Summary
Her beskriver vi en unik strategi for at skabe biokompatible, lagdelte matricer med kontinuerlige grænseflader mellem distinkte lag for tissue engineering. Et sådant stillads kunne give et ideelt tilpasselig miljø at modulere celle adfærd ved forskellige biologiske, kemiske eller mekaniske signaler
Abstract
Komplekse vævskulturplader matricer, hvori typer og koncentrationer af biologiske stimuli (f.eks vækstfaktorer, inhibitorer, eller små molekyler) eller matrix struktur (f.eks sammensætning, koncentration eller stivheden af matricen) varierer over rummet, vil muliggøre en lang række undersøgelser om, hvordan disse variabler påvirker celledifferentiering, migration og andre fænomener. Den største udfordring i at skabe lagdelte matricer er at opretholde den strukturelle integritet af lag grænseflader uden diffusion af individuelle komponenter fra hvert lag 1. Aktuelle metoder til at opnå dette omfatter photopatterning 2-3, litografi 4, sekventiel functionalization5, frysetørring 6, MicroFluidics 7, eller centrifugering 8, hvoraf mange kræver avanceret instrumentering og tekniske færdigheder. Andre er afhængige af sekventiel fastgørelse af enkelte lag, som kan føre til delaminering af lagene 9
DGMP overvinder disse problemer ved at anvende en inert densitetsmodifikatoren såsom iodixanol at skabe lag af varierende tætheder 10. Eftersom densitetsmodifikatoren kan blandes med enhver præpolymer eller bioaktive molekyle, DGMP tillader hvert stillads lag, der skal tilpasses. Simpelthen at variere koncentrationen af densitetsmodifikatoren forhindrer blanding af tilstødende lag, mens de forbliver vandigt. Efterfølgende enkelt trin polymerisation giver anledning til en strukturelt kontinuerlig flerlags stillads, hvor hvert lag har særskilte kemiske og mekaniske egenskaber. The densitetsmodifikatoren kan let fjernes med tilstrækkelig skylning uden perturbation af de individuelle lag eller komponenter. Denne teknik er således velegnet til at skabe hydrogeler af forskellige størrelser, former og materialer.
En protokol til fremstilling af en 2D-polyethylenglycol (PEG) gel, hvori skiftende lag omfatte RGDS-350, er skitseret nedenfor. Vi anvender PEG because det er biokompatibelt og inert. RGDS, en celleadhæsion peptid 11, anvendes til at påvise rumlig begrænsning af en biologisk cue, og konjugeringen af en fluorophor (Alexa Fluor 350) giver os mulighed for visuelt at skelne forskellige lag. Denne fremgangsmåde kan tilpasses til andre materialer (fx collagen, hyaluronan, osv.) og kan udvides til fremstilling af 3D-geler med nogle ændringer 10.
Protocol
1. Syntese af fluorescensmærket acryloyl-PEG-RGDS
- Omsætte RGDS peptid med acryloyl-PEG-succinimidyl carboxymethylester (aPEG-SCM, PEG MW: 3400 g / mol) og NN diisopropylethylamin (DIPEA) ved 1.2:1:2 molforhold i dimethylsulfoxid (DMSO) under argon ved stuetemperatur natten over.
- Bekræft konjugering ved matrix-assisteret laser desorption / ionisering time of flight (MALDI-TOF)-massespektrometri. Tilsættes 1 ml af aPEG-RGDS reaktionsopløsning til en prøve stedet på MALDI target og tør. Der fremstilles en mættet opløsning af Universal MALDI Matrix i tetrahydrofuran (THF) og vortex i 1 min. Tilføj ~ 1 ml af denne opløsning til den samme prøve stedet. Gentag proceduren for aPEG-SCM til sammenligning. Indlæs og analysere. Molekylvægten af aPEG-RGDS bør være større end aPEG-SCM (fig. 2).
- At konjugere fluoroforen, tilsættes en ækvimolær mængde af Alexa Fluor 350 carboxylsyre (succinimydyl ester), opløsti et minimalt volumen af DMSO, til aPEG-RGDS reaktionsopløsning fra 1,1 og reagerer under argon ved stuetemperatur natten over.
- Oprense aPEG-RGDS-350 ved at dialysere (MW 3500 Da) mod DI-H2O ved 4 ° C i 48 timer på 1,0001 volumetrisk forhold, udveksling dialysat mindst to gange om dagen.
- Frys tørre det oprensede aPEG-RGDS-350 i en Labconco Freezone Plus eller tilsvarende Freeze Dry system og opbevares ved -20 ° C.
2. Udarbejdelse af en 2D Mold og Fabrication af en 2D PEG Gel med Skiftende RGDS-350 Lag
- Forbered hydrofobe objektglas. Placer rene objektglas i et glas fad i en vakuumovn. Der opvarmes til 80 ° C i 30 minutter for helt at tørre fladerne. Placer skålen med dias i et stinkskab og tilsæt 250 ul Sigmacote til hvert dias, blidt vuggende for 30 sec at belægge hele overfladen. Skyl coatede objektglas med 100% methanol, efterfulgt af vask i destilleret vand, neddypning to gange i 5 minutter i på LEAt 10 ml.
- Skær silikone afstandsklodser (0,8 mm tyk) med 10 mm biopsi slag.
- Autoklavér silikone afstandsstykker og Sigmacote-behandlede objektglas.
- Formulere løsninger for hvert respektivt lag i individuelle mikrocentrifugerør ved blanding af PEG-diacrylat (PEGda) precursor (slutkoncentration 15% vægt / volumen) med forskellige mængder af iodixanol (60% stamopløsning i vand) til opnåelse af varierende slutkoncentrationer (fx 40%, 30%, 20% og 10%), som supplerer den resterende volumen med phosphatbufret saltvand (PBS) til opnåelse af opløsninger af graduerede densiteter. På lignende måde, for vekslende lag til blanding aPEG-RGDS-350 (slutkoncentration 8 mM) med iodixanol og PBS opnåelse af forskellige koncentrationer (fx 35%, 25% og 15%).
- Tilføj fotoinitiator (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenon, 333mg/ml stamopløsning i N-vinylpyrrolidon) til hver opløsning til forskellige lag (10 ul stamopløsning pr ml af hvert lag opløsning). Fotoinitiator is tilsat sidst for at hindre polymerisation før lagdeling af gelerne i formen, da det er følsomt over for lys.
- Efterfølgende trin i denne protokollen udføres i en biosikkerhed skab for at sikre sterilitet.
- Filter-sterilisere hver opløsning ved hjælp af en steril 1 ml sprøjte og 0,2 um filter. Samle formen opsætningen ved sandwiching spaceren mellem to Sigmacore-behandlede objektglas og sikres med klemmer anbringelse som vist i figur 1..
- Kaste de lagdelte geler ved tilsætning af den mest tætte opløsning (f.eks PEGda med 40% iodixanol) først, efterfulgt af en mindre tæt opløsning (f.eks aPEG-RGDS-350 med 35% iodixanol). Gentag den alternative lag for at opnå flere lag af ønsket sammensætning og tæthed som vist i figur 1..
- Bestråle formen med 365 nm lys i 3 minutter ved hjælp af en bærbar UVR-9000 lampe. Tillade de polymeriserede geler hærde i 5 min. Fjern kablerne, så forsigtigt løfte den øverste glasslide og formen, de lagdelte DGMP geler vil forblive på diasene. Under anvendelse af en steril spatel, anbring forsigtigt gelerne i et 50 ml rør indeholdende sterilt PBS eller dyrkningsmedium til vask.
- Vask de polymeriserede geler i PBS ved 1,0001 volumetrisk forhold, udveksling puffer mindst to gange om dagen for at fjerne densitetsmodifikatoren, fotoinitiator og uomsat polymer. Alternativt kan PBS udskiftes med cellevækstmedium. Opbevar DGMP geler i PBS eller vækstmedium for cellekulturen eksperimentet beskrevet i trin 3.
- For at visualisere skiftende lag, arrangere DGMP gel (disse geler vil ikke være brugbare til cellekultur) langs en lineal på prøvebakke af en VersaDoc geldokumentation enhed. Udsætte gelerne i 350 nm, eksponeringstiden vil variere i afhængighed af koncentrationen af fluoroforen. Skiftevis mørke og blå bånd i DGMP hydrogel påvise dannelse af adskilte lag af forskellig kemisk sammensætning (figur 3).
- For geler indeholder RGDS-peptid, anvendes adhæsionsafhængige celler, såsom C2C12 myoblaster.
- Sæt forsigtigt DGMP geler (opbevaret i PBS) i brøndene på 48-brønds cellekultur-plader ved anvendelse af en steril celleskraber i en biosikkerhed kabinet.
- Pre-varme vækstmedium (Dulbeccos modificerede Eagles medium eller DMEM suppleret med 10% volumen / volumen kalvefosterserum og 1% v / v 100x penicillin-streptomycin-opløsning) og PBS i et vand-bad indstillet ved 37 ° C.
- Vask en 60% sammenflydende plade (10 mm) af C2C12-celler tre gange med PBS. Aspirere off PBS og høst celler ved tilsætning af 1 ml 0,25% trypsin-EDTA og inkubering ved 37 ° C i 2 min. Gensuspendér cellerne i vækstmedium og tælle celler. Seed den DGMP gel indeholdende cellekultur godt med C2C12 myoblaster (20.000 celler / cm 2). Inkuberes cellerne ved 37 ° C i 5% CO2 / 95% relativ fugtighed. Forsigtigt udveksle medium efter 4 timer, passe på ikke at rebevæge sig ganske let adhærerede celler.
- Efter 24 timer kan fastgørelsen af C2C12 myoblaster på RGDS-holdige lag af DGMP geler bekræftes ved epifluorescens og fasekontrastmikroskopi (Zeiss Axiovert 200).
Representative Results
MALDI-TOF analyse bekræfter konjugering af RGDS peptid til acryloyl-PEG (fig. 2). Gel imaging viser alternerende RGDS-350 (blå) lag efter fotopolymerisation (figur 3A). Som vist i figur 3A, kan 2D DGMP gel størrelse varieres baseret på diameteren af silikoneforme (10 mm, venstre, 8 mm, højre), og er derfor let at tilpasse til anvendelse i flere assays - i dette tilfælde til at passe en 48 brønde cellekultur plade (figur 3B). Epifluorescens og fasekontrastmikroskopi af C2C12 myoblaster dyrket på en DGMP gel viser selektiv binding til RGDS-350-indeholdende PEG-lag (fig. 4), der demonstrerer opdeling af celleadhæsion peptid (RGDS).
Figur 1. Molekylær Weight analyse ved MALDI-TOF sammenligning aPEG-SCM til aPEG-RGDS opnået efter konjugering af RGDS-peptid.
Figur 2. Skematisk fremstilling af DGMP gel fremstillingen. Efter gradienterne er lagdelte, kan de få lov at bundfælde i forskellige tidsrum (t s) at skabe graduerede grænseflader, efterfulgt af fotopolymerisation. Stratificerede DGMP geler let kan udtages fra formen til videre brug. Klik her for at se større figur .
Figur 3. A) 2D flerlags geler opnået efter fotopolymerisation filmede med 350 nm og hvidt lys kanaler VersaDoc geldokumentation enhed. Gråtonebilledet afslører skiftende lag indeholder RGDS i hvidt. B) Indsættelse af DGMP gel i 48-brønds cellekultur-skåle.
Figur 4. Fusioneret fasekontrast og epifluorescens billede af C2C12 myoblaster dyrket på DGMP geler (skala bar 50 um).
Figur 5. Effekt af iodixanol på geloverfladen elasticitet. Atomic force mikroskopi målinger af statiske prøver af tværbundne PEG substrater ved hjælp af tidligere etablerede metoder med en 2 nN force udløseren 12. * P <0,05 og ** p <0,01.
Discussion
DGMP er en simpel strategi for at forberede flerlags geler, der ikke er afhængige af dyre instrumenter. Denne protokol kan tilpasses til at skabe stilladser med andre biokompatible materialer, såsom collagen og hyaluronsyre. Bioaktive små molekyler, for eksempel celleadhæsion-fremmende RGDS peptid, der kan bindes til polymermatrixen at forhindre blanding af signaler mellem lagene. Proteiner kan være indkapslet i distinkte lag uden behov for kemisk konjugation, som de, afhængigt af matrix maskestørrelse, er mindre tilbøjelige til at diffundere gennem hydrogeler 10. Her anvendte vi iodixanol (Nycoprep), en inert densitetsmodifikatoren, som tidligere er blevet anvendt til levedygtige celler applikationer. Andre densitet modifikatorer, såsom saccharose og dextrose kan også anvendes. Ved at variere indsvingningstid (t s), kan man finjustere grænsefladerne mellem to lag til at producere glatte eller skarpe overgange efter behov (længere indsvingningstid giver glattere overgange) <sup> 10. For eksempel kan blødere overgange mellem DGMP gellag anvendes til at frembringe en kontinuert gradient af en biologisk cue at studere celle processer såsom kemotaxis.
Virkningen af densitetsmodifikatoren på gel stivhed er vist i figur 5 til 15% aPEGda gel, en mere komplet karakterisering af stivhed og porøsitet som en funktion af PEGda og iodixanol koncentrationer undersøges i øjeblikket. Mens PEGda koncentration i dette eksempel er relativt høj, observerede vi en 60% større elasticitetsmodul i geler med 30% iodixanol forhold til geler uden. Ændringen i gel stivhed kan justeres ved at modulere den makromere koncentration eller tværbindingsdensitet.
Vi har også anvendt den DGMP teknik til at skabe 3D flerlags geler ved hjælp af polyacrylamid og PEG forstadier 10. Variere koncentrationen eller graden af tværbinding af den præpolymere giver strukturel variation istilladser, som kan anvendes til at undersøge celle-adfærd såsom polariseret vækst og migrering i 3D.
Sammenfattende er DGMP en tilpasningsdygtig teknik, der kan anvendes til fremstilling af 2D-og 3D stilladser fra en række forskellige biokompatible materialer til en lang række biomedicinske og grundforskning applikationer.
Disclosures
Forfatterne har ingen modstridende interesser at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for støtte fra NIH direktørens Nye Innovator Awards (1DP2 OD006499-01 til AA og 1DP2 OD006460-01 til AJE), og Kong Abdulaziz City for videnskab og teknologi (UC San Diego Center of Excellence i nanomedicin). Vi vil gerne takke Ms Jessica Moore for hendes kritiske kommentarer til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene glycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) | Laysan | 120-64 | |
| Polyethelyene glycol diacrylate (PEGda) | Dajac Labs | 9359 | |
| Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine (RGDS) | American Peptide | 49-01-4 | |
| N,N- Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma | D125806 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2438 | |
| N,N- dimethylformamide (DMF) | Fisher | D119-4 | |
| Tetrahydrofuran (THF) | Fisher | T397 | |
| Dialysis cassette (3500 Da) | Thermo Scientific | 66330 | |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid succinimydyl ester | Life Technologies | A-10168 | |
| Sigmacote | Sigma | SL2 | |
| Silicone spacers | Grainger | 1MWA4 | |
| Biopsy punches | Acuderm | P1025 (10 mm) P850 (8 mm) |
|
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Hyclone | SH30028 | |
| Iodixanol (NycoPrep) | Fisher | NC9388846 | |
| 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Life Technologies | 11054 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| C2C12 myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| MALDI | Bruker | N/A | |
| UVR-9000 | Bayco | UVR-9000 | |
| VersaDoc | Bio-Rad | N/A |
References
- Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. Complexity in biomaterials for tissue engineering. Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).
- Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers. J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).
- Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Eng. 13, 405-414 (2007).
- Hahn, M. S., et al. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
- Kizilel, S., Sawardecker, E., Teymour, F., Perez-Luna, V. H. Sequential formation of covalently bonded hydrogel multilayers through surface initiated photopolymerization. Biomaterials. 27, 1209-1215 (2006).
- Harley, B. A., et al. Design of a multiphase osteochondral scaffold. II. Fabrication of a mineralized collagen-glycosaminoglycan scaffold. J. Biomed. Mater. Res. A. 92, 1066-1077 (2010).
- Cuchiara, M. P., Allen, A. C., Chen, T. M., Miller, J. S., West, J. L.
- Roam, J. L., Xu, H., Nguyen, P. K., Elbert, D. L. The formation of protein concentration gradients mediated by density differences of poly(ethylene glycol) microspheres. Biomaterials. 31, 8642-8650 (2010).
- Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. J. Biomed. Mater. Res. A. 85, 611-618 (2008).
- Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue. Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).
- Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule. Nature. 309, 30-33 (1984).
- Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium. Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).
