Summary
Hud tatuering är en potent och säkert sätt att leverans DNA-vaccin intradermalt. Här, är en DNA-plasmid som kodar för EGFP som levereras av tatuering på huden av ett laboratorium mus och uttrycket av EGFP i hudcellerna därefter kontrolleras av konfokalmikroskopi.
Abstract
Nukleinsyra-baserad vaccination är ett ämne av växande intresse, särskilt plasmid-DNA (pDNA) som kodar för immunologiskt viktiga antigener. Efter den manipulerade pDNA administreras till vacciner, är det transkriberas och translateras till immunogena proteiner som kan framkalla svar från immunsystemet. Många sätt att leverera DNA-vaccin har undersökts, men varje leverans väg har sina egna fördelar och fallgropar. Hud tatuering är en ny teknik som är säker, kostnadseffektiv och bekvämt. Dessutom kan de punkterar orsakade av nålen också tjäna som en potent adjuvans. Här, vi) demonstrerar intradermal leverans av plasmid-DNA som kodar för förstärkt grönt fluorescerande protein (PCX-EGFP) i en musmodell med en tatuering anordning och b) bekräfta effektiv expression av EGFP i hudceller med konfokalmikroskopi.
Protocol
1. Plasmid-DNA Rening
- Omvandla den eukaryota plasmid-DNA som kodar för EGFP (PCX-EGFP) i DH5a E. coli-kompetenta celler. Den tomma PCx Vektorn kan också användas som en negativ kontroll.
- Kultur och skörd DH5a E. coli-celler och rena pDNA enligt Qiagen EndoFree plasmidrening Handbook.
- Filter pDNA lösningen genom ett 0,22 um PVDF sterilfilter, och förvara den vid -20 ° C fram till användning.
2. Tatuering System Preparation
- Anslut handenheten och styrpedalen till nätdelen enligt tillverkarens anvisningar.
- Ställ in frekvensen nål svängning till cirka 100 Hz. För tatuering enhet vi valde (Stealth roterande tatueringen System), bör ratten på nätaggregatet ställas in på 4 volt. Se manualer eller teknisk support för andra tatuering system.
- Sterilisera nålen array före användning. Vi rekommenderar att du använder en nål array per djur. Nålarna kan återanvändas efter att rengöras med tvålvatten och autoklaveras.
- Montera nålen arrayen i den handhållna enheten och löst fästa plasthandtag.
- Justera nålen djup till en lämplig inställning genom att flytta plasthandtag uppåt eller nedåt. Vi använde en nål djup av ca 0,5 mm för vår mus experiment.
- Dra åt plasthandtag när nålen djupet är rätt inställd och tatuering systemet är redo att användas.
3. Animal Rakning
- Välj platsen för tatuering behandling. Webbplatsen bör vara en relativt fast, platt, och köttiga område av huden, till exempel, sidan av djurets bakben.
- Söva en BALB / c-mus med en blandning av ketamin (90 mg / kg) och xylazin (5 mg / kg) i enlighet med djurets kroppsvikt. För andra djur, se anestesi riktlinjer din institution.
- Kontrolleradjurets reflexer genom att nypa dess fot för att bekräfta att djuret är ordentligt bedövas.
- Använd den elektriska trimmern för att trimma ner håret vid djurets bakben långsamt och försiktigt. Ta bort håret från den planerade tatuering webbplats och det omgivande området.
- Ta bort den resterande kortare hår med disponibel rakhyvel. Var noga med att inte skära djurets hud. Observera att hårborttagningskräm kan användas som ett alternativ hår-borttagning metod, men föredrar vi rakning över hårborttagningskräm.
- Avlägsna herrelösa skurna hår från huden med tryckluft vid behov.
4. Leverans av plasmid-DNA genom tatuering
- Om en immuniseringsprotokoll har fastställts tidigare, bör dosen och volymen av DNA-lösning som skall appliceras beräknas därefter. Vi rekommenderar att du använder en så liten volym som praktiskt att göra tatueringar processen mer hanterbar. I denna EGFP demonstration använde vi 7,5 pl DNA-lösning vid en koncentrationen av 0,25 mg / ml, som applicerades på en tatuering yta av ca 1 cm 2. För immunisering experiment kan högre pDNA koncentrationer krävs för att inducera en stark immunsvar 1,2.
- Applicera DNA-lösningen genom att pipettera direkt på tatuering platsen. Alternativt, ladda DNA-lösningen i plast grepp genom pipettering, så att vätskan är upphängd mellan nålen och spetsen av plast grepp. Se videon för en demonstration. Vi har observerat någon märkbar skillnad mellan de två metoderna. Emellertid kan laddning av lösningen i plasthandtag vara fördelaktigt på vertikala hudytor, till exempel.
- Starta nålen svängning och placera nålen array med lätt tryck på djurets hud på tatuering platsen. Flytta sedan den oscillerande nålen försiktigt och långsamt på ett linjärt sätt för att leverera plasmid-DNA över hela tatuering området. Upprätthålla en 90-graders vinkel mellan nålen och huden för att undvikalacerationer till huden.
- Observera huden. Nötning och inflammation är normala. Om blödningen inträffar, stoppa tatuering processen och minska nålen djup.
- Fortsätt nålen rörelsen för ca 1 min och sedan stoppa tatuering processen.
- Använd en ren bomullspinne för att applicera ett tunt lager av lokalsmärtstillande på tatuering plats. Aktuella analgetika såsom silversulfadiazin Cream (SSD Cream) eller Neosporin salva kan lindra smärta eller obehag hos djuren, och därför rekommenderas att tillämpa dem innan anestesi avtar. Observera djuren nästa dag efter tecken på smärta eller lidande (byte av gång, inaktivitet). Tillämpa smärtstillande kräm om tecknen kvarstår.
5. Bekräftelse av antigenuttryck
- 48 timmar efter tatuering behandling (observera att olika pDNA konstruktioner kan kräva olika uttryck gånger), är musen avlivas av CO 2 narkos. För andradjur, se dödshjälp riktlinjer din institution.
- Dissekera huden vid tatuering plats, och fixera vävnaden i 4% paraformaldehyd vid 4 ° C över natten.
- Skölj vävnaden med 70% etanol, och överför till 1X PBS för avbildning.
- Undersöka hela vävnaden med ett konfokalmikroskop för att kontrollera EGFP signaler. Alternativt, kan hudvävnaden vara inbäddat i paraffin och undersöktes i sektioner under ett fluorescerande mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uttrycket av EGFP med en excita topp vid 488 nm och emissionstopp vid 509 nm kan observeras i celler mushud. Från en 1,875 ug DNA, innehållande ca 3 x 10 17 kopior av plasmiden, observerade vi typiskt 10-20 EGFP signaler i de 1 cm 2 tatuerade område. Detta relativt låga antalet transfekterade celler stämmer överens med resultaten från en tidigare studie 3. Den EGFP uttryck (figur 1) ger bevis för att EGFP plasmid levereras till djurets hud celler med DNA tatuera tekniken.
Figur 1. EGFP expression i hudcellerna 48 timmar efter behandlingen tatuering på bakben av en BALB / c-mus betraktades med ett konfokalt mikroskop. A) En projektion av EGFP signaler från flera fokalplan. B) EGFP uttryck i en single-cell.
Felsökning
1. Ingen antigenexpression upptäcks (t.ex. inga EGFP positiva styrsignaler).
- Öka koncentrationen av plasmid-DNA-lösning med 2 - till 5-faldigt. Vi rekommenderar en startkoncentration av 0,2 mg / ml. Koncentrationer så höga som 5 mg / ml har rapporterats för DNA tatuering experiment 3.
- Undvik allvarlig skada på huden, som mushud på tatuering webbplats lätt att skära av rakhyvlar och nålar.
- Se till att DNA-konstruktionen är lämplig för experimentet.
- Utför gelelektrofores för att se de flesta av plasmid-DNA är i supertvinnade eller stängd cirkulär form.
2. Allvarlig blödning eller skador på huden sker vid tatuering platsen.
- Minska nålen djup.
- Upprätthålla en 90-graders vinkel mellan nålen arrayen och huden.
- Minska den kraft som appliceras undertatuering behandling.
- Minska hastigheten på tatuering rörelsen.
3. Bakgrunden signalen är för hög när avbildning EGFP.
- Använd en helt ny disponibel rakhyvlar för att ta bort så mycket hår som möjligt innan tatuering. Ibland är det nödvändigt att raka igen före dissektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA-vaccination anses säkrare än traditionella vaccinationsstrategier eftersom det inte kräver manipulation av, eller exponera de vacciner som, levande eller försvagade patogener 4. Beror emellertid resultatet av DNA-vaccination tungt på leverans rutten. Hud är rikligt förekommande i antigenpresenterande celler, såsom Langerhans celler och dendritiska celler 1, och därmed en idealisk plats för immunisering i termer av immunogenicitet och lättillgänglighet 5,6. Som ett resultat, är intradermal vaccinationsstrategi en av de mest populära alternativen för DNA-vaccin. Som visas i den här videon, är DNA tatuering ett enkelt men lovande sätt att administrera ett DNA-vaccin intradermalt. Intressant, kan de inflammatoriska svar som orsakas av tatueringar processen fungerar också som en naturlig och potent adjuvans 1,2. Det har rapporterats att DNA tatuering kan framkalla upp till en 100-faldig ökning av T-cellsvar i apor, jämfört med T-cellsvar hos djur immunized intramuskulärt 7,8. Jämfört med andra dermala tillförselmetoder, såsom genkanon håller DNA-tatuering flera fördelar. Först kräver DNA-tatuering inte dyr utrustning och transportörer, dvs guldpartiklar. Detta skulle vara en stor fördel när det gäller vaccin fördelning, särskilt för utvecklingsländer. Andra, är det känt att högt lufttryck kan orsaka pDNA skada på grund av skjuvkraft, vilket skulle kunna minska nivån antigenexpression. En studie har visat att DNA-tatuering skadar mindre än 3% av den totala pDNA 9. Slutligen kan DNA-tatuering täcka ett stort område av huden, som potentiellt skulle kunna framkalla ett starkare immunsvar. Tatueringsproceduren anordningar kan också användas för att leverera peptid / protein vaccin, och har visat sig inducera både humorala och cellmedierade immunsvar 10. Vi använder nu huden tatuering rutinmässigt i våra djurförsök i en DNA prime-protein boost vaccination protokoll (tre DNA primtal följdeav två-protein ökar under en period av 16 veckor), och vi har framgångsrikt induceras i möss starka immunsvar mot HIV-1 gp 120.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka alla medlemmar i Kong Lab och Dr Yan Deng på Mikroskopi Core Office of Collaborative Science NYUMC för deras hjälp och teknisk support. Detta arbete stöddes av en pilot bidrag från New York University Center for AIDS Research (CFAR, NIH bidrag AI027742).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCX-EGFP plasmid DNA | Clontech | ||
| STEALTH Rotary Tattoo System | Worldwide Tattoo Supply | STEALTH-L | |
| Tattoo needles | Worldwide Tattoo Supply | 1207RSB | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| 0.22 μm PVDF sterile filter | Millipore | SLGV013SL | |
| electrical hair trimmer | Commercially available | ||
| disposable safety razors | Commercially available | ||
| Silver Sulfadiazine Cream | Watson | NDC 0591-0810-55 | |
| Ketamine HCL | NDC 0856-2012-01 | ||
| Zylazine Sterile Solution | NADA 139-236 |
References
- Bins, A. D. A rapid and potent DNA vaccination strategy defined by in vivo monitoring of antigen expression. Nat Med. 11, 899-904 (2005).
- Pokorna, D., Rubio, I., Muller, M. DNA-vaccination via tattooing induces stronger humoral and cellular immune responses than intramuscular delivery supported by molecular adjuvants. Genet. Vaccines Ther. 6, 4 (2008).
- van den Berg, J. H. Optimization of intradermal vaccination by DNA tattooing in human skin. Hum. Gene Ther. 20, 181-189 (2009).
- Liu, M. A.
- Koide, Y., Nagata, T., Yoshida, A., Uchijima, M.
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Verstrepen, B. E. Improved HIV-1 specific T-cell responses by short-interval DNA tattooing as compared to intramuscular immunization in non-human primates. Vaccine. 26, 3346-3351 (2008).
- Potthoff, A. Immunogenicity and efficacy of intradermal tattoo immunization with adenoviral vector vaccines. Vaccine. 27, 2768-2774 (2009).
- Quaak, S. G. DNA tattoo vaccination: effect on plasmid purity and transfection efficiency of different topoisoforms. J. Control Release. 139, 153-159 (2009).
- Pokorna, D. Vaccination with human papillomavirus type 16-derived peptides using a tattoo device. Vaccine. 27, 3519-3529 (2009).
