Summary
Tatuaggio della pelle è un modo potente e sicuro per la consegna del DNA vaccino intradermica. Qui, un plasmide EGFP codifica DNA viene consegnato da tatuaggio alla pelle di un topo di laboratorio, e l'espressione di EGFP in cellule della pelle viene poi controllata mediante microscopia confocale.
Abstract
A base di acido nucleico vaccinazione è un argomento di crescente interesse, in particolare del DNA plasmidico (pDNA), che codifica gli antigeni immunologicamente importanti. Dopo la pDNA ingegneria è somministrato ai vaccini, si trascritta e tradotta in proteine immunogeno che possono suscitare risposte dal sistema immunitario. Molti modi di fornitura di vaccini a DNA sono stati indagati, ma ogni percorso di consegna ha i suoi vantaggi e le insidie. Tatuaggio della pelle è una nuova tecnica che è sicuro, economico e conveniente. Inoltre, le punture inflitte da dell'ago potrebbe anche servire come un potente adiuvante. Qui, a) dimostrare l'erogazione intradermica di codifica DNA plasmidico maggiore proteina verde fluorescente (PCX-EGFP) in un modello di topo usando un dispositivo di tatuaggi e b) confermare l'espressione efficace EGFP nelle cellule della pelle utilizzando la microscopia confocale.
Protocol
1. Purificazione del DNA plasmidico
- Trasformare il eucariotica plasmide DNA codificante EGFP (pcx-EGFP) in DH5a cellule E.coli competenti. Il vettore vuoto PCX può anche essere utilizzato come controllo negativo.
- Cultura e raccogliere le cellule E.coli DH5a e purificare il pDNA secondo il Manuale Purificazione EndoFree Qiagen Plasmid.
- Filtrare la soluzione attraverso un pDNA 0,22 micron PVDF filtro sterile, e conservarlo a -20 ° C fino all'uso.
2. Preparazione del sistema Tattoo
- Collegare l'unità palmare e il pedale di controllo per l'unità di alimentazione per le istruzioni del produttore.
- Impostare la frequenza di oscillazione dell'ago a circa 100 Hz. Per il dispositivo tatuaggio che abbiamo scelto (Sistema Tattoo Stealth Rotary), il selettore della tensione di alimentazione deve essere impostato a 4 volt. Fare riferimento al manuale utente o il supporto tecnico per i sistemi di tatuaggio altri.
- Sterilizzare l'ar agoray prima dell'uso. Si consiglia di utilizzare un array di aghi per animale. Gli aghi possono essere riutilizzati dopo essere stati puliti con acqua e sapone e in autoclave.
- Installare l'array ago nel palmare e liberamente fissare il manico in plastica.
- Regolare la profondità dell'ago in maniera appropriata spostando il manico in plastica verso l'alto o verso il basso. Abbiamo usato una profondità dell'ago di circa 0,5 mm per il nostro esperimento mouse.
- Stringere la presa di plastica quando la profondità dell'ago è impostato correttamente, e il sistema tatuaggio è pronto per l'uso.
3. Animal Rasatura
- Scegliere il sito per il trattamento tatuaggio. Il sito dovrebbe essere una zona relativamente stabile, liscio, e carnosa della pelle, per esempio, il lato della gamba posteriore dell'animale.
- Anestetizzare un topo BALB / c con una miscela di ketamina (90 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) in funzione del peso corporeo dell'animale. Per gli animali, fare riferimento alle linee guida anestesia della vostra istituzione.
- Controllare ildell'animale riflessi di pizzicare il piede per confermare l'animale è adeguatamente anestetizzato.
- Usare il trimmer elettrico a rintuzzare i capelli posteriori dell'animale lentamente e con attenzione. Rimuovere i capelli dal sito tatuaggio previsto e la zona circostante.
- Rimuovere il pelo corto residua con il rasoio di sicurezza monouso. Fare attenzione a non tagliare la pelle dell'animale. Si noti che la crema depilatoria può essere utilizzato in alternativa depilazione metodo, tuttavia, si preferisce barba sopra crema depilatoria.
- Rimuovere peli tagliati randagi dalla pelle con l'aria compressa, se necessario.
4. Consegna di DNA plasmidico con un tatuaggio
- Se un protocollo di immunizzazione è stato stabilito in precedenza, la dose e il volume di soluzione di DNA da applicare deve essere calcolato di conseguenza. Si consiglia di utilizzare il minor volume pratico per rendere il processo di tatuaggio più gestibile. In questa dimostrazione EGFP, abbiamo utilizzato 7,5 ml di soluzione di DNA in un conconcentrazione di 0,25 mg / ml, che è stato applicato su una zona tatuaggio di circa 1 cm 2. Per gli esperimenti di immunizzazione, concentrazioni più elevate pDNA può essere richiesto per indurre una forte risposta immunitaria 1,2.
- Applicare la soluzione di DNA pipettando direttamente sul sito tatuaggio. In alternativa, caricare la soluzione di DNA nella presa di plastica pipettando, in modo che il liquido è sospeso tra l'ago e la punta della presa di plastica. Vedere il video per una dimostrazione. Abbiamo osservato alcun notevole differenza tra i due metodi. Tuttavia, caricare la soluzione nella presa di plastica può essere vantaggioso su superfici verticali della pelle, per esempio.
- Avviare l'oscillazione dell'ago e posizionare la matrice ago con una leggera pressione sulla pelle dell'animale al sito tatuaggio. Quindi spostare l'ago oscillante delicatamente e lentamente in modo lineare per fornire DNA plasmidico su tutta l'area tatuaggio intero. Mantenere un angolo di 90 gradi tra l'ago e la pelle per evitarelacerazioni alla pelle.
- Osservare la pelle. Abrasione e l'infiammazione sono normali. Se l'emorragia si verifica, interrompere il processo di tatuaggio e diminuire la profondità dell'ago.
- Continua il movimento dell'ago per circa 1 minuto, e quindi arrestare il processo di tatuaggio.
- Usare un tampone di cotone pulito per applicare un sottile strato di analgesico topico sul sito tatuaggio. Analgesici topici come Crema sulfadiazina d'argento (SSD Cream) o pomate Neosporin può contribuire ad alleviare il dolore o la sofferenza degli animali, e, pertanto, si consiglia di applicare prima l'anestesia svanisce. Osservare gli animali il giorno successivo per i segni di dolore o disagio (cambio di andatura, inattività). Riapplicare la crema analgesica se i segni persistono.
5. Conferma di espressione dell'antigene
- 48 ore dopo il trattamento tatuaggio (si noti che diversi costrutti pDNA possono richiedere tempi di espressione diversi), il mouse è eutanasia da CO 2 narcosi. Per altrigli animali, fare riferimento alle linee guida di eutanasia della vostra istituzione.
- Staccare la pelle al sito di tatuaggi, e fissare il tessuto in paraformaldeide al 4% a 4 ° C per una notte.
- Lavare il tessuto con il 70% di etanolo, e le trasferisce in PBS 1X per l'imaging.
- Esaminare il tessuto intero utilizzando un microscopio confocale per verificare la presenza di segnali di EGFP. In alternativa, il tessuto della pelle può essere incorporato in paraffina ed esaminati in sezioni al microscopio a fluorescenza.
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Representative Results
L'espressione di EGFP con un picco di eccitazione a 488 nm e picco di emissione a 509 nm può essere osservata in cellule di topo. Da una dose di 1,875 pg di DNA, contenente circa 3 × 10 17 copie del plasmide, si osserva tipicamente 10-20 segnali eGFP in 1 cm 2 tatuato zona. Questo numero relativamente basso di cellule trasfettate è coerente con i risultati di uno studio precedente 3. L'espressione EGFP (Figura 1) fornisce la prova che è stato consegnato plasmide EGFP in cellule della pelle dell'animale con la tecnica del DNA tatuaggio.
Figura 1. EGFP espressione nelle cellule 48 ore dopo il trattamento tatuaggio sulla gamba posteriore di un topo BALB / c visti con un microscopio confocale. A) Una proiezione di segnali EGFP da più piani focali. B) espressione EGFP in un cantoLe cellule.
Risoluzione dei problemi
1. Nessuna espressione antigene è rilevato (ad esempio, assenza di segnali EGFP di controllo positivo).
- Aumentare la concentrazione della soluzione di DNA plasmidico da 2 - a 5 volte. Si consiglia una concentrazione iniziale di 0,2 mg / ml. Concentrazioni fino a 5 mg / ml sono stati riportati per DNA tatuaggi esperimenti 3.
- Evitare di gravi danni alla pelle, come la pelle del mouse sul sito tatuaggio è facilmente tagliato dal rasoi e aghi.
- Assicurarsi che il costrutto di DNA è appropriato per l'esperimento.
- Effettuare elettroforesi su gel per assicurarsi che la maggior parte del DNA plasmidico superavvolto è in forma circolare o chiuso.
2. Sanguinamento grave o danni alla pelle presso il sito del tatuaggio.
- Diminuire la profondità dell'ago.
- Mantenere un angolo di 90 gradi tra la matrice ago e la pelle.
- Ridurre la forza applicata durante l'tatuaggio trattamento.
- Diminuire la velocità del movimento tatuaggio.
3. Il segnale di fondo è troppo alto quando l'imaging EGFP.
- Utilizzare un nuovo rasoio usa e getta di sicurezza per rimuovere i capelli il più possibile prima di tatuaggio. A volte è necessario radere nuovo prima della dissezione.
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Discussion
Vaccinazione DNA è considerato più sicuro di strategie di vaccinazione tradizionali in quanto non richiede la manipolazione dei, o esporre i vaccini a patogeni, vivi o attenuati 4. Tuttavia, il risultato della vaccinazione DNA dipende fortemente percorso di consegna. Pelle è abbondante in cellule presentanti l'antigene, come le cellule di Langerhans e cellule dendritiche 1, e quindi un luogo ideale per l'immunizzazione in termini di immunogenicità e facilità di accesso 5,6. Come risultato, strategia di vaccinazione intradermica è una delle scelte più popolari per vaccini a DNA. Come mostrato in questo video, il DNA tatuaggio è un modo semplice ma promettente per somministrare un vaccino a DNA intradermica. È interessante notare, le risposte infiammatorie causate dal processo di tatuaggio potrebbe anche servire come 1,2 adiuvante naturale e potente. E 'stato riportato che il tatuaggio DNA può provocare fino a un aumento di 100 volte in risposte delle cellule T nelle scimmie, rispetto a risposte delle cellule T in animali immunized via intramuscolare 7,8. Rispetto ad altri metodi di erogazione dermiche, come il gene gun, tatuaggio DNA contiene diversi vantaggi. In primo luogo, il tatuaggio del DNA non richiede attrezzature costose e vettori, ossia particelle di oro. Questo sarebbe un enorme vantaggio in termini di distribuzione del vaccino, soprattutto per i paesi in via di sviluppo. In secondo luogo, è noto che la pressione alta può causare danni pDNA dovuta alla forza di taglio, che può diminuire il livello di espressione dell'antigene. Uno studio ha dimostrato che i danni tatuaggi DNA meno del 3% del totale pDNA 9. Infine, tatuaggio DNA può coprire una grande area di pelle, che potrebbe provocare una risposta immunitaria più forte. Dispositivi tatuaggi possono anche essere usati per fornire peptide / proteina vaccini, e hanno dimostrato di indurre risposte immunitarie sia umorali e cellulo-mediata 10. Ora usiamo la pelle tatuaggio di routine nei nostri esperimenti su animali in un DNA-proteina principale spinta del protocollo di vaccinazione (tre primi DNA seguitada due proteine aumenta per un periodo di 16 settimane), e abbiamo successo indotta in topi forti risposte immunitarie contro HIV-1 gp120.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare tutti i membri del Laboratorio Kong e il dottor Yan Deng al Nucleo Microscopia, Office of Science Collaborative, NYUMC per la loro assistenza e supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio pilota della New York University Center for AIDS Research (CFAR, sovvenzione del NIH AI027742).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCX-EGFP plasmid DNA | Clontech | ||
| STEALTH Rotary Tattoo System | Worldwide Tattoo Supply | STEALTH-L | |
| Tattoo needles | Worldwide Tattoo Supply | 1207RSB | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| 0.22 μm PVDF sterile filter | Millipore | SLGV013SL | |
| electrical hair trimmer | Commercially available | ||
| disposable safety razors | Commercially available | ||
| Silver Sulfadiazine Cream | Watson | NDC 0591-0810-55 | |
| Ketamine HCL | NDC 0856-2012-01 | ||
| Zylazine Sterile Solution | NADA 139-236 |
References
- Bins, A. D. A rapid and potent DNA vaccination strategy defined by in vivo monitoring of antigen expression. Nat Med. 11, 899-904 (2005).
- Pokorna, D., Rubio, I., Muller, M. DNA-vaccination via tattooing induces stronger humoral and cellular immune responses than intramuscular delivery supported by molecular adjuvants. Genet. Vaccines Ther. 6, 4 (2008).
- van den Berg, J. H. Optimization of intradermal vaccination by DNA tattooing in human skin. Hum. Gene Ther. 20, 181-189 (2009).
- Liu, M. A.
- Koide, Y., Nagata, T., Yoshida, A., Uchijima, M.
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
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- Pokorna, D. Vaccination with human papillomavirus type 16-derived peptides using a tattoo device. Vaccine. 27, 3519-3529 (2009).
