Summary
Кожа татуировка является эффективным и безопасным способом доставки ДНК-вакцины внутрикожно. Здесь, ДНК плазмиды EGFP кодирования поставляется татуировки на коже лабораторных мышей, и выражение EGFP в клетках кожи, затем проверку с помощью конфокальной микроскопии.
Abstract
На основе нуклеиновой кислоты вакцинации тему растущий интерес, особенно плазмидной ДНК (плазмидной ДНК), кодирующей иммунологически важных антигенов. После инженерных пДНК вводят вакцины, она расшифрованы и переведены на иммуноген белки, которые могут получить ответы от иммунной системы. Много способов доставки ДНК-вакцин были исследованы, однако каждый маршрут доставки имеет свои преимущества и недостатки. Кожа татуировки новую технику, которая является безопасной, экономически эффективной и удобной. Кроме того, нанесенный проколов иглой может также служить мощным адъюванта. Здесь мы) показывают, внутрикожные доставки плазмидной ДНК, кодирующей расширения зеленого флуоресцентного белка (PCX-EGFP) в мышиной модели с помощью татуировки устройств и б) подтвердить эффективное выражение EGFP в клетках кожи с помощью конфокальной микроскопии.
Protocol
1. Очистка ДНК плазмиды
- Преобразование эукариотической плазмиды ДНК, кодирующей EGFP (PCX-EGFP) в DH5α компетентных клеток E.coli. Пустой вектор PCX также могут быть использованы в качестве отрицательного контроля.
- Культура и урожай DH5α клеток E.coli и очищают пДНК в соответствии с Qiagen EndoFree плазмиды Справочник очистки.
- Фильтр пДНК раствор через 0,22 мкм ПВДФ стерильный фильтр, и хранить его при температуре от -20 ° C до использования.
2. Татуировка Система подготовки
- Подключите портативный блок и педали к блоку питания в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
- Установите частоту колебаний иглы примерно до 100 Гц. Для татуировки устройства мы выбрали (Stealth Роторная система Tattoo), циферблат на блоке питания должно быть установлено до 4 вольт. См. руководство пользователя или технической поддержки для других систем татуировки.
- Стерилизовать иглы арлуча перед использованием. Мы рекомендуем использовать одну иглу массив на одно животное. Иглы могут быть повторно использованы после того, как очищается водой с мылом и в автоклаве.
- Установите иглу массива в РПУ и свободно закрепить пластиковые рукоятки.
- Отрегулируйте иглу глубину соответствующие настройки, перемещая пластиковой рукояткой вверх или вниз. Мы использовали иглы глубину около 0,5 мм для нашего эксперимента мыши.
- Затянуть пластиковые рукоятки, когда игла глубину правильно настроен, и татуировка система готова к использованию.
3. Животное бритья
- Выберите место для татуировки лечения. Участок должен быть достаточно прочной, ровной, и мясистый участок кожи, например, в сторону задних ног животного.
- Anesthetize Balb / C мышей смесью кетамина (90 мг / кг) и ксилазина (5 мг / кг) в зависимости от массы тела животного. Для других животных, относятся к анестезии руководящие принципы вашей организации.
- Проверьтерефлексы животного, зажимая ее подножия, чтобы подтвердить правильность животных под наркозом.
- Используйте электрический триммер урезать волосы на задние ноги животного медленно и осторожно. Удалить волосы от запланированного места татуировки и окрестностей.
- Удалить остаточные короткие волосы одноразовые бритвы безопасности. Будьте осторожны, чтобы не порезать кожу животного. Обратите внимание, что для удаления волос крем может быть использован в качестве альтернативы удаления волос методом, однако мы предпочитаем бритье более депиляции кремом.
- Удалить беспризорные волосы, вырезанные из кожи с помощью сжатого воздуха при необходимости.
4. Доставка плазмидной ДНК от татуировки
- Если иммунизация протокол был создан ранее, дозы и объема раствора ДНК, которые должны применяться должны быть рассчитаны соответственно. Мы рекомендуем использовать в качестве небольшого объема, как практическое, чтобы сделать татуировки процесс более управляемым. В этой демонстрации EGFP, мы использовали 7,5 мкл раствора ДНК в конконцентрацией 0,25 мг / мл, которая была нанесена на татуировки площадью около 1 см 2. Для иммунизации экспериментов, более высокие концентрации пДНК может потребоваться, чтобы вызвать сильную иммунную 1,2 ответов.
- Нанесите раствор ДНК с помощью пипетки непосредственно на татуировку сайта. Кроме того, загрузить раствор ДНК в пластиковой рукояткой с помощью пипетки, так что жидкость в подвешенном состоянии между иглой и кончиком пластиковой рукояткой. Смотрите на видео для демонстрации. Мы не наблюдалось заметное различие между двумя методами. Тем не менее, загрузка раствора в пластиковой рукояткой может быть выгодно на вертикальные поверхности кожи, например.
- Начало колебаний иглы и поместить иглу массив давления света на кожу животного в татуировке сайта. Затем переместите осциллирующей иглу осторожно и медленно в линейном порядке доставить ДНК плазмиды по всей площади татуировки. Поддерживать 90-градусный угол между иглой и кожей, чтобы избежатьрваные раны на коже.
- Обратите внимание на кожу. Истиранию и воспаление в норме. Если кровотечение происходит, остановить татуировки процесс и уменьшить глубину иглы.
- Продолжить движение иглы в течение примерно 1 минуты, а затем остановить татуировки процесс.
- Используйте чистый ватный тампон нанести тонкий слой актуальные обезболивающий на татуировки сайта. Актуальные анальгетики, такие как сульфадиазин серебра крем (крем SSD) или Neosporin мазь может помочь облегчить боль или страдания животных, и поэтому рекомендуется применять их до анестезии прекратит свое действие. Наблюдать за животными на следующий день признаков боли или страдания (изменение походки, бездействия). Повторно обезболивающим кремом, если признаки сохраняются.
5. Подтверждение экспрессии антигена
- 48 часов после нанесения татуировки лечения (заметим, что различные конструкции пДНК может потребоваться разное время выражение), мышь эвтаназии путем CO 2 наркоза. Для другихживотных, относятся к эвтаназии руководящие принципы вашей организации.
- Проанализируйте кожи на татуировке сайте, и закрепить ткань в 4% параформальдегида при 4 ° С в течение ночи.
- Промойте ткань с 70% этанола, и передать его в 1X PBS для работы с изображениями.
- Изучите все ткани с помощью конфокальной микроскопии для проверки сигналов EGFP. Кроме того, ткань кожи может быть встроен в парафин и рассмотрены в разделах под флуоресцентным микроскопом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Выражение EGFP с возбуждением пик при 488 нм и максимумом излучения в 509 нм можно наблюдать в клетках мышиной кожи. От 1,875 мкг дозу ДНК, содержащий около 3 × 10 17 копий плазмиды, мы обычно наблюдается 10-20 сигналов EGFP в 1 см 2 татуировку области. Это относительно небольшое число трансфицированных клеток согласуется с результатами предыдущих 3 исследования. Выражение EGFP (рис. 1) обеспечивает доказательства того, что EGFP плазмиды был доставлен в кожу животного клетки, используя ДНК татуировки техникой.
Рисунок 1. EGFP выражения в клетках кожи 48 часов после того, как татуировка лечения на заднюю ногу из Balb / C мышей рассматривать с конфокальной микроскопии. А) проекция EGFP сигналы от нескольких фокальных плоскостей. B) EGFP выражение в поютле клетки.
Поиск и устранение неисправностей
1. Нет экспрессии антигена обнаружения (например, не EGFP позитивные сигналы управления).
- Увеличение концентрации плазмидной ДНК решения на 2 - до 5-ти раз. Мы рекомендуем исходной концентрации 0,2 мг / мл. Концентрации выше, чем 5 мг / мл были зарегистрированы для ДНК татуировки экспериментов 3.
- Избегайте тяжелых повреждений кожи, как мышь кожи на татуировке сайте легко режется по бритв и иглы.
- Убедитесь, что конструкция ДНК подходит для вашего эксперимента.
- Выполните гель-электрофорез, чтобы убедиться, большинство плазмидной ДНК в суперспиральной или замкнутой круговой формы.
2. Сильное кровотечение или повреждение кожи происходит в татуировке сайта.
- Снижение иглой глубины.
- Поддерживать 90-градусный угол между массивом иглы и кожи.
- Снижение силы, приложенной в течениетатуировки лечения.
- Снижение скорости движения татуировка.
3. Фонового сигнала слишком высок, когда изображение EGFP.
- Используйте совершенно новые одноразовые бритвы безопасности удалить как можно больше волос, возможно, до татуировки. Иногда приходится бриться снова до вскрытия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ДНК-вакцинация считается более безопасным, чем традиционные стратегии вакцинации, поскольку она не требует манипуляций, и не подвергайте вакцин, живых или ослабленных возбудителей 4. Тем не менее, результаты ДНК-вакцинация сильно зависит от маршрута доставки. Кожа богата антиген-представляющих клеток, таких как клетки Лангерганса и дендритные клетки 1, и, следовательно, идеальное место для иммунизации в плане иммуногенности и легкость доступа 5,6. В результате, внутрикожные стратегии вакцинации является одним из самых популярных вариантов для ДНК-вакцин. Как показано на этом видео, ДНК татуировки является простой, но перспективный способ управлять ДНК-вакцины внутрикожно. Интересно, что воспалительные реакции вызваны татуировки процесс может также служить естественным и мощным адъювант 1,2. Было сообщено, что ДНК татуировка может вызвать до 100-кратного увеличения Т-клеточного ответа у обезьян, по сравнению с Т-клеточного ответа у животных IMMunized через внутримышечно 7,8. По сравнению с другими кожными методы доставки, такие как ген пистолет, ДНК татуировка имеет несколько преимуществ. Во-первых, ДНК татуировка не требует дорогостоящего оборудования и носителей, т.е. частицы золота. Это было бы огромное преимущество в плане распределения вакцин, особенно для развивающихся стран. Во-вторых, известно, что высокое давление воздуха может вызвать пДНК повреждения в результате поперечной силы, которая могла бы снизить уровень экспрессии антигена. Исследование показало, что повреждения ДНК татуировка менее 3% от общего числа пДНК 9. Наконец, ДНК татуировка может покрыть большую площадь кожи, которые потенциально могут вызвать сильный иммунный ответ. Татуировка устройства также могут быть использованы для доставки пептида / белка вакцины, и, как было доказано, чтобы вызвать гуморальный и клеточный иммунные ответы 10. Сейчас мы используем кожу татуировку обычно в наших экспериментах на животных в ДНК премьер-белка повышение вакцинации протокол (трех простых ДНК следуютдва белка повышает в течение 16 недель), и мы успешно индуцированных у мышей сильный иммунный ответ против ВИЧ-1 gp120.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить всех членов Kong лаборатории и д-р Ян Дэн При микроскопии Core, управление совместной науки, NYUMC за их помощь и техническую поддержку. Эта работа была поддержана грантом пилот из Нью-Йоркского университета Центра исследований СПИДа (CFAR, NIH грант AI027742).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCX-EGFP plasmid DNA | Clontech | ||
| STEALTH Rotary Tattoo System | Worldwide Tattoo Supply | STEALTH-L | |
| Tattoo needles | Worldwide Tattoo Supply | 1207RSB | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| 0.22 μm PVDF sterile filter | Millipore | SLGV013SL | |
| electrical hair trimmer | Commercially available | ||
| disposable safety razors | Commercially available | ||
| Silver Sulfadiazine Cream | Watson | NDC 0591-0810-55 | |
| Ketamine HCL | NDC 0856-2012-01 | ||
| Zylazine Sterile Solution | NADA 139-236 |
References
- Bins, A. D. A rapid and potent DNA vaccination strategy defined by in vivo monitoring of antigen expression. Nat Med. 11, 899-904 (2005).
- Pokorna, D., Rubio, I., Muller, M. DNA-vaccination via tattooing induces stronger humoral and cellular immune responses than intramuscular delivery supported by molecular adjuvants. Genet. Vaccines Ther. 6, 4 (2008).
- van den Berg, J. H. Optimization of intradermal vaccination by DNA tattooing in human skin. Hum. Gene Ther. 20, 181-189 (2009).
- Liu, M. A.
- Koide, Y., Nagata, T., Yoshida, A., Uchijima, M.
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Verstrepen, B. E. Improved HIV-1 specific T-cell responses by short-interval DNA tattooing as compared to intramuscular immunization in non-human primates. Vaccine. 26, 3346-3351 (2008).
- Potthoff, A. Immunogenicity and efficacy of intradermal tattoo immunization with adenoviral vector vaccines. Vaccine. 27, 2768-2774 (2009).
- Quaak, S. G. DNA tattoo vaccination: effect on plasmid purity and transfection efficiency of different topoisoforms. J. Control Release. 139, 153-159 (2009).
- Pokorna, D. Vaccination with human papillomavirus type 16-derived peptides using a tattoo device. Vaccine. 27, 3519-3529 (2009).
