Summary
Xenopus egg ekstrakt er et nyttig modellsystem for å undersøke DNA-skader sjekkpunkt. Denne protokollen er for utarbeidelse av Xenopus egg ekstrakter og DNA-skade checkpoint inducing reagenser. Disse teknikkene kan tilpasses en rekke DNA skadelige tilnærminger i studiet av DNA skade sjekkpunkt signalering.
Abstract
På en daglig basis, blir cellene utsatt for en rekke av endogene og miljømessige fornærmelser. For å bekjempe disse fornærmelser, har cellene utviklet seg DNA-skader sjekkpunkt signaliserer som overvåking mekanisme for å oppfatte DNA skade og direkte cellulære responser til DNA-skader. Det er flere grupper av proteiner som kalles sensorer, givere og effektbokser involvert i DNA-skader sjekkpunkt signalering (figur 1). I dette komplekset signalveien, er ATR (ATM og Rad3-relatert) en av de store kinaser som kan svare på DNA skade og replikering stress. Aktivert ATR kan phosphorylate sine nedstrøms underlag som Chk1 (Checkpoint kinase 1). Følgelig fosforylert og aktiveres Chk1 fører til mange nedstrøms effekter i DNA skade sjekkpunkt inkludert cellesyklus, transkripsjon aktivering, DNA skade reparasjon, og apoptose eller senescence (figur 1). Når DNA er skadet, unnlater å aktivere DNA-skade sjekkpunkt resultater i unrepluftes skader og senere, genomisk ustabilitet. Studiet av DNA skade sjekkpunkt vil belyse hvordan cellene opprettholde genomisk integritet og gir en bedre forståelse av hvordan menneskelige sykdommer, så som kreft, utvikle.
Xenopus laevis egg ekstrakter er fremstår som en kraftig celle-ekstrakt modellsystem i DNA-skader sjekkpunkt forskning. Lav hastighet ekstrakt (LSE) ble opprinnelig beskrevet av Masui gruppe 1. Tilsetningen av demembranated sperm kromatin til LSE resulterer i kjerner formasjonen der DNA er replikert i en semiconservative mote gang per cellesyklus.
Den ATR/Chk1-mediated sjekkpunkt signalveien er utløst av DNA-skader eller replikering stress 2. To metoder brukes i dag til å indusere DNA skade sjekkpunkt: DNA skadelige tilnærminger og DNA skade-etterligne strukturer tre. DNA-skade kan induseres ved ultrafiolett (UV) stråling, γ-bestråling, metyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitrokinolin-1-oksyd (4-NQO), eller Aphidicolin 3, 4. MMS er et alkylerende agent som hemmer DNA replikasjon og aktiverer ATR/Chk1-mediated DNA skade sjekkpunkt 4-7. UV bestråling utløser også ATR/Chk1-dependent DNA skade sjekkpunkt 8. DNA skade-etterligne strukturen AT70 er en annealed kompleks av to oligonukleotider poly-(dA) 70 og poly-(dT) 70. Den AT70 systemet ble utviklet i Bill Dunphy laboratorium og er mye brukt for å indusere ATR/Chk1 checkpoint signalering 9-12.
Her beskriver vi protokoller (1) for å forberede cellefri egg ekstrakter (LSE), (2) å behandle Xenopus sperm kromatin med to forskjellige DNA skade tilnærminger (MMS og UV), (3) for å forberede den DNA skade-etterligne strukturen AT70, og (4) for å utløse ATR/Chk1-mediated DNA skade sjekkpunkt i LSE med skadet sperm kromatin eller en DNA skade-etterligne struktur.
Protocol
1. LSE Forberedelse
- Kvinnelige frosker (Xenopus laevis) er injisert to ganger for egg samling. Den første injeksjonen (priming) er 100 U PMSG (gravid Mare Serum gonadotropin) per frosk. Frosker må primes minst to dager før inducing egglegging og primet froskene er holdbare i opptil to uker. Å prime frosker, injisere PMSG subkutant i rygg lymph sacs med en 3 ml sprøyte og 27 G nål.
- Å indusere egglegging, injisere 500 U hCG (humant koriongonadotropin) per primet frosk subkutant i rygg lymph sacs med en 27 G kanyle. Inkuber injisert frosker i separate skuffer som inneholder 2 liter 1x Marc modifiserte Ringers oppløsning (MMR). Tillat frosker 14-20 hr å legge egg før samlingen.
- Fjern froskene fra bøtter og hell av MMR-løsning til rundt 100 ml som er igjen. Hente ut egg fra bøtter ved å overføre egg til en 250 ml begerglass.
- Dejelly egg ved å tilsette 100 ml av 2% cystein (justerpH til 7,8 med 10 M KOH). Snurr eggene med en invertert glass Pasteur pipette (0,7 cm i diameter) omtrent hver 30 sek. Dekanter og erstatte med frisk cystein to ganger under inkubering. Den dejellying prosessen er fullført i ca 5-15 minutter når eggene danner en mer kondensert lag på bunnen av begerglasset.
- Kast cystein løsningen og vask egg tre ganger med 0,25 x MMR. Virvel eggene i løsningen av et glass pipette. "Bad" egg bestemmes av enkel visuell inspeksjon og er "puffy" hvit i utseende. "Dårlig" egg vil akkumuleres i sentrum av begerglasset etter omvirvling. Fjern "dårlige" egg av en Pasteur pipette.
- Vask egg med Egg Lysis Buffer (ELB) tre ganger. Fjern eventuelle ekstra "dårlige" egg av en Pasteur pipette. Hell eggene i en 14 ml Falcon-rør.
- Spinn Falcon tube for 55 sek på 188 xg (1100 rpm) med CL2 IEC klinisk table-top sentrifuge med en svingende spannrotor å komprimere eggene. Fjern overflødig buffer fratoppen av egget laget. Tilsett 0,5 pl Aprotinin / Leupeptin lager og 0,5 pl Cytochalasin B lager per ml sammenpressede egg.
- Sentrifuger egg på 16.500 xg (10.000 opm) i 15 min ved 4 ° C ved hjelp av Sorvall RC6 pluss SuperSpeed sentrifuge med HB6 svingende spannrotor. Etter sentrifugering, egg er fraksjonert i tre lag i røret: lipid, ekstrakt, og eggeplomme / pigment fra topp til bunn, henholdsvis. Punktering siden av Falcon røret i den nedre delen av den midterste ekstrakt laget med en 21 G nål. Fjernes kanylen forsiktig som punktering nålen bli hindret av plast. Sett en frisk 21 G nål festet til en 1 ml sprøyte inn stikkestedet å samle ekstraktet. Langsomt Aspirer ekstraktet inn sprøyten for å unngå luftbobler og kontaminering med lipid og eggeplomme / pigment lag.
- Plasser ekstrakter i et avkjølt 1,5 ml mikrosentrifugerør. For hver milliliter egg ekstrakt, legger du til følgende kjemiske lager løsninger til idicated sluttkonsentrasjon (vist i parentes): (1) 10 pl Cycloheximide (100 ug / ml), (2) 1 ul Aprotinin / Leupeptin (10 ug / ml hver), (3) 1 ul Cytochalasin B (5 ug / ml ), (4) 1 ul Dithiothreitol (1 mM), og (5) 0,33 ul Nocodazole (3 ug / ml). Snu egget trekke minst 10 ganger forsiktig. Dette er LSE, som må bli gjort frisk og brukes innen 4 timer. Kvaliteten på LSE er kompromittert etter 4 timers eller fryse-tine.
2. Behandling av sæd Chromatin med DNA Skadelige Approaches
- Forbered normal sperm kromatin i henhold til metoden beskrevet tidligere 13.
- Forbered MMS-behandlet sperm kromatin
- Resuspender normal sperm kromatin i 0,5 ml Buffer X.
- Legg ~ 5,5 pl MMS (9.1 M i lager) til 500 pl resuspendert kromatin til en endelig konsentrasjon på 100 mM.
- Inkuber sperm kromatin i mikrosentrifugerør ved romtemperatur i 30 min med rotasjon.
- Spinn microcentrifuge røret på 686 xg (2100 opm) i 10 min ved romtemperatur ved hjelp av IEC CL2 klinisk sentrifuge med svingende spannrotor og tube adaptere.
- Kast supernatanten og resuspender pelleten i 0,5 ml Buffer x pluss BSA (3%), DTT (0,1 mM) og aprotinin / Leupeptin (10 ug / ml hver).
- Gjenta trinnene (4) og (5) to ganger for å vaske sperm kromatin.
- Bestemme konsentrasjonen av spermier kromatin med hemocytometer og fortynn til 100.000 sædceller / pl. Spar 5 pl alikvoter i -80 ° C fryser for videre bruk.
- Forbered UV-behandlet sperm kromatin
- Legg ønsket mengde (f.eks 10 ul) av normal sperm kromatin på overflaten av et stykke av Parafilm.
- Plasser Parafilm inn en UV tverrbinder. Still ønsket energi parameter, avhengig eksperimentet, og begynner å skade sperm kromatin via UV-lys. For eksempel tar det omtrent 21 sek for å nå 1000 J / m 2.
- Etter UV irradiation, UV-behandlet sperm kromatin bør legges til egg ekstrakter umiddelbart.
3. Utarbeidelse av en DNA Damage-etterligne Structure (AT70)
- Oppløs to syntetiske oligonukleotider poly-(dA) 70 (betegnet som A70) og poly-(dT) 70 (betegnet som T70) i vann til en konsentrasjon på 2 ug / ul, henholdsvis.
- Legg 100fil A70 og 100fil T70 til en 1,5 ml mikrosentrifuge-rør. Koke blandet syntetisk oligo løsning i 5 min ved 95 ° C i en heatblock.
- Ta den tørre bad blokken ut (med rør som inneholder AT blanding i det), og la det avkjøles til romtemperatur på en lab benk. Denne justering av fargetemperatur tar rundt 45-60 min.
- Den avkjølte blanding er AT70 med en endelig konsentrasjon på 2 ug / ul. Butikk 10 pl AT70 aliquoter i -20 ° C fryser for videre bruk.
4. Utløser DNA Damage Checkpoint i LSE med skadet Sperm Chromatin eller en DNA Damage-Etterligne Struktur
- Indusere DNA skade sjekkpunkt i LSE med skadet sperm kromatin
- Tilsett 50 pl av LSE til et 1,5 ml mikrosentrifugerør, og utfyller det med 1 ul Energy stoffblandingen og 2 ul av skadet sperm kromatin (sluttkonsentrasjon ~ 4.000 sædceller / mikroliter reaksjon).
- Inkuber reaksjonsrøret ved romtemperatur i 90 min og flick røret hvert 10 min.
- Dispenser 1 ul av reaksjonsblandingen på en objektglass supplert med 1 pl av kjernefysisk fargeløsning etter 30-min inkubering. Plasser en dekkglass over reaksjonsblandingen og sjekk for kjerner formasjonen via fluorescensmikroskop. Vanligvis vil runde kjerner dannes etter 30 min inkubering, indikerer DNA replikasjon har innledet.
- Ta 10 ul av reaksjonsblandingen i 90 pl prøvebuffer. Prøvene analyseres via immunoblotting bruker anti-Chk1 P-S344 eller anti-Chk1 antistoffer.
- Indusere DNA skade sjekkpunkt i LSE medAT70
- Tilsett 50 pl av LSE til et 1,5 ml mikrosentrifugerør supplert med 1 ul Energy stoffblandingen og 1,6 pl Tautomycin lager.
- Legg 1,25 pl ferdiglagde AT70 (2 ug / ul) eller vann (som negativ kontroll) til hver reaksjon. Inkuber reaksjonene ved romtemperatur i 90 minutter. Flick reaksjonsrørene hvert 10 min.
- Tilsett 10 pl av reaksjonsblandingen over i 90 pl prøvebuffer. Prøver er undersøkt via immunoblotting bruker anti-Chk1 P-S344 eller anti-Chk1 antistoffer.
5. Representant Resultater
Den skadede sperm kromatin eller DNA skade-etterligne strukturen kan utløse ATR/Chk1-mediated DNA skade kontrollpost i Xenopus egg avtrekksystem. Figur 2A viser at MMS induserer Chk1 fosforylering ved Ser344 (Chk1 P-S344), som er en indikator for ATR kinase aktivering. Figur 2B viser at AT70, som DNA skade-etterligne structure, utløser også Chk1 fosforylering. Sum Chk1 prøvene brukes som lasting kontroller i begge eksempler.
Figur 1. Et diagram av DNA skade sjekkpunkt signalering.
Figur 2. Chk1 fosforyleringen er indusert av enten MMS eller AT70 behandlinger i Xenopus egg ekstrakter. (A) MMS-skadet sperm kromatin (MMS) eller normal sperm kromatin (Con) inkuberes i egg ekstrakter i 90 min. Chk1 fosforylering på Ser344 (Chk1 P-S344) og totalt Chk1 i egg ekstrakter blir undersøkt via immunoblotting. (B) AT70 eller vann (Con) er lagt inn i egg ekstrakter, henholdsvis. Prøvene er også analysert via immunoblotting som i (A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere fordeler ved å studere DNA skade sjekkpunkt med Xenopus egg ekstrakter. Bruken av egg ekstrakter gir en stor mengde celle-frie ekstrakter synkronisert ved interfase av cellesyklus. Egg ekstrakter kan enkelt og billig gjort. Det er relativt lett å skade DNA eller kromatin og for å avdekke en feil i DNA skade sjekkpunkt etter immunodepleting et mål protein fra egg ekstrakt. Deretter kan en potensiell funksjon defekt bli "reddet" av addback av vill type eller mutant rekombinante proteiner. Derfor er Xenopus egg ekstrakt et kraftig modellsystem for struktur og funksjon analyse av DNA-skade sjekkpunkt.
LSE Preparatet har blitt demonstrert tidligere 14, men vår protokoll har noen modifikasjoner. Temperaturen av inkubering frosker etter hCG-injeksjonen (18 ° C) er meget viktig for å legge egg. Mer ressurser for å håndtere og injisere frosker kan bli funnetfra tidligere studier 13,14 og på internett som tropicalis.berkeley.edu / home / obtaining_embryos / hCG / hCG.html . Vanligvis kan 1-3 ml LSE fremstilles fra egg avledet fra en frosk. Det tar omtrent en time for å forberede LSE og det er typisk stabil på is i ca 4 timer. LSE må gjøres frisk når det er nødvendig siden frysing og tining kompromisser kvaliteten LSE for bruk i DNA-skade checkpoint eksperimenter. I trinn 1.9, anbefaler vi gjør stamløsninger, sparer alikvoter i frysere, og bruker frosne alikvoteres aksjer for hver kjemisk. I vår erfaring, disse alikvoter er holdbare i opptil tre fryse-tine sykluser.
DNA skadelige reagenser som MMS er undersøkt i LSE for å utløse Chk1 fosforylering (se figur 2A). DNA skadelige reagenser kan enten tilsettes direkte til LSE eller brukt til å skade sperm kromatin før tillegg til LSE. Konsentrasjonen av DNA skadelige reagenser vil mest sannsynlig må være optimalisert for bestemte eksperimenter for å få de beste forutsetninger for å utløse Chk1 fosforylering. UV-bestråling kan også benyttes for å skade sæden kromatin og studie aktivering av DNA skade sjekkpunkt via Chk1 fosforylering (data ikke vist). Den Chk1 fosforyleringssetet Ser344 i Xenopus er bevart område analog til Chk1 Ser345 hos mennesker åtte.
Den syntetiske oligo AT70 blanding etterligner strukturen til DNA skade. I nærvær av Tautomycin (en fosfatase-inhibitor), er AT70-indusert Chk1 fosforylering stabilisert og kan undersøkes via immunoblotting (som vist på figur 2B). Den totale endogen Chk1 brukes som en lasting kontroll. AT70 utløser en mobilitet skifte i total Chk1 som kan visualiseres på en Western blot, indikerer Chk1 er fosforylert. Antistoffer mot Chk1 fosforyleringog total Chk1 er egnet for immunoblotting analyse av DNA-skade sjekkpunkt signalering i Xenopus.
Samlet er Xenopus egget ekstrakter systemet en kraftig celle-fri modellsystem for å undersøke DNA skade sjekkpunkt. Denne protokollen gir detaljerte prosedyrer for slike analyser. Dette systemet kan være modulert for å studere de molekylære mekanismene av DNA skade sjekkpunkt hjelp av en rekke forskjellige DNA skadelige tilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes delvis av midler fra The University of North Carolina i Charlotte, Wachovia grunnlaget fond for fakultetet excellence, og en bevilgning fra NIGMS (R15GM101571).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Anti-Chk1 P-S344 antibody | Cell Signaling | 2348L | |
| Anti-Chk1 antibody | Santa Cruz | SC7898 | |
| Aprotinin | MP Biomedicals | 0219115880 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-5G | |
| Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
| Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
| hCG | Sigma | CG10-10VL | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-1KG | |
| Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
| Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
| Nocodazole | Sigma | M1404-2MG | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Sample buffer | Sigma | S3401 | |
| Tautomycin | Wako Chemicals USA | 209-12041 | |
| Equipment | |||
| Bucket for egg laying | Rubbermaid commercial products | 6308 | |
| CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 004260F | |
| HB6 swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
| Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| UV crosslinker | UVP | 95-0174-01 | |
| Solutions | |||
| 1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH | ||
| Aprotinin/Leupeptin stock | 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Buffer X | 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl | ||
| Cycloheximide stock | 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| Cytochalasin B stock | 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C. | ||
| Dithiothreitol (DTT) stock | 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| ELB | 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 | ||
| Nocodazole stock | 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Energy Mixture | 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C. | ||
| Nuclear dye solution | 0.4 μg/ml H–chst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS | ||
| Tautomycin stock | 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C. | ||
References
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: an essential regulator of genome integrity. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).
- Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts. Methods. 41 (2), 222-231 (2007).
- Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint. Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).
- Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts. J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).
- Kato, K., Strauss, B. Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).
- Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage. Cell. 82 (5), 841-847 (1995).
- Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts. Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).
- Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity. EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).
- Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).
- Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling. J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).
- Shiotani, B., Zou, L. Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks. Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).
- Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).
- Cross, M. K., Powers, M. Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts. J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).
