk1 stabilisiert und kann über Immunoblotting (wie in 2B gezeigt) geprüft werden. Die gesamte endogene Chk1 wird als Ladekontrolle verwendet. AT70 löst eine mobility shift insgesamt Chk1, die visualisiert werden können auf einem Western-Blot, der angibt, Chk1 phosphoryliert ist. Antikörper gegen Chk1 Phosphorylierungund insgesamt Chk1 eignen sich für Immunoblot Analyse von DNA damage checkpoint Signalisierung in Xenopus.
Insgesamt ist das Xenopus Eiern Extrakte System eine leistungsfähige zellfreien Modellsystem, um die DNA-Schäden Prüfpunkt untersuchen. Dieses Protokoll bietet der Modalitäten für eine solche Analyse. Dieses System kann moduliert werden, um die molekularen Mechanismen der DNA-Schädigung Prüfpunkt unter Verwendung einer Vielzahl von unterschiedlichen DNA-schädigende Ansätze studieren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird teilweise durch Mittel von der University of North Carolina in Charlotte, Wachovia Stiftungsfonds für Dozenten excellence, und einem Zuschuss von NIGMS (R15GM101571) vorgesehen ist.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Anti-Chk1 P-S344 antibody | Cell Signaling | 2348L | |
| Anti-Chk1 antibody | Santa Cruz | SC7898 | |
| Aprotinin | MP Biomedicals | 0219115880 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-5G | |
| Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
| Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
| hCG | Sigma | CG10-10VL | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-1KG | |
| Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
| Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
| Nocodazole | Sigma | M1404-2MG | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Sample buffer | Sigma | S3401 | |
| Tautomycin | Wako Chemicals USA | 209-12041 | |
| Equipment | |||
| Bucket for egg laying | Rubbermaid commercial products | 6308 | |
| CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 004260F | |
| HB6 swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
| Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| UV crosslinker | UVP | 95-0174-01 | |
| Solutions | |||
| 1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH | ||
| Aprotinin/Leupeptin stock | 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Buffer X | 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl | ||
| Cycloheximide stock | 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| Cytochalasin B stock | 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C. | ||
| Dithiothreitol (DTT) stock | 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| ELB | 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 | ||
| Nocodazole stock | 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Energy Mixture | 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C. | ||
| Nuclear dye solution | 0.4 μg/ml H–chst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS | ||
| Tautomycin stock | 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C. | ||
References
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