Summary
त्वचा गोदने एक शक्तिशाली और सुरक्षित प्रसव के डीएनए वैक्सीन intradermally तरीका है. यहाँ, एक डीएनए प्लाज्मिड एन्कोडिंग EGFP एक प्रयोगशाला माउस की त्वचा को गोदने के द्वारा वितरित किया जाता है, और त्वचा कोशिकाओं में EGFP की अभिव्यक्ति तो confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा निरीक्षण किया जाता है.
Abstract
न्यूक्लिक टीकाकरण एसिड आधारित बढ़ती रुचि का एक विषय है, विशेष रूप से प्लाज्मिड डीएनए (pDNA) immunologically महत्वपूर्ण प्रतिजनों एन्कोडिंग है. है इंजीनियर pDNA के बाद टीके के लिए किया जाता है, यह लिखित और है कि प्रतिरक्षा प्रणाली से प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना कर सकते हैं रोगक्षमजनररोरारतत प्रोटीन में अनुवाद किया है. डीएनए टीके पहुंचाने के कई तरीके की जांच की गई है, लेकिन प्रत्येक प्रसव मार्ग के अपने फायदे और नुकसान है. त्वचा गोदने एक उपन्यास तकनीक है कि सुरक्षित, लागत प्रभावी, और सुविधाजनक है. इसके अलावा, सुई द्वारा प्रवृत्त punctures भी एक शक्तिशाली सहायक के रूप में सेवा कर सके. यहाँ, हम एक) डीएनए प्लाज्मिड एन्कोडिंग के intradermal वितरण का प्रदर्शन बढ़ाया EGFP की त्वचा confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोशिकाओं में प्रभावी अभिव्यक्ति की पुष्टि के लिए एक गोदने डिवाइस और ख) का उपयोग एक माउस मॉडल में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (PCX EGFP).
Protocol
1. प्लास्मिड डीएनए शोधन
- DH5α ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं में यूकेरियोटिक डीएनए प्लाज्मिड एन्कोडिंग EGFP (PCX EGFP) रूपांतरण. खाली PCX वेक्टर भी एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- संस्कृति और DH5α ई. कोलाई कोशिकाओं फसल और Qiagen EndoFree प्लास्मिड शोधन हैंडबुक के अनुसार pDNA शुद्ध.
- तक एक 0.22 सुक्ष्ममापी PVDF बाँझ फिल्टर के माध्यम से pDNA समाधान है, और यह -20 डिग्री सेल्सियस में उपयोग करें जब तक दुकान.
2. टैटू सिस्टम तैयारी
- निर्माता के निर्देशों के प्रति यूनिट बिजली की आपूर्ति करने के लिए हाथ इकाई और नियंत्रण पेडल कनेक्ट.
- लगभग 100 हर्ट्ज सुई दोलन आवृत्ति सेट. गोदने डिवाइस हम चुना (चुपके रोटरी टैटू सिस्टम) के लिए, 4 वोल्ट बिजली की आपूर्ति पर डायल करने के लिए सेट किया जाना चाहिए. उपयोगकर्ता के मैनुअल या अन्य गोदने सिस्टम के लिए तकनीकी सहायता के लिए देखें.
- सुई की गिरफ्तारी जीवाणुरहितउपयोग करने से पहले किरण. हम एक जानवर प्रति सुई सरणी का उपयोग करने की सलाह देते हैं. सुइयों के बाद साबुन के पानी से साफ किया जा रहा है और autoclaved reused किया जा सकता है.
- हाथ इकाई में सुई सरणी स्थापित और शिथिल प्लास्टिक पकड़ देते हैं.
- एक उपयुक्त सेटिंग के लिए प्लास्टिक की पकड़ ऊपर या नीचे हिल द्वारा सुई गहराई को समायोजित करें. हम हमारे माउस के प्रयोग के लिए लगभग 0.5 मिमी की एक सुई गहराई का इस्तेमाल किया.
- प्लास्टिक पकड़ जब सुई गहराई ठीक से सेट कर दिया जाता है, कसो और टैटू प्रणाली का उपयोग करने के लिए तैयार है.
3. पशु शेविंग
- गोदने उपचार के लिए साइट चुनें. साइट त्वचा की एक अपेक्षाकृत फर्म, फ्लैट, और मांसल क्षेत्र, उदाहरण के लिए, पशु hindleg की ओर होना चाहिए.
- (90 मिलीग्राम / किग्रा) ketamine और पशु के शरीर के वजन के अनुसार xylazine (5 मिलीग्राम / किग्रा) के एक मिश्रण के साथ एक माउस / balb ग anesthetize. अन्य जानवरों के लिए, अपनी संस्था के संज्ञाहरण दिशानिर्देशों को देखें.
- चेककरने के लिए पशु की पुष्टि करने के लिए अपने पैर pinching द्वारा पशु सजगता ठीक से anesthetized है.
- Trimmer का उपयोग करने के लिए बिजली नीचे पशु hindlegs पर बाल ट्रिम धीरे से और ध्यान. बालों को हटाने की योजना बनाई गोदने साइट और आसपास के क्षेत्र से.
- डिस्पोजेबल सुरक्षा रेजर के साथ अवशिष्ट छोटे बाल निकालें. सावधान रहो करने के लिए पशुओं की त्वचा में कटौती नहीं. ध्यान दें कि लोमनाशक क्रीम बाल हटाने एक वैकल्पिक पद्धति के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन हम लोमनाशक क्रीम पर हजामत बनाने का काम पसंद करते हैं.
- यदि आवश्यक संपीड़ित हवा के साथ त्वचा से आवारा कट बाल निकालें.
4. प्लास्मिड डीएनए के गोदना डिलिवरी
- यदि एक प्रतिरक्षण प्रोटोकॉल पहले स्थापित किया गया है, खुराक और डीएनए के लिए लागू किया जा समाधान की मात्रा के हिसाब से गणना की जानी चाहिए. हम व्यावहारिक रूप में एक छोटा सा मात्रा गोदने प्रक्रिया को अधिक प्रबंधनीय बनाने के रूप में उपयोग करने की सलाह देते हैं. EGFP के इस प्रदर्शन में, हम एक चोर पर डीएनए समाधान के 7.5 μlcentration 0.25 मिलीग्राम / एमएल, जो लगभग 1 2 सेमी की एक गोदने क्षेत्र पर लागू किया गया था. प्रतिरक्षण प्रयोगों के लिए, उच्च pDNA सांद्रता मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1,2 के लिए प्रेरित करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
- गोदने साइट पर सीधे pipetting द्वारा डीएनए समाधान लागू करें. वैकल्पिक रूप से, प्लास्टिक की चपेट में pipetting द्वारा डीएनए समाधान लोड तो तरल सुई और प्लास्टिक की पकड़ की नोक के बीच निलंबित कर दिया है. एक प्रदर्शन के लिए वीडियो देखें. हम दो तरीकों के बीच कोई उल्लेखनीय अंतर मनाया गया है. हालांकि, प्लास्टिक की चपेट में समाधान लोड ऊर्ध्वाधर त्वचा की सतहों पर लाभप्रद उदाहरण के लिए, हो सकता है.
- सुई दोलन आरंभ और गोदने साइट पर पशुओं की त्वचा पर हल्के दबाव के साथ सुई सरणी जगह. फिर oscillating सुई और धीरे धीरे एक रैखिक फैशन में पूरी गोदने क्षेत्र पर प्लास्मिड डीएनए देने कदम. सुई और त्वचा से बचने के बीच एक 90 डिग्री के कोण बनाए रखेंत्वचा के लिए lacerations.
- त्वचा का निरीक्षण करें. घर्षण और सूजन सामान्य हैं. यदि रक्त स्राव होता है, गोदने की प्रक्रिया को रोकने के लिए और सुई गहराई कम.
- लगभग 1 मिनट के लिए सुई आंदोलन जारी है, और तब गोदने की प्रक्रिया को रोकने.
- एक साफ कपास झाड़ू का उपयोग गोदने साइट पर सामयिक एनाल्जेसिक की एक पतली परत लागू. चांदी sulfadiazine क्रीम (SSD क्रीम) या Neosporin मरहम के रूप में इस तरह के सामयिक दर्दनाशक दवाओं दर्द या जानवरों के संकट को कम करने में मदद कर सकते हैं, और इसलिए यह उन्हें लागू संज्ञाहरण से पहले बंद पहनता है की सलाह दी है. जानवरों निरीक्षण अगले दिन दर्द या संकट (चाल निष्क्रियता के परिवर्तन) के संकेत के लिए. एनाल्जेसिक क्रीम Reapply अगर संकेत जारी रहती है.
5. प्रतिजन अभिव्यक्ति की पुष्टि
- गोदने उपचार (कृपया ध्यान दें कि अलग pDNA constructs अलग अभिव्यक्ति समय की आवश्यकता हो सकती है) के बाद 48 घंटा, माउस सीओ 2 निद्रावहन द्वारा euthanized है. दूसरे के लिएजानवरों, आपकी संस्था की इच्छामृत्यु दिशानिर्देशों को देखें.
- गोदने साइट पर त्वचा टुकड़े करना, और 4% paraformaldehyde में 4 डिग्री सेल्सियस विकेट पर ऊतक को ठीक.
- 70% इथेनॉल के साथ ऊतक कुल्ला, और 1X पीबीएस में यह इमेजिंग के लिए स्थानांतरण.
- पूरे एक confocal खुर्दबीन का उपयोग करने के लिए EGFP संकेतों के लिए जांच के ऊतकों की जांच. वैकल्पिक रूप से, त्वचा के ऊतकों पैराफिन मोम में एम्बेड किया जा सकता है और एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे वर्गों में जांच की.
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Representative Results
488 509 एनएम और उत्सर्जन शिखर एनएम पर एक उत्तेजना चोटी के साथ EGFP की अभिव्यक्ति माउस त्वचा कोशिकाओं में मनाया जा सकता है. 1.875 डीएनए के ग्राम खुराक, लगभग 3 × युक्त से 10 प्लाज्मिड की 17 प्रतियां, हम आम तौर पर 1 सेमी 2 क्षेत्र टैटू में 10-20 EGFP संकेतों मनाया. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का यह अपेक्षाकृत कम संख्या में पिछले एक अध्ययन 3 के परिणामों के साथ संगत है. EGFP अभिव्यक्ति (1 चित्रा) सबूत है कि पशुओं की त्वचा कोशिकाओं में डीएनए गोदने तकनीक का उपयोग प्लाज्मिड EGFP दिया गया था प्रदान करता है.
चित्रा 1 / balb ग एक confocal खुर्दबीन के साथ देखा माउस का hindleg पर गोदने उपचार के बाद 48 घंटा त्वचा कोशिकाओं में EGFP अभिव्यक्ति. ए) कई फोकल विमानों से EGFP संकेतों के प्रक्षेपण. बी) में EGFP अभिव्यक्ति एक गानाle सेल.
समस्या निवारण
1. कोई प्रतिजन अभिव्यक्ति (जैसे कोई EGFP सकारात्मक नियंत्रण संकेतों) का पता चला है.
- 5 गुना 2 द्वारा प्लास्मिड डीएनए समाधान की एकाग्रता बढ़ाएँ. हम 0.2 मिलीग्राम / एमएल के एक प्रारंभिक एकाग्रता की सलाह देते हैं. के रूप में 5 के रूप में उच्च सांद्रता मिलीग्राम / एमएल 3 प्रयोगों गोदने डीएनए के लिए सूचित किया गया है.
- त्वचा को गंभीर नुकसान से बचें, गोदने साइट पर माउस त्वचा के रूप में आसानी से छुरा और सुई से कट जाता है.
- सुनिश्चित करें कि डीएनए का निर्माण अपने प्रयोग के लिए उपयुक्त है.
- जेल वैद्युतकणसंचलन का प्रदर्शन करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्लास्मिड डीएनए के बहुमत supercoiled या बंद परिपत्र के रूप में है.
2. गंभीर खून बह रहा है या त्वचा को नुकसान गोदने साइट पर होता है.
- सुई गहराई घटाएँ.
- सुई सरणी और त्वचा के बीच एक 90 डिग्री के कोण बनाए रखें.
- के दौरान लागू बल घटाएँउपचार गोदने.
- गोदने आंदोलन की गति कम है.
3. पृष्ठभूमि संकेत भी उच्च जब इमेजिंग EGFP है.
- गोदने से पहले संभव के रूप में के रूप में ज्यादा बालों को हटाने के लिए एक नया डिस्पोजेबल सुरक्षा उस्तरा का प्रयोग करें. कभी कभी यह विच्छेदन से पहले फिर से दाढ़ी के लिए आवश्यक है.
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Discussion
डीएनए टीकाकरण पारंपरिक टीकाकरण रणनीतियों से सुरक्षित माना जाता है के रूप में यह हेरफेर की आवश्यकता नहीं है, करता है या, जीवित या तनु 4 रोगज़नक़ों के लिए टीके को बेनकाब. हालांकि, डीएनए टीकाकरण का परिणाम वितरण मार्ग पर निर्भर करता है. त्वचा Langerhans कोशिकाओं और वृक्ष के समान कोशिकाओं 1, और इस तरह प्रतिरक्षाजनकता और 5,6 का उपयोग की आसानी के मामले में एक टीकाकरण के लिए एक आदर्श स्थल के रूप में इस तरह के प्रतिजन कोशिकाओं पेश में प्रचुर मात्रा में है. नतीजतन, intradermal टीकाकरण रणनीति डीएनए टीके के लिए सबसे लोकप्रिय विकल्पों में से एक है. डीएनए गोदने, जैसा कि इस वीडियो में दिखाया गया है और एक सरल अभी तक होनहार एक डीएनए वैक्सीन intradermally प्रशासन है. दिलचस्प है, सूजन गोदने प्रक्रिया की वजह से प्रतिक्रियाएं भी एक प्राकृतिक और शक्तिशाली सहायक 1,2 के रूप में सेवा कर सकता है. यह बताया गया है कि डीएनए गोदने बंदरों में एक 100 गुना टी सेल प्रतिक्रिया में वृद्धि करने के लिए प्रकाश में लाना कर सकते हैं, के रूप में जानवरों imm में टी सेल प्रतिक्रिया की तुलनाइंट्रामस्क्युलर 7,8 मार्ग के माध्यम से unized. अन्य जीन बंदूक के रूप में चमड़े का प्रसव के तरीके की तुलना में, डीएनए गोदने के कई फायदे रखती है. सबसे पहले, डीएनए गोदने महंगे उपकरण और वाहक, यानी सोने के कणों की आवश्यकता नहीं है. इस टीके के वितरण के मामले में विशेष रूप से विकासशील देशों के लिए एक बहुत बड़ा फायदा होगा. दूसरे, यह जाना जाता है कि उच्च हवा के दबाव pDNA कतरनी बल की वजह से नुकसान पैदा कर सकता है, जो प्रतिजन अभिव्यक्ति के स्तर में कमी कर सकता है. एक अध्ययन में डीएनए गोदने नुकसान कि कुल 9 pDNA के 3% से कम दिखाया गया है. अंत में, डीएनए गोदने त्वचा के एक बड़े क्षेत्र को कवर कर सकते हैं, जो संभवतः एक मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बटोर सकता है. गोदना उपकरणों को भी पेप्टाइड / प्रोटीन टीके देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और दोनों humoral और सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 10 प्रेरित सिद्ध किया गया है. अब हम उपयोग त्वचा हमारे पशु प्रयोगों में नियमित रूप से एक डीएनए में गोदने प्राइम प्रोटीन को बढ़ावा देने के टीकाकरण प्रोटोकॉल (तीन डीएनए primes का पालनदो प्रोटीन से 16 सप्ताह की अवधि से अधिक बढ़ा देता है), और हम सफलतापूर्वक चूहों में एचआईवी-1 gp120 खिलाफ मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रेरित किया है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम सहयोगात्मक विज्ञान, NYUMC माइक्रोस्कोपी कोर कार्यालय, पर उनकी सहायता और तकनीकी सहायता के लिए हांगकांग लैब और डॉ. यान देंग के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम एड्स अनुसंधान के लिए न्यू यॉर्क विश्वविद्यालय केंद्र (CFAR, NIH अनुदान AI027742) से एक पायलट अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCX-EGFP plasmid DNA | Clontech | ||
| STEALTH Rotary Tattoo System | Worldwide Tattoo Supply | STEALTH-L | |
| Tattoo needles | Worldwide Tattoo Supply | 1207RSB | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| 0.22 μm PVDF sterile filter | Millipore | SLGV013SL | |
| electrical hair trimmer | Commercially available | ||
| disposable safety razors | Commercially available | ||
| Silver Sulfadiazine Cream | Watson | NDC 0591-0810-55 | |
| Ketamine HCL | NDC 0856-2012-01 | ||
| Zylazine Sterile Solution | NADA 139-236 |
References
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- Pokorna, D., Rubio, I., Muller, M. DNA-vaccination via tattooing induces stronger humoral and cellular immune responses than intramuscular delivery supported by molecular adjuvants. Genet. Vaccines Ther. 6, 4 (2008).
- van den Berg, J. H. Optimization of intradermal vaccination by DNA tattooing in human skin. Hum. Gene Ther. 20, 181-189 (2009).
- Liu, M. A.
- Koide, Y., Nagata, T., Yoshida, A., Uchijima, M.
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