Passage af Hues humane embryonale stamceller-linjer med Trypsin

Summary

I denne video viser vi, hvordan vores laboratorium rutinemæssigt passager farvetone humane embryonale stamcellelinjer med trypsin.

Abstract

I denne video viser vi, hvordan vores laboratorium rutinemæssigt passager farvetone humane embryonale stamcellelinjer med trypsin. Humane embryonale stamceller er artefakter i cellekultur, og har tendens til at erhverve karyotypic abnormiteter med høje populationsfordoblinger. Korrekt passager er afgørende for at opretholde en sund, udifferentieret, karyotypically normal Hues humane embryonale stamceller kultur. For det første er en ekspanderende kultur vasket i PBS for at fjerne resterende medier og cellerester, og derefter celler overlejret med et minimalt volumen af ​​varm 0,05% trypsin-EDTA. Trypsin efterlades på cellerne op til fem minutter, hvorefter cellerne forsigtigt løsnes med en 2 ml serologisk pipette. Cellesuspensionen opsamles og blandes med et stort volumen af ​​nuancer medier, der derefter opsamles cellerne ved forsigtig centrifugering. Den inaktiverede trypsin mediet Blandingen fjernes, og cellerne resuspenderet i forvarmet farvetone medier. En passende fordeling beregnes (generelt fra 1:10 til 1:20), og cellerne igen udpladet på en 1-2 dage gammelplade indeholdende et monolag af bestrålede muse embryonale fibroblaster fødeceller. Den nyligt podes farvetoner dyrkningsplade efterlades uforstyrret i 48 timer, hvorefter mediet skiftes hver dag derefter. Det er vigtigt ikke at trpsinize ned til en enkelt cellesuspension, da dette øger risikoen for at indføre karyotypic abnormiteter.

Protocol

General

Vi anbefaler optøning ikke mere end én prøve på et givent tidspunkt for at sikre nem håndtering. Føreren skal sørge for ikke at forlade kulturer ved stuetemperatur og lav CO2 i lange perioder ad gangen. Alle centrifugering af levende celler sker ved 500-600 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.

MEF'er (muse embryonale fødeceller)

1. Præ-varme MEF medier til 37 ° C. Fjerne MEF hætteglasset fra -80 ° C og straks nedsænke den nederste halvdel af røret i et 37 ° C vandbad. Det bør tage ca 30-45 sekunder, før cellerne er 80% optøet (lille frosne portionsstykke venstre).
2. Hurtigt bringe røret til laminært flow, spray ned med 70% alkohol, og overføre cellerne til præ-opvarmede medium.
3. Aspirer gelatineopløsningen fra plader fremstillet tidligere.
4. Aliquot 2 ml MEF opløsning i en dråbevis måde i hver af de seks brønde. Sørg for at distribuere MEF'er jævnt om brønden. Dato MEFplade, og anbringes i en 37 ° C inkubator natten over for at tillade MEF'er kan knytte til pladen.
5. Efter 6 timer MEF'er vil blive knyttet til pladen. Det er bedst at anvende MEF pladerne 24-48 timer efter udpladning. Brug IKKE en MEF plade, der er over 4 dage gammel.
6. Præ-varme nuancer medier og 0,05% trypsin / EDTA til 37 ° C under hætten, prelabel et sterilt 50 ml konisk rør.
7. Forsigtigt suge de farver medier fra den kultur, der skal deles. Forsigtigt vaske brøndene med 2 ml 1X phosphatpufret opløsning (PBS) pr. Aspirer PBS. Tilsættes 0,75 ml 0,05% trypsin / EDTA til brønden.
8. Sæt låg, og observere de celler under 4x forstørrelse. Den MEF'er omkring de farver kolonier bør begynde at trække. Når MEF'er er tilstrækkeligt afrundede, og grænserne af nuancerne kolonier er ru, tilbage pladen til emhætten. Denne proces bør tage omkring 5 minutter, absolut ikke længere end 10 minutter eller dine celler vil ikke vokse ud igen.
9. Forsigtigt pipettere op og ned, vask bunden af ​​the godt, indtil MEF enkeltlags helt har løsnet sig (enkeltlags er klæbrig og kan forblive i ét stykke).
10. Overfør cellesuspensionen til en 50 ml konisk rør indeholdende yderligere farvetone medier. Spin røret af celler, 500 x g i 5 minutter, suges væk fra medierne, være omhyggelig med ikke at forstyrre cellepelleten.
11. Til pladen på en ny plade af MEF'er er passende bestemmes volumenet af celler tilsættes til yderligere farvetone medier, og pipetteres opløsningen 5-7 gange med en automatiseret pipette.
12. Fjern MEF medier fra en frisk plade af MEF'er.
13. Alikvot den Hues løsningen fald klogt at hver brønd, og sørg for at fordele falder jævnt om brønden. Uden omrystning af pladen, returnerer omhyggeligt cellerne til et 37 ° C inkubator natten over for at lade farvetoner kolonier frø.
14. Farvetone celler, der kommer ud af en split bør opføre sig på samme måde som dem, der kommer ud af en tø.

Discussion

I denne video har vi vist, hvordan vi rutinemæssigt passage farvetone humane embryonale stamcellelinjer i vores laboratorium. Effektiv og regelmæssig opdeling og passage er afgørende for at opretholde en sund humane embryonale stamceller linje. Trypsin medieret passage er en betydelig fordel af nuancer cellelinier, men det er vigtigt ikke at over Trypsinisér kulturer eller at have en stor del af enkelte celler under re-platting.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml