Summary
Hier beschrijven we een unieke strategie voor het maken van biocompatibele, gelaagde matrices met continue interfaces tussen verschillende lagen van tissue engineering. Een dergelijke steiger kan een ideale aanpasbare omgeving te moduleren cel gedrag van verschillende biologische, chemische of mechanische signalen
Abstract
Weefselkweek complexe matrices, waarbij typen en concentraties van biologische stimuli (bijvoorbeeld groeifactoren, remmers of kleine moleculen) of matrix structuur (bijvoorbeeld samenstelling, concentratie of stijfheid van de matrix) variëren ruimte kan zorgen diverse onderzoeken over hoe deze variabelen cel differentiatie, migratie en andere fenomenen beïnvloeden. De grote uitdaging in het creëren van gelaagde matrices is het handhaven van de structurele integriteit van de laag-interfaces zonder diffusie van afzonderlijke onderdelen van elke laag 1. Huidige methoden om dit te bereiken zijn onder andere photopatterning 2-3, lithografie 4, sequentiële functionalization5, vriesdrogen 6, microfluidics 7 of centrifugeren 8, waarvan vele vereisen geavanceerde instrumentatie en technische vaardigheden. Anderen vertrouwen op sequentiële bevestiging van afzonderlijke lagen, hetgeen kan leiden tot delaminatie van lagen 9
DGMP overwint deze problemen door gebruik van een inert dichtheid modificator zoals iodixanol op lagen van verschillende dichtheden 10 maken. Aangezien de dichtheid modifier kan worden gemengd met een polymeer of bioactieve molecule, dGMP kan elke steiger lagen kunnen worden aangepast. Gewoon variëren van de concentratie van de dichtheid modifier voorkomt vermenging van aangrenzende lagen gedurende het verblijf waterige. Volgende stap polymerisatie leidt tot een structureel continue meerlaagse scaffold, waarbij elke laag verschillende chemische en mechanische eigenschappen. De dichtheid modifier kan gemakkelijk worden verwijderd met voldoende spoelen zonder verstoring van de afzonderlijke lagen of componenten. Deze techniek is daarom zeer geschikt voor het maken van hydrogels van verschillende afmetingen, vormen en materialen.
Een protocol voor het vervaardigen van een 2D-polyethyleenglycol (PEG) gel, waarbij afwisselende lagen bevatten RGDS-350, wordt hieronder beschreven. We gebruiken PEG banwege het is biocompatibel en inert. RGDS een celadhesie peptide 11 wordt gebruikt om ruimtelijke beperking van een biologische cue tonen en de conjugatie van een fluorofoor (Alexa Fluor 350) kunnen we visueel onderscheiden verschillende lagen. Deze procedure kan worden aangepast voor andere materialen (bijv. collageen, hyaluronzuur, etc.) en kan worden uitgebreid tot 3D gels fabriceren met enkele wijzigingen 10.
Protocol
1. Synthese van fluorescent gemerkte acryloyl-PEG-RGDS
- Reageren de RGDS peptide met acryloyl-PEG-succinimidyl carboxymethyl ester (aPEG-SCM, PEG MW: 3400 g / mol) en NN diisopropylethylamine (DIPEA) in 1.2:1:2 molverhoudingen in dimethylsulfoxide (DMSO) onder argon bij kamertemperatuur 's nachts.
- Bevestigen door conjugatie matrix-assisted laser desorptie / ionisatie time of flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie. Voeg 1 pl aPEG-RGDS reactieoplossing een monster plek op de MALDI target en droog. Bereid een verzadigde oplossing van Universal MALDI Matrix in tetrahydrofuran (THF) en vortex gedurende 1 minuut. Voeg ~ 1 ul van deze oplossing hetzelfde monster plaats. Herhaal de procedure voor aPEG-SCM ter vergelijking. Laden en te analyseren. Het molecuulgewicht van aPEG-RGDS moet groter aPEG-SCM (Figuur 2).
- Het fluorofoor te conjugeren, voeg een equimolaire hoeveelheid Alexa Fluor 350 carbonzuur (succinimydyl ester), opgelostin een minimaal volume DMSO, de aPEG-RGDS reactieoplossing van 1,1 en reageren onder argon bij kamertemperatuur geroerd.
- Zuiveren aPEG-RGDS-350 door dialyse (MW 3500 Da) tegen DI-H 2 O bij 4 ° C gedurende 48 uur bij 1.000:1 volumeverhouding, uitwisseling dialysaat ten minste tweemaal per dag.
- Freeze drogen het gezuiverde aPEG-RGDS-350 in een Labconco Freezone Plus of gelijkwaardig vries droog systeem en bewaar bij -20 ° C.
2. Voorbereiding van een 2D-Mold en fabricatie van een 2D-PEG Gel met Alternating RGDS-350 Lagen
- Bereid hydrofoob glas dia's. Plaats schoon glas dia's in een glazen schaal in een vacuüm oven. Verwarm tot 80 ° C gedurende 30 minuten volledig drogen van de oppervlakken. Plaats schotel met dia's in een zuurkast en voeg 250 ul Sigmacote aan elke dia, zachtjes wiegen gedurende 30 seconden de vacht gehele oppervlak. Spoel de gecoate glaasjes met 100% methanol, gevolgd door wassen in gedestilleerd water, weken tweemaal gedurende 5 min in Least 10 ml.
- Snijd siliconen afstandhouders (0,8 mm dik) met 10 mm biopsie punches.
- Autoclaaf de siliconen afstandhouders en Sigmacote behandelde glazen dia's.
- Formuleren oplossingen voor elke respectieve laag in afzonderlijke microfugebuizen door mengen PEG-diacrylaat (PEGda) precursor (eindconcentratie 15% w / v) met verschillende hoeveelheden iodixanol (60% voorraadoplossing in water) in verschillende eindconcentraties (bijv. 40% opbrengst, 30%, 20% en 10%), aanvulling van het resterende volume met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossingen van graded dichtheden. Op soortgelijke wijze, afwisselende lagen te mengen aPEG-RGDS-350 (eindconcentratie 8 mM) met PBS en iodixanol geven verschillende concentraties (bijv. 35%, 25% en 15%).
- Voeg fotoinitiator (2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiofenon, 333mg/ml stock in N-vinylpyrrolidon) aan elke oplossing voor verschillende lagen (10 ul voorraadoplossing per ml van elke laag oplossing). Fotoinitiator is toegevoegd laatste polymerisatie te voorkomen vóór gelaagdheid van de gels in de matrijs, omdat het lichtgevoelig.
- Volgende stappen van dit protocol wordt uitgevoerd in een bioveiligheid kast steriliteit.
- Filter-steriliseer elke oplossing met een steriele spuit van 1 ml en 0,2 um filter. Monteer de mal setup door daartussen de spacer tussen twee Sigmacore behandelde glasplaatjes en veilig klemmen plaatsen zoals in figuur 1.
- Zet de gelaagde gels door toevoeging van de dichtste oplossing (bijvoorbeeld PEGda met 40% iodixanol), gevolgd door een minder dichte oplossing (bijvoorbeeld aPEG-RGDS-350 met 35% iodixanol). Herhaal de alternatieve laagjes om meerdere lagen gewenste samenstelling en dichtheden te bereiken zoals getoond in figuur 1.
- Bestralen de mal met 365 nm licht gedurende 3 min met behulp van een draagbare UVR-9000 lamp. Laat de gepolymeriseerde gels uitharden 5 min. Verwijder de kabels, dan til het bovenste glasdia en de mal, de gelaagde dGMP gels blijven op de dia's. Met een steriele spatel leg de gels in een 50 ml buis met steriele PBS of het kweekmedium voor de was.
- Was de gepolymeriseerde gels in PBS bij 1.000:1 volumeverhouding, uitwisselen van buffer ten minste tweemaal per dag de dichtheid modifier, fotoinitiator en gereageerd hebbend polymeer te verwijderen. Alternatief kan worden uitgewisseld met PBS celgroei medium. Sla de dGMP gels in PBS of groeimedium voor de celkweek experiment beschreven in stap 3.
- Om afwisselende lagen zichtbaar te maken, te regelen dGMP gel (deze gels zijn niet bruikbaar voor celcultuur) langs een liniaal op het monster plateau van een VersaDoc gel documentatie-eenheid. Bloot gels in 350 nm, de belichtingstijd afhankelijk van de concentratie van de fluorofoor. Afwisselend donkere en blauwe banden in de hydrogel dGMP aantonen vorming van discrete lagen van verschillende chemische samenstelling (figuur 3).
- Voor gels waarin RGDS peptide gebruikt adhesieafhankelijke cellen, zoals myoblasten C2C12.
- Steek dGMP gels (opgeslagen in PBS) in de putjes van 48-well platen celkweek met een steriele celschraper in een bioveiligheid kast.
- Voorverwarmen groeimedium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium of DMEM aangevuld met 10% v / v foetaal runderserum en 1% v / v 100x penicilline-streptomycine oplossing) en PBS in een waterbad ingesteld op 37 ° C.
- Was een 60% confluente platen (10 mm) van C2C12 cellen drie keer met PBS. Aspireren uit PBS en oogst cellen door toevoeging van 1 ml van 0,25% trypsine-EDTA en incubatie bij 37 ° C gedurende 2 minuten. Resuspendeer de cellen in groeimedium en tellen cellen. Zaad dGMP gel bevattende celkweek goed met C2C12 myoblasten (20.000 cellen / cm 2). Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO2 / 95% relatieve vochtigheid. Voorzichtig uitwisselingsmedium na 4 uur, voorzichtig opnieuwbewegen lichtjes aangehouden cellen.
- Na 24 uur wordt de bijlage van C2C12 myoblasten de RGDS-bevattende lagen dGMP gels worden bevestigd door epifluorescentie en fasecontrastmicroscopie (Zeiss Axiovert 200).
Representative Results
MALDI-TOF analyse bevestigt de conjugatie van peptide RGDS acryloyl-PEG (Figuur 2). Gel imaging onthult afwisselend RGDS-350 (blauw) lagen na fotopolymerisatie (Figuur 3A). Zoals getoond in figuur 3A, kan 2D dGMP gel grootte worden gevarieerd afhankelijk van de diameter van de silicone mallen (10 mm, links, 8 mm, rechts), en zijn daarom gemakkelijk aanpasbaar voor gebruik in meerdere assays - in dit geval een passend 48 well celkweekplaat (Figuur 3B). Epifluorescentie en fasecontrastmicroscopie van C2C12 myoblasten gekweekt op een dGMP gel toont selectieve aanhechting op RGDS-350-bevattende PEG lagen (figuur 4), waaruit compartimentering van de celadhesie peptide (RGDS).
Figuur 1. Moleculaire Weight analyse door MALDI-TOF vergelijken aPEG-SCM aan aPEG-RGDS verkregen na conjugatie van RGDS peptide.
Figuur 2. Schematische weergave van dGMP gel fabricage. Nadat de hellingen gestapeld zijn, kunnen ze bezinken gedurende verschillende perioden (t s) graduele interfaces, gevolgd door fotopolymerisatie te maken. Gestratificeerde dGMP gels kan gemakkelijk worden geëxtraheerd uit de mal voor verder gebruik. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. A) 2D meerlaags gels verkregen na fotopolymerisatie afgebeeld met behulp van 350 nm en wit licht kanalen van VersaDoc gel documentatie-eenheid. De afbeelding met grijswaarden toont afwisselende lagen bevatten RGDS in het wit. B) Het inbrengen van dGMP gel in 48-well celkweek gerechten.
Figuur 4. Samengevoegd fase contrast en epifluorescentie beeld van C2C12 myoblasten gegroeid op dGMP gels (schaalbalk 50 pm).
Figuur 5. Effect van iodixanol op gel oppervlak elasticiteit. Atomic force microscopie metingen van statische monsters van verknoopt PEG substraten met behulp van eerder vastgestelde methoden met een 2 nN kracht trekker 12. * P <0,05 en ** p <0,01.
Discussion
DGMP is een eenvoudige strategie voor het bereiden meerlaagse gels die niet vertrouwen op dure instrumentatie. Dit protocol kan worden aangepast voor het maken van steigers met andere biocompatibele materialen, zoals collageen en hyaluronzuur. Bioactieve kleine moleculen, bijvoorbeeld cel adhesie bevorderende peptide RGDS kan worden gebonden aan de polymere matrix om mengen van signalen tussen de lagen. Eiwitten kunnen worden opgenomen in afzonderlijke lagen zonder chemische conjugatie zij, afhankelijk van de matrix maaswijdte, zijn minder gevoelig voor diffunderen door hydrogels 10. Hier gebruikte iodixanol (Nycoprep), een inert dichtheid modifier, die eerder is gebruikt voor levensvatbare cellen toepassingen. Andere modifiers dichtheid zoals sucrose en dextrose kan ook worden gebruikt. Door het variëren van de afwikkeling van de tijd (t s), kan men afstemmen van de interfaces tussen twee lagen op gladde of scherpe overgangen te produceren als dat nodig is (langere inwerktijd zorgt voor een soepeler overgangen) <sup> 10. Zo zou vloeiender overgangen tussen dGMP gel lagen worden gebruikt om een continue gradiënt van een biologische cue naar cel processen zoals chemotaxis bestuderen genereren.
Het effect van de dichtheid op modifier gel stijfheid is getoond in figuur 5 voor een 15% aPEGda gel, een volledige karakterisering van stijfheid en porositeit als functie van PEGda en iodixanol concentraties wordt momenteel geëvalueerd. Terwijl de PEGda concentratie in dit voorbeeld relatief hoog zagen we een 60% grotere elasticiteitsmodulus in gels met 30% vergeleken met gels iodixanol zonder. De verandering in gel stijfheid kan worden aangepast door het moduleren van het macromeer concentratie of verknopingsdichtheid.
We hebben ook toegepast dGMP techniek 3D meerlagige gels met polyacrylamide en PEG 10 precursors creëren. Variëren van de concentratie of de mate van verknoping van het prepolymeer kan structurele variatie in descaffolds die gebruikt kan worden om cel gedrag zoals gepolariseerde groei en migratie in 3D onderzoeken.
Samengevat, dGMP is een flexibel techniek die kan worden toegepast op 2D en 3D scaffolds fabriceren van verschillende biocompatibele materialen voor een brede waaier van biomedische toepassingen en fundamenteel onderzoek.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicterende belangen te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs zijn dankbaar voor de steun van New Innovator NIH directeur Awards (1DP2 OD006499-01 naar AA en 1DP2 OD006460-01 tot AJE), en King Abdulaziz Stad voor Wetenschap en Technologie (UC San Diego Center of Excellence in Nanomedicine). We willen mevrouw Jessica Moore bedanken voor haar kritische commentaar op het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene glycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) | Laysan | 120-64 | |
| Polyethelyene glycol diacrylate (PEGda) | Dajac Labs | 9359 | |
| Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine (RGDS) | American Peptide | 49-01-4 | |
| N,N- Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma | D125806 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2438 | |
| N,N- dimethylformamide (DMF) | Fisher | D119-4 | |
| Tetrahydrofuran (THF) | Fisher | T397 | |
| Dialysis cassette (3500 Da) | Thermo Scientific | 66330 | |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid succinimydyl ester | Life Technologies | A-10168 | |
| Sigmacote | Sigma | SL2 | |
| Silicone spacers | Grainger | 1MWA4 | |
| Biopsy punches | Acuderm | P1025 (10 mm) P850 (8 mm) |
|
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Hyclone | SH30028 | |
| Iodixanol (NycoPrep) | Fisher | NC9388846 | |
| 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Life Technologies | 11054 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| C2C12 myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| MALDI | Bruker | N/A | |
| UVR-9000 | Bayco | UVR-9000 | |
| VersaDoc | Bio-Rad | N/A |
References
- Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. Complexity in biomaterials for tissue engineering. Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).
- Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers. J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).
- Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Eng. 13, 405-414 (2007).
- Hahn, M. S., et al. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
- Kizilel, S., Sawardecker, E., Teymour, F., Perez-Luna, V. H. Sequential formation of covalently bonded hydrogel multilayers through surface initiated photopolymerization. Biomaterials. 27, 1209-1215 (2006).
- Harley, B. A., et al. Design of a multiphase osteochondral scaffold. II. Fabrication of a mineralized collagen-glycosaminoglycan scaffold. J. Biomed. Mater. Res. A. 92, 1066-1077 (2010).
- Cuchiara, M. P., Allen, A. C., Chen, T. M., Miller, J. S., West, J. L.
- Roam, J. L., Xu, H., Nguyen, P. K., Elbert, D. L. The formation of protein concentration gradients mediated by density differences of poly(ethylene glycol) microspheres. Biomaterials. 31, 8642-8650 (2010).
- Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. J. Biomed. Mater. Res. A. 85, 611-618 (2008).
- Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue. Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).
- Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule. Nature. 309, 30-33 (1984).
- Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium. Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).
