Den Dig Uppgift: En enkel doft Diskriminering avslöjar Underskott Efter Frontal Brain Damage

Summary

I detta protokoll är en ny tillämpning av doft diskriminering beskrivs. Den Dig uppgift är en ganska billig uppgift som kan användas för att bedöma frontalt-medierad kognition efter hjärnskada.

Abstract

Kognitiv nedsättning är den vanligaste orsaken till funktionshinder hos människa efter hjärnskador, men de beteendemässiga uppgifter som används för att bedöma kognition i gnagarmodeller av hjärnskada saknas. Upplåning från operant litteraturen vårt laboratorium använde en grundläggande paradigm doft diskriminering ^1-4 för att bedöma brister i frontalt-skadade råttor. Tidigare har vi kortfattat beskrivit Dig uppgiften och visade att råttor med frontal hjärnskada visar allvarliga brister i flera tester inom uppdraget ^5. Här presenterar vi en mer detaljerad protokoll för denna uppgift. Råttor placeras i en kammare och tillåts att diskriminera mellan två doftande sand, av vilka den ena innehåller en förstärkare. Rättegången avslutas efter råttan antingen rätt diskriminerar (definierad som gräva i rätt doftande sanden), felaktigt diskriminerar eller 30 sek förflutit. Råttor som korrekt diskriminerande får återhämta sig och konsumera förstärkare. Råttor som discriminate felaktigt omedelbart avlägsnas från kammaren. Detta kan fortsätta genom olika bakslag och dofter nya. Den primära analysen är noggrannheten för varje doft parning (kumulativ andel korrekt för varje doft). De allmänna resultaten från Dig uppgiften tyder på att det är en enkel experimentell beredning som kan bedöma brister i råttor med bilateral främre kortikal skada jämfört med råttor med unilateral parietala skador. Det Dig Uppgiften kan också lätt integreras i en befintlig kognitivt test batteri. Användningen av fler arbetsuppgifter som denna kan leda till noggrannare testning av frontal funktion efter skada, vilket kan leda till terapeutiska alternativ för behandling. Alla djur används har utförts i enlighet med protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén.

Introduction

Hjärnskador till följd av traumatisk hjärnskada (TBI) och stroke är en av de främsta orsakerna till död och handikapp i USA. Tillsammans dessa sjukdomar resulterar i en totalt nästan 2,5 miljoner incidenter, med nästan 500.000 leder till dödsfall eller försämrad ^6-7. Trots detta tung belastning på samhället, har mycket få behandlingar har utvecklats för att behandla antingen TBI eller stroke. Till viss del kan bristen på tillgängliga behandlingsalternativ tillskrivas otillräckliga beteendemässiga bedömningar av nya läkemedel och terapier ^8. Framför allt finns det en brist på uppgifter till noggrant och lyhört utvärdera effekterna av behandlingarna på de olika kognitiva brister efter hjärnskada i den prekliniska litteraturen. För närvarande de flesta kognitiva bedömningar som utförs utvärdera rumsliga minne med en labyrint uppgift som Morris water maze ^9. Det finns flera skäl till denna avsaknad av testning innefattande den tid det tar attfullt karakterisera och utvärdera kognitiva brister, det starka beroendet på dyr utrustning och expertis för att utnyttja operanta uppgifter och den hastighet med vilken dessa utvärderingar kan utföras. I detta syfte har vi anpassat en grundläggande uppgift doft diskriminering, Dig uppgiften att bedöma kognition efter hjärnskada. Den Dig Uppgiften är avsedd att vara en billig, snabb och effektivt verktyg för att utvärdera kognitiv dysfunktion efter hjärnskada från en TBI eller stroke.

Den Dig Uppgiften bygger på de grundläggande operanta principer lärande och beslutsfattande. Eftersom det bara är en två-val beslut paradigm representerar denna uppgift en av de enklaste diskriminering som kan göras. I protokollet nedanför detaljerna för inrättandet uppgiften samt utbildning metoden kommer att beskrivas. Vi har funnit att denna uppgift är starkast vid bedömningen frontalt-medierade kognitiva brister jämfört med unilaterala parietala underskott, men det har ännu inte testas under en modell avhippocampus skada ^5. Helst skulle denna uppgift vara lämpad för att utvärdera effektiviteten av en behandling eller terapi om återvinning av frontal underskott efter en skada. Det är dock möjligt att med modifieringar denna uppgift också skulle kunna användas för att utforska mer komplexa beslutsfattande beteenden som impulsivitet och generaliserad matchning.

Protocol

1. Material som krävs för utbildning och testning

1. Testa kammare. Varje behållare tillräckligt stor för att rymma ett djur och två koppar doft. Vårt laboratorium som används modifierade operanta kammare (Med Associates Inc.) med golv barer bort för att göra plats för doft koppar (figur 1).
2. Doft koppar och mugghållare. Cups tillräckligt breda och djupa för att medge grävning och någon mekanism / innehavaren att stabilisera dem (figur 2).
3. Doftande sand. Vår test som används dofter tidigare fastställts att inte visa svarsbias hos råttor (kakao, basilika, kummin, kaffe) ^4. Varje doftande sanden blandades vid ett förhållande av 1 g luktämne till 110 g oparfymerat, ren lekplats "sandlåda" sand och kan lagras i lufttäta behållare för upp till 6 månader.
4. Förstärkare. Vi utnyttjade fruktbitar loop spannmål som en förstärkare. Vi rekommenderar att utsätta djur till förstärkare (via placering i deras hem burar) 3 till 5 dagar innan traansvara för prövningen att övervinna neophobic svar.
5. Stoppur eller timer.

2. Djurhantering innan träning

1. Hantering. Som djur kommer att placeras i och avlägsnas från kamrarna gånger under träning / testning, rekommenderar vi hanterar djur 04:57 dagar före utbildning för att bekanta sig med mänsklig kontakt.
2. Motiverande. För att motivera djur att utföra den här uppgiften är en viss nivå av mat utsatthet nödvändig. Mat begränsning bör inledas minst tre dagar före både träning och testning och djur kan hållas vid 90% av fri-matning vikt. Vanligtvis mängder 15-20 g chow per dag är tillräckligt, men djurens vikt bör kontrolleras varannan dag medan livsmedel begränsar.

3. Gräv Utbildning

Utbildning ett djur att gräva i sand kan åstadkommas i ett genomsnitt av åtta sessioner under en fyra dagars period. Under gräva traansvara för prövningen, bör kammaren upprättas genom att placera två doft koppar i mekanismen / hållaren och placera installationen doft koppen in i kammaren. Det allmänna förfarandet beskrivs nedan med målet att forma djuret från att konsumera förstärkare att helt gräva i sand för att hämta den.

1. Session 1 - kammare tillvänjning och tidskrifter utbildning. Helt fylla doften koppar med förstärkare (ingen sand). Placera djuret i apparaten under 30 minuter tillåter djuret att fritt konsumera förstärkare.
2. Session 2 - sand tillvänjning. Helt fylla doften koppar med förstärkare och häll en liten mängd oparfymerad sand i varje kopp, fyller inte mer än hälften av koppen. Placera djuret i apparaten under 30 minuter tillåter djuret att fritt konsumera förstärkare.
3. Session 3 - yta gräva. Fyll doften koppar med en jämn blandning av förstärkare och oparfymerat sand, vilket flera utsatta förstärkare. Placera djuret i anordningen för30 minuter tillåter djuret att fritt konsumera förstärkare. I processen att konsumera de exponerade förstärkare, bör djuret avslöja ytterligare förstärkare under ytan av sanden. Djuret ska övergå från att använda sin mun att använda sina framtassarna för att ta bort varje förstärkare från sanden.
4. Session 4 - gräva. Fyll doften koppar med en blandning av 1 del förstärkare till 3 delar oparfymerat sand, vilket 1-2 förstärkare exponeras. Placera djuret in i kammaren under 30 min så att djuret fritt konsumera förstärkare. Djuret ska börja gräva med sina framtassar att avslöja ytterligare förstärkare och ta bort dem från sanden. Djur som inte börjar att avslöja förstärkare efter en 10 minuter period bör stödjas (forskaren bör avslöja ett förstärkare i taget tills djuret lär).
5. Session 5 - full gräva. Fyll doften koppar med en blandning av 1 del förstärkare till 3 delar oparfymerat sand och lämnar inga exponerade förstärkare. Place djuret i apparaten under 30 minuter tillåter djuret att fritt konsumera förstärkare. Djuren bör stödjas vid behov. Vissa djur kan behöva flera instanser av denna session för att visa gräva beteende.
6. Session 6 - rättegång struktur tillvänjning. Placera tre förstärkare i djupa, mitten, och grunda positioner i sanden i varje doft kopp. Placera djuret in i kammaren tills alla tre hämtas från varje kopp, bistå vid behov. När alla har hämtats placerar djuret i en anläggning apparater för 15-30 sek och återställa doft koppar som beskrivs i detta steg. Därefter placerar djuret tillbaka in i kammaren och upprepa processen tills djuret har avslutat fyra totalt prövningar. Djuret ska vänja sig placeras i den hållande apparaten och börja gräva direkt när den placeras i kammaren. Djuret bör också visa fullständig gräva beteende och hämta förstärkare vid botten av doften koppen.
7. Session 7 - enstaka förstärkare. Placera en enda förstärkare på halva djupet av sanden i varje kopp. Placera djuret in i kammaren och låt den hämta både förstärkare och sedan placera den i innehav apparater för 30 sek. Upprepa denna process för fyra totalt prövningar. Djuret ska börja gräva snabbare och kräver minimal hjälp från forskaren.
8. Session 8 - fingerad diskrimineringstester. Fyll koppar som beskrivs i sessionen 7. Ge djuret 30 sekunder att hämta båda förstärkare. Placera djuret till anläggningen apparaten när båda har hämtats eller 30 sekunder har förflutit. Upprepa detta för det antal försök som kommer att användas i testfasen. Djuren bör lära sig att gräva snabbt när de placeras tillbaka in i kammaren.
9. Ytterligare sessioner. Beroende på första diskrimineringstester kan försöksledaren vill utföra ytterligare sessioner att bekanta djuret med de givna dofter. Råttor tenderar att initialt uppvisa neophobia och föredrarvälkända dofter associerade tidigare med armering ^10.

4. Diskrimineringstester

1. Forskaren bör välja en doft parning, inklusive vilka doft kommer att agnade med förstärkare (rätt diskriminering) och som inte kommer. Ytterligare beslut, t.ex. antal diskriminering och återföringar, maximalt antal dagar och prövningar, och om provkörning innan skadan kommer till stor del baserad på experimentell fråga (se kompletterande anmärkningar nedan).
2. Råttor kan testas och data registreras för hand av forskaren. Forskaren bör registrera varje försök: rätt eller fel val, latens för att initiera gräva och prövningar där en råtta gånger ute på.
   1. Antalet administrerade försök bör vara gottfinnande forskaren (se kompletterande anmärkningar nedan).
   2. Längden av rättegången skall vara gottfinnande forskaren (se kompletterande anmärkningar nedan).
   3. Den forskarecher bör slumpmässigt rättegången struktur (vänster-höger placering av doft koppar), med förbehållet att inte mer än tre försök i rad är på en viss sida. Detta kommer att bidra till att minska sida partiskhet.
3. För att initiera varje försök, placerar djuret i kammaren inför den bakre, på lika avstånd från varje kopp. Placera ett djur närmare till en kopp kan öka risken att utveckla en bias.
4. Om djuret rätt diskriminerar, låt det att hämta och konsumera armeringen och ta sedan bort det till att hålla apparaten i 30 sekunder. Om det timeout eller väljer fel, ta bort den omedelbart, innan det "korrigerar" själv, och placera den i innehav apparater för 30 sek.
5. Upprepa denna process för det valda antalet försök.
6. När ett djur uppnår ett förutbestämt kriterium (dvs.> 80% noggrannhet per dag under tre på varandra följande dagar), kan djuret gå vidare till nästa diskriminering / omkastning och upprepa ovanstående process.
5. Ytterligare anmärkningar
1. Testning i vårt laboratorium visade att utbildning och prov fungerar bäst med hälften av en frukt slinga spannmål bit för att undvika mättnad.
2. Under utbildningen kan vissa djur behöver mer hjälp än andra. Vi rekommenderar att du gör det som är nödvändigt för att uppnå gräva beteende. Men när tester startar vi försöka att aldrig ingripa och förbättra en råtta gräva beteende.
3. Variation av antalet prövningar kan vara tillräcklig för olika laboratorier. Test i vårt laboratorium har använt 6, 8 och 12 försök per session, 1 session per dag, och har hittat en preferens för 8 rättegången installationen.
4. Variera längden av rättegången kan vara nödvändigt i vissa experimentella uppställningar (t.ex. djur under en stress paradigm kan behöva ökad rättegång gånger eller färre totala prövningar).
5. En förinställd kriterium bör användas för att avgöra när ett djur har bemästrat en diskriminering. Testning i vårt laboratorium har krävt en Accuracy är större än 80% (5/6 studier, 7/8 försök, eller 10/12 försök) per dag under 3 på varandra följande dagar. Emellertid kan en högre kriterium (85%) också användas.
6. Förinställda trösklar / maximum bör användas för det maximala antalet dagar som tillbringas på en viss doft. Detta kommer att i hög grad bestäms av forskningsfråga. Till exempel är våra laboratoriestudier TBI och från och med resultat av den progressiva karaktären av TBI, råttor som inte har drabbats kriterium gått vidare till en ny diskriminering / återföring efter 12 dagars testning.
7. Fattar beslut om att provkörning eller bara posttest är en fråga som i hög grad bestäms av experimentell riktning. Pretesting tillåter en att utföra en bedömning av minne på djuret efter skada, som kan vara relevant beroende på den skada typ. Tillåter dock efter tester en att undersöka skillnader i förvärv på de diskriminering mellan grupper. Vårt laboratorium har och kommer att fortsätta att använda båda.

Representative Results

Det finns två huvudsakliga variabler som kan registreras i Dig uppgiften: Korrekt / Felaktig och latens. Däremot kan svarsbortfall också registreras och analyseras eftersom de kan vara viktigt när man överväger motivationen. Dessa kan användas för att generera åtgärder för analys som noggrannhet (# korrekta / totalt prövningar), svarsbias ^11, och latens. Dessa åtgärder kan användas för att bedöma flera olika typer av lärande, beroende på utformningen av experimentet (se kompletterande anmärkningar ovan). Pretesting av djur kan forskaren att utvärdera minne för en lärd diskriminering. Återföring av lärda diskriminering tillåter forskare att se hur väl ett djur kan anpassa sig till en föränderlig oförutsedda. Inlärning av nya diskriminering möjligt för forskare att jämföra inlärning mellan olika doft ligaspel samt utvärdera kapaciteten för nya lärande.

Beroende på utformningen av studien (se kompletterande anmärkningar ovan), kan dessa åtgärderanalyseras i en upprepad åtgärder utformning eller kan fällas ihop till en enda variabel. Tidigare kollapsade vi noggrannhet i ett mått på kumulativ andel rätt för att analysera varje doft diskriminering separat ^5. Detta skedde genom att summera antalet korrekta diskriminering och dividera med det totala antalet försök för varje diskriminering. En serie av en-vägs mellan-ämnen analys av avvikelser (ANOVA) användes sedan för att undersöka gruppskillnader för varje efter skada doft diskriminering. Emellertid kan mer kraft erhållas för analys genom att använda avancerade statistiska metoder såsom blandade effekter modellering. Ett annat alternativ är att använda signal-detektering teori för dataanalys. Detta är en populär metod i den mänskliga beslutsfattandet litteratur och tillåter forskaren att undersöka de flesta av data från ett givet ämne i en enda graf och snabbt bedöma graden av korrekthet, fördomar och underskott ^12. Val av analytiska strategi kommer att vara largely driven av experimentell fråga om man vill jämföra olika typer av lärande, utvärdera ett enda typ av inlärning, eller tillämpa en beslutsprocess förhållningssätt till data.

Efter bilaterala främre hjärnskada, har vårt laboratorium visade att råttor lider stora underskott i stort sett alla typer av lärande i denna uppgift. Frontalt-skadade djur visade ett underskott i minnet för en tidigare lärt diskriminering samt svårt att lära återföring av den doften parning (Figur 3). Frontal djur hade också svårt att lära nya diskriminering (Figur 3). I enlighet med tidigare forskning ^13, fanns det också en stor ökning av variationen i frontalt skadade djur (Figur 3).

Däremot har ensidiga parietala skador i vårt laboratorium visat några underskott inom alla diskriminering i denna uppgift. Ensidiga råttor visade inga brister i migMory för en tidigare lärt diskriminering och förvärvade också återföring diskriminering mycket snabbt (Figur 4). De lärde nya doft ligaspel mycket snabbt också (Figur 4). Dessutom var variationen inom ensidigt-skadade gruppen mycket låg, med de flesta råttor fungerar optimalt på uppgiften.

Figur 1. Test i vårt laboratorium utfördes i en bank av standard operanta kammare (Med Associates Inc.) som anpassade för användning i denna uppgift genom att ta bort fyra konsekutiva golv-barer att öppna upp utrymme för två doft koppar.

Figur 2. Testning i vårt laboratorium användes PVC rör-ändblockeringar (6 cm lång och 5,5 cm i diameter) som doften cups och en bit plexiglas (10 x 22 cm) med två borrade runda hål (5,5 cm i diameter) som doften mugghållaren.

Figur 3. Detta diagram visar typiska prestanda sken (blått) vs frontalt-skadade (röd) råttor över flera olika faser av tester i två olika format. I panel A, data representeras som ett stapeldiagram med vita prickar som representerar datapunkter för enskilda råttor i varje grupp. I panel B, är samma data grafiskt i en linjegraf. Det var ingen skillnad på före skadan diskriminering förvärv. Men efter skada och på samma diskriminering falska råttor prestera på 93% kumulativ procent rätt medan skadade råttor prestera på 65% kumulativ procent korrekt. När en omkastning av diskriminering administrerades, injmätt råttor sjunka till under slump prestanda. På liknande sätt en ny doft diskriminering frontalt-skadade råttor hade svårt att lära sig nya parning och stannade vid under slump prestanda. Klicka här för att se större bild .

Figur 4. Detta diagram visar typiska prestanda sken (blå) mot ensidiga parietally-skadade råttor (grön) över flera olika faser av testning i två olika format. I panel A, data representeras som ett stapeldiagram med vita prickar som representerar datapunkter för enskilda råttor i varje grupp. I panel B, är samma data grafiskt i en linjegraf. Det är ingen skillnad mellan grupperna på någon av diskriminering. Ensidigt injured råttor som utförs vid eller i vissa fall, något högre än falska nivåer efter skada. Klicka här för att se större bild .

Discussion

I den här videon, har vi visat hur Dig uppgift kan utföras med relativt låg kostnad material och, med viss erfarenhet, kan tester utföras relativt snabbt (~ 10 min / djur). Detta gör det möjligt för den uppgift som lätt integreras i befintliga testbatterier för TBI, stroke och andra hjärnskador. Den Dig uppgift är också robust att den kan bedöma flera olika aspekter av kognition, inklusive utvärderingar av tidigare lärande, återföringar och förvärv nya (t.ex. set förskjutning). Viktigast har Dig uppgiften har visat sig vara effektiva vid bedömningen främre funktion efter hjärnskada. Dessutom har en liknande gräva paradigm använts för att studera värdeöverföring i råttor efter hippocampus skada ^4, och sålunda kan lätt studerats efter TBI.

De främsta fördelarna med uppgifter som denna är möjligheten att bedöma andra former av kognition än vad som normalt testas i de flesta hjärnskada studtalet. Det för närvarande finns en brist på enkla, snabbt förvärvade uppgifter för bedömning frontalt-medierad kognition efter hjärnskada. Inom området för experimentell TBI, finns det ett starkt beroende av labyrinter som enda bedömning av kognition ^9. Diskriminering och val beteende är viktiga aspekter av frontalt-medierad kognition som behöver utvärderas efter hjärnskada. Dessa har studerats under många olika paradigm (fördröjd matchning till prov, differentiell förstärkning av låg svara, ansträngning baserad beslutsfattande etc.) inom området för experimentell analys av beteende, men saknas i studier av hjärnskada ^14-16. Utveckling av nya läkemedel för behandling av hjärnskador kräver validering över flera formerna för sensoriska, motoriska och kognitiva funktioner. Uppgifter som detta kan bli avgörande för fullt bedöma kognitiv funktion i terapeutisk behandling.

Medan Dig uppgiften representerar ett steg i rätt riktning för att bedöma hjärnans funktion efter skada, det finns fortfarande begränsningar för den. Det är tänkt att vara enkel att konstruera, administrera och analysera, men det innebär att det finns övre gränser för vad man kan mäta. För närvarande två val är allt som kan bedömas enligt den givna paradigmet. Dessutom är Dig uppgiften inte känslig nog att hantera andra aspekter av frontal dysfunktion, såsom impulsivitet, som kan störa ett djurs beslutsfattande förmåga.

Medan Dig uppgiften har visat sig vara framgångsrika för oss att utvärdera hjärnskador hos unga djur, finns det fortfarande flera saker som kan göras med uppgift att ytterligare förfina och förbättra den. Dessa inkluderar att bedöma särskilda patientgrupper (ålder, kön, stam), jämför den direkt till operanta paradigm Den är anpassad från att utföra en direkt jämförelse av denna uppgift med andra uppgifter som bedömer främre dysfunktion efter skada, och utforska additiOnal sätt att analysera och jämföra data som genererats från uppgiften. Denna uppgift är avsedd att ta upp några av frågorna i vårt område genom att testa frontal funktion på flera sätt efter hjärnskada. Dock kan en uppgift inte mäta alla de kognitiva processer som påverkas av en hjärnskada. Därför förespråkar vi att människor fortsätter att utveckla och förbättra uppgifter som den som beskrivs i detta protokoll för att mer fullständigt utvärdera funktionsnedsättningar efter hjärnskador. På så sätt kan vi öka effektiviteten av läkemedel och terapi utveckling för hjärnskada genom att bedöma över flera åtgärder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EQUIPMENT
Operant Chamber	Med Associates	ENV-008CT	Amount: 1 Standard operant chamber, no external devices.
Plexiglas	Local Hardware Store	N/A	Amount: 1 sheet Cut into proper size to fit into chamber.
PVC Pipe End Caps	Local Hardware Store	N/A	Amount: 2 / scent cup setup.
REAGENTS
Sand	Local Hardware Store
Various Spices	Local Grocery Store
Reinforcer	Local Grocery Store
*Equipment is listed for construction per chamber.