Summary
القياسات وظيفة العضلات تسهم في تقييم العلاجات المحتملة لأمراض العضلات، وكذلك لتحديد الآليات الكامنة وعلم وظائف الأعضاء من هذا النسيج. سوف نظهر إعداد الطويلة الباسطة لأصابع وعضلات الحجاب الحاجز للاختبار وظيفية. سيظهر بروتوكولات لتقلصات متساوي القياس وغريب الأطوار، وكذلك الاختلافات في النتائج بين عضلات التصنع، وهو ما يمثل حالة مرضية، والعضلات wildtype.
Abstract
حاسمة بالنسبة لتقييم العلاجات المحتملة لمرض العضلات هي التقييمات الفسيولوجية الحساسة وقابلة للتكرار وظيفة العضلات. لأن الكثير التجارب ما قبل السريرية تعتمد على نماذج الماوس لهذه الأمراض، فقد أصبح معزولا وظيفة العضلات واحدة من معايير الذهاب / NoGo القرارات في تحريك المرشحين المخدرات قدما في المرضى. سوف نظهر إعداد الطويلة الباسطة لأصابع (EDL) والحجاب الحاجز عضلات لاختبار وظيفي، والتي هي الغالبة العضلات المستخدمة لهذه الدراسات. هندسة العضلات EDL مثالية لتحضير العضلات المعزولة، مع اثنين من الأوتار يمكن الوصول إليها بسهولة، وحجم صغير يمكن أن تكون معتمدة من قبل superfusion في حمام. يسلك الحجاب الحاجز علم الأمراض في الحيوانات التدريجي عميق التصنع، ويمكن أن تكون بمثابة منصة لتقييم العلاجات المحتملة العديد من مواجهة التليف، وتعزيز الاستقرار ليف عضلي. بروتوكولات للاختبار روتيني، بما في ذلك متساوي القياس وeccenسيظهر تقلصات tric. متساوي القياس يوفر قوة تقييم قوة، وتقلصات غريب الأطوار تساعد على تقييم غمد الليف العضلي الاستقرار، التي تعطلت في العديد من أنواع ضمور العضلات. كما مقارنات بين النتائج المتوقعة من العضلات العضلات wildtype والتصنع تقديمها. يمكن لهذه التدابير تكمل القياسات المورفولوجية والبيوكيميائية من التوازن الأنسجة، فضلا عن التقييمات الحيوان كاملة من وظيفة العضلات.
Introduction
القياسات وظيفة العضلات تسهم في تقييم العلاجات المحتملة لأمراض العضلات، وكذلك لتحديد الآليات الكامنة وعلم وظائف الأعضاء من هذا النسيج. لمرض في العضلات، وقد أصبح استخدام نماذج الماوس عنصرا مركزيا لفهم الروابط بين النمط الجيني والنمط الظاهري، ولتقديم هذه المعرفة في تصميم واختبار العلاجات المحتملة. وضمور العضلات، على وجه الخصوص، وقد اعتمدت على الفئران لتقييم هذه العوامل وإقامة ما قبل السريرية البيانات المطلوبة للمضي قدما في المحاكمة في المرضى. A قياس النتيجة متكررة يستخدم معزولة وظيفة العضلات لتحديد القوة، والتي تنطبق على مجموعة واسعة من الدراسات. وهناك تدبير آخر هو استخدام غريب الأطوار، أو إطالة، تقلصات لتحديد التغيرات في غشاء سلامة العضلات، والتي تعاني من عجز في ضمور العضلات دوشين، ونموذج الفأر لهذا المرض (MDX). ولذلك، من الضروري لهذه الأنواع من measuremالوالدان أن تكون حساسة وقابلة للتكرار.
تم استخدام الماوس للأصابع الطويلة الباسطة (EDL) العضلات على نطاق واسع لوظيفة العضلات المعزولة بسبب هندسة المثالي والحجم، بما في ذلك التوجه الألياف موحدة ونهائية الأوتار 2 و 5 و 6 و 10 و 12. وقد وصفت وسائل للعضلات EDL القياسات الفنية متساوي القياس في منشور إن الرب السابق 8، وكذلك في علاج SOP-NMD 1. فإننا قمنا بمد وصف هذه الأساليب لتشمل كلا من تقلصات متساوي القياس وغريب الأطوار. بصمات واضحة المرض في مؤسسة كهرباء لبنان، بما في ذلك دورات heighted الضمور / التجديد وتقلص الناتج القوة.
يسلك الحجاب الحاجز الماوس تطور أسرع المرضية من ضمور العضلات مقارنة العضلات الأخرى في الماوس 11. من 6 أشهر من العمر، والتليف التراكمي تضم ما يقرب من 50٪ من العضلات. وهذا يؤدي إلى حد كبير impaireد قوة الانتاج 11. ولذلك، يمكن تقييم العوامل العلاجية التي يمكن أن تمنع تسلل تليفي بكفاءة في الحجاب الحاجز.
فقدان العضلات dystrophin في هشاشة يؤدي إلى زيادة الأضرار وتقلص العضلات المتزايد في جميع 9. وتوجه العديد من العلاجات بالتالي ضمور العضلات دوشين لاستبدال dystrophin. على هذا النحو، والفحص التي أصبحت ضرورية لتقييم هذه الاستراتيجيات هو انكماش غريب الأطوار، والتي يمكن التمييز بين العضلات طبيعية والتصنع، وكذلك تحديد ما تستفيد استراتيجية معينة لحماية والتصنع في عضلة من التلف مقلص 2، 3، 4، 12. هذا الإجراء يتطلب إما في وضع مزدوج مضاعفات الحركية التي يمكن أن تعدل / الطول القياسي والقوة، أو وسيلة لضبط طول منفصلة بسرعة من محول القوة.
Protocol
تم استعراض جميع الإجراءات والتي وافقت عليها جامعة بنسلفانيا IACUC.
1. EDL تشريح وإعداد (حوالي 30 دقيقة)
- تخدير الفئران للتأكد من أنها تواجه أي ألم أو ضيق خلال هذا الإجراء، إلا أن العضلات تظل الاوكسيجين بشكل جيد من قبل الدورة الدموية. نستخدم عادة مزيج الكيتامين / زيلازين (100/10 ملغ / كغ) عن طريق حقن IP. يتم تحديد الطائرة من التخدير الجراحي من قبل الغياب الكامل للانسحاب ردود الفعل أو دواسة palpedral، أو عدم استجابة نشل الأذن.
- شل hindlimbs باستخدام الشريط الطبية، وإزالة الجلد من أسفل hindlimb الأمامية لفضح العضلات في هذه المنطقة. إبقاء العضلات رطبة مع تطبيق PBS على فترات منتظمة.
- تحت نطاق تشريح، وجعل شق صغير الجانبي للركبة، من أجل كشف وتر العضلة القريبة من مؤسسة كهرباء لبنان. هناك نوعان من الأوتار في هذه المنطقة، وينبغي قطع كل لتمكين إعادةmoval من مؤسسة كهرباء لبنان.
- في الكاحل وسطي، وقطع وتر عضلة TA لفضح الأوتار البعيدة من مؤسسة كهرباء لبنان، والتي تمتد على طول tarsals الفوقية. رفع العضلات TA للخروج من الطريق، والحرص على عدم قطع أو لمس تحت EDL. عودة إلى الأعلى من الأوتار EDL، قص كل واحد والاستفادة منها من خلال الكاحل، واستيعاب ثم الأوتار، وسحب بلطف EDL بعيدا عن بقية الأطراف. ينبغي أن يعفي من الطرف القريب بحرية، ولكن إن لم يكن، والعودة إلى شق الوحشي لضمان أن يتم قطع وتر. إزالة العضلات ومكان في صحن تشريح مليئة قارعو الأجراس الاوكسيجين مبردة. يعلقون عليه من خلال العضلات والأوتار في طول يستريح تقريبا، والذي هو طول وجدت في الجسم الحي. طول قصير جدا عندما العضلات مترهلة هو في الطبق، وإذا كان طويلا العضلات وسحب على دبابيس تشريح.
- الموت ببطء الماوس مباشرة بعد إزالة العضلات عن طريق خلع عنق الرحم.
- ربط الخيوط الجراحية لعشرةدونز، أقرب ما يمكن إلى العضلات، ولكن ليس لمس العضلات. دبوس العضلات يستريح في طول تقريبا باستخدام الخيوط الجراحية.
2. تشريح الحجاب الحاجز وإعداد (حوالي 30 دقيقة)
- الموت ببطء الفئران قبل هذا الإجراء من قبل خلع عنق الرحم تحت التخدير، إذا تعرض لنفس الماوس على حد سواء تشريح، أو CO 2 تليها خلع عنق الرحم مع تأكيد.
- إجراء شق في الجلد لفضح تجويف البطن والصدر. فتح تجويف البطن، وقطع جدار الجسم مباشرة تحت الأضلاع. باستخدام مقص العظام، والبدء فوق الحجاب الحاجز الإدراج، وقطع في جميع أنحاء القفص الصدري كامل بعد سطر من أضلاعه، وقطع طريق العمود الفقري. قطع الأوعية الدموية التي تمر عبر وسط الحجاب الحاجز بحيث يمكن إزالتها بسهولة الحجاب الحاجز.
- إزالة الحجاب الحاجز من الماوس، ومكان في صحن تشريح مليئة قارعو الأجراس الاوكسيجين. تستنهض الهمم بلطف DIAPhragm في طبق ليغسل الدم. تحديث قارعو الأجراس حل حسب الحاجة.
- قطع شريط صغير من الحجاب الحاجز من وتر المركزية إلى أضلاعه على طول اتجاه الألياف في الجزء المركزي من hemidiaphragms الجانبية. يجب أن يكون بين قطاع 2-4 ملم واسعة. باستخدام مقص العظام، وقطع الضلع على جانبي الشريط، وترك تقريبا 1-2 ملم عبء الضلع على جانبي الشريط الحجاب الحاجز.
- ربط الغرز لوتر المركزية. ربط الخيط إلى كل من طرفي الضلع جاحظ أفقيا، ومن ثم ربط هذه معا لجعل حلقة كبيرة.
- ويمكن الحصول على قطعتين من أي الحجاب الحاجز معين (واحد من كل جانب).
3. تصاعد العضلات في حمام ميكانيكا
- فهم واستخدام هذه الخيوط لتوصيل العضلات إلى آخر جامدة على نهاية واحدة، ومحول القوة على الطرف الآخر.
- ضبط طول للتأكد من أن العضلات ليست الركود، ولكن ليس مشدود. A تقريب جيد هو MUSC يستريحكما هو الحال في طول جنيه 1،4 حتي 1،5.
- ينبغي أن تملأ حمام مع حل قارعو الأجراس الاوكسيجين الإبقاء على 22 ° C لإطالة العضلات الاستقرار للاختبار. يجب عضلات راحة لمدة 5 دقائق في هذا الحمام قبل اختبار وظيفي بحيث درجة حرارة العضلات هو معايرتها لC. ° 22
4. متساوي القياس تعهدات
- تهيئة الظروف تحفيز فوق الأعظمي. بعد يتم وضع العضلات في الحمام، استخدم واحد ميللي ثانية 0،5 التحفيز لتوليد نبضات نشل، ورصد الانتاج القوة. زيادة تدريجية الحالي حتى يبلغ مستوى القوة القصوى ولكنه ثابت. الزيادة الحالية إلى 10٪ أكثر من هذا المستوى للتجارب المتبقية.
- إنشاء طول الأمثل. استخدام التحفيز نشل متساوي القياس، وضبط طول العضلات تدريجيا حتى يتم الحصول على القوة القصوى. ضع العضلات ~ 10 ثانية بين كل تقلص. ويتحقق الأمثل طول العضلات (L س) عندما نشل القوة هي القصوى. سجل طول العضلات (طول يكونتوين للتقاطعات myotendinous لمؤسسة كهرباء لبنان، وبين تقاطع المركزية myotendinous وتر العضلات والإدراج إلى الضلع) باستخدام الفرجار الورنية.
- أقصى قوة تكززي متساوي القياس. تحفيز العضلات وضعت في O L لمدة ميللي ثانية 500، مع سلسلة من النبضات ميللي ثانية 0،5 في التحفيز على التردد فوق الأعظمي والانصهار (من الهضبة للعلاقة التردد القوة (على سبيل المثال المرجع: 8) والهضبة للعضلات هو EDL حققت عادة مع 120 هرتز، وللعضلات الحجاب الحاجز مع 100 هرتز. تحفيز 3 مرات على التردد منها مع بقية فترات 5 دقائق بين نوبات التحفيز لكل العضلات.
5. غريب الأطوار تعهدات
- السماح للراحة العضلات 5 دقائق بين الانقباضات أداء متساوي القياس وغريب الأطوار.
- تحفيز العضلات في 80 هرتز متساوو القياس ل500 ميللي ثانية الأولي، تليها تمتد L O 10٪ في تحفيز النهائي ميللي ثانية 200 (معدل امتداد 0،5 L O/ ثانية).
- تكرار نمط التحفيز مع مساند 5 دقائق بين لالعدد المرغوب فيه من انكماش غريب الأطوار.
- قياس قوة لكل تقلص في الفترة الزمنية قبل مدة. حساب انخفاض في القوة بين الانكماش الأول والأخير.
6. إزالة العضلات من جهاز
- تقصير طول العضلات للسماح لإزالة لطيف للعضلات من محول وظيفة وإعادته إلى طبق تشريح مع قارعو الأجراس.
- إزالة الغرز من العضلات.
- لEDL العضلات، وصمة عار في العضلات مرتين، ثم وزن، قبل المعالجة اللاحقة (مثل تجميد، تحديد، الخ). وهذا سيكون مهما لحساب مساحة مقطعية، وقوة محددة.
- لعضلة الحجاب الحاجز، ونقع في 0.1٪ procion البرتقال، صبغة impermeant الغشاء ل15-20 دقيقة. وسيوفر هذا مؤشر الضرر تشريح.
- تشريح العضلات بعيدا عن الإدراج عظمي، وكذلك المائةراؤول وتر. وهذا أمر ضروري لتوفير الوزن الدقيق لعضلة. وصمة عار على النحو الوارد أعلاه قبل وزنها وإعداد اللاحقة.
- حساب مساحة المقطع الصليب (CSA):
CSA (مم 2) = الكتلة (ملغ) / [(L O مم) * (L / L س) * (1.06 ملغ / مم 3)]،
حيث L / L O هي الألياف إلى نسبة طول العضلات (0.45 لمؤسسة كهرباء لبنان، 1.0 لالحجاب الحاجز) 5 و 1.06 هو كثافة العضلات.
Representative Results
وتظهر القيم المتوقعة للقوات متساوي القياس للعضلات EDL من الحيوانات الأسبوع 12 من العمر في الشكل 1. لأن العضلات MDX تظهر تضخم التعويضية، يمكن أن تجبر تكززي مجموع أعلى في العضلات MDX مقابل سن الضوابط wildtype المتطابقة. ومع ذلك، وهو مقياس أكثر ملاءمة من الناتج ظيفية محددة هي القوة (الشكل 2)، حيث يتم تطبيع القوة لمنطقة مستعرضة لحساب هذه القيمة. قوة معينة يعتمد على قدرة وظيفية المتأصلة في العضلات، حيث ضعف في العضلات التصنع هو أكثر وضوحا عندما يتم احتساب كل من القوة المطلقة ومنطقة المقطعية لل. في أيدينا، والعضلات EDL من الفئران MDX توليد حوالي 20 - 25٪ القوات الخاصة أقل من تلك الفئران المتطابقة من العمر wildtype 10 حتي 26 أسابيع من العمر.
لالحجاب الحاجز، قوة معينة فقط هو ذات الصلة لإعداد مقارنات لأن هو قطعة من العضلات يعتمد على dissection. مقارنة بين القوة الخاصة wildtype والعضلات الحجاب الحاجز MDX يعكس علم الأمراض التدريجي في هذا النسيج. متساوي القياس الناتج قوة مع تقدم العمر يقلل (الشكل 3)، بحيث من 6 أشهر من العمر، والعضلات الحجاب الحاجز من الفئران MDX تنتج أي أكثر من نصف الناتج الوظيفية من شرائط الحجاب الحاجز من العمر المتطابقة الضوابط wildtype.
ويرد مثال على انكماش غريب الأطوار من اختبار الحجاب الحاجز في الشكل 4. مع انكماش غريب الأطوار اللاحقة كل، خرج يقلل قوة في شرائط الحجاب الحاجز من كلا wildtype (C57) والفئران MDX. ومع ذلك، فإن فقدان القوة فهي أكثر مأساوية في عينات العضلات من الماوس MDX، ويفترض من غياب dystrophin والبروتينات المرتبطة به.
الشكل 1. قوة تكززي متساوي القياس في wildtype وMDX و العضلات EDL الفئران ROM الأسبوع 12 من العمر. يمكن أن يكون أعلى قوة مطلقة في العمر المتطابقة العضلات EDL MDX بسبب تضخم التعويضية.
الشكل 2. قوة تكززي متساوي القياس من حيث المساحة تطبيع العضلات عبر قطاعات محددة هي القوة، ويكشف عن القدرة الوظيفية للعضلات الاكتئاب EDL من الفئران MDX مقابل تلك الفئران wildtype. آثار هي من الفئران نفسها كما في الشكل (1).
الشكل 3. والفقدان التدريجي للقدرة توليد القوة المقررة بالقوة محددة بصورة أكثر وضوحا في الحجاب الحاجز من الفئران MDX (الحانات الحمراء) مقابل wildtype (C57 في الخط الأزرق).
36/50036fig4.jpg "/>
الشكل 4. إن فقدان القوة بوصفها وظيفة من عدد انكماش غريب الأطوار لعضلات الحجاب الحاجز من 12 الاسبوع القديمة C57 والفئران MDX. البيانات يعني ± SEM لN = 4 عضلات في التركيب الوراثي.
Discussion
والهدف من هذه المقالة هو تقديم التوجيه لأداء وظيفة العضلات المعزولة على اثنين من العضلات الفئران - في مؤسسة كهرباء لبنان والحجاب الحاجز. يمكن تقييم هذه العضلات توفير نظرة ثاقبة أم لا المرشحين العلاجية لمرض العضلات هي مفيدة. لكل من العضلات، والعامل الرئيسي في الحصول على بيانات قوية هو تشريح نظيفة. ولذلك، وممارسة واتقان الخطوة الأولي العزلة أمر ضروري قبل الانتقال الى التجارب الفنية. وبالإضافة إلى ذلك، وضع معايير وظيفية للعضلة طبيعية أمر بالغ الأهمية قبل إجراء المقارنات لعضلة التصنع، أو بين العلاجات. وهذا يؤكد أن نتائج الدراسة لا تخضع لتقلبات عالية الكشف عنها من قبل في قدرة الشخص الذي يؤدي هذه التجارب. يمكن استخدام غشاء صبغ impermeant مساعدة في تحسين إعداد تشريح، لحضانة أي عضلة في محلول يحتوي على مثل هذا سيمثل صبغ ألياف أكثرها تضررا، ويمكن أن يكون بمثابة مؤشر دالissection النجاح. والتقليل من عدد من الألياف العضلية التالفة في تساعد على تحسين القياس. الألياف التي تضررت من تشريح يتألق أكثر من تلك الزاهية التي تضررت من انكماش غريب الأطوار، وذلك إذا تم استخدام الصبغة أيضا أثناء عملية الميكانيكا، ويمكن للمرء أن استخدام كثافة صبغة للتمييز بين هذين النوعين من الضرر.
سوف تشريح شرائط الحجاب الحاجز دائما تقريبا الضرر الألياف، وذلك ببساطة عن طريق قطع على طول الألياف، وبعض لا محالة الحصول على تدميرها. امتصاص الصبغة قوية في تلك الألياف التالفة، وعادة يتم تقييد هذه إلى الحواف الخارجية للإعداد. في المتوسط، نلاحظ مجموعة من الألياف التالفة التي لا ~ 3 الألياف في العرض (~ 120 ميكرون) على جانبي الشريط العضلات. إذا كانت الفرقة التالفة يضم أكثر من 15٪ من العضلات، ثم يتم تجاهل البيانات. إعداد الحجاب الحاجز أيضا القيود على الحجم الأمثل للتدابير وظيفية. لقد وجدنا أن قطعة من دiaphragm التي هي أوسع من 5 مم تبدأ في طيها على أنفسهم، لأن التعادل وتر المركزية ليست سوى في نقطة واحدة. انخفضت هذه النتائج في قوة محددة في إعداد. لقد تم العثور على شرائط أضيق أيضا أن يكون أيضا أقل قوة محددة، الذي نعتقد أنه بسبب أعداد الألياف تضررت خلال تشريح تشمل نسبة أكبر من العدد الكلي لمجموع الألياف. على سبيل المثال، في حالة تلف 0.1 ملم على كل جانب، ثم وهذا هو 5٪ (2x0.1 ملم / 4 مم قطاع) من إعداد العضلات التي لا تساهم في القوة، في حين إذا الشريط هو فقط 1 ملم، ثم 20 معطوب٪ من إعداد العضلات. وبالتالي، فإن كلا من العرض في المنطقة المتضررة، فضلا عن إعداد عرض كامل من العوامل الهامة للسيطرة.
قياسات التوتر متساوي القياس يقتضي أن الحد الأقصى يتم تحفيز جميع الألياف العضلية في العضلات. لأن هناك تفاوتا هائلا في مكونات جهاز وظيفة، لا بد من تحديد ذلك لكل فرد مجموعةحتى. على سبيل المثال، يمكن أن حجم الحمام أو نوع محفز يؤثر على كثافة التحفيز. التحفيز هو وسيلة نشل معقولة لتحديد ظروف التحفيز فوق الأعظمي. إذا تقرر هذا لإعداد محددة والعضلات، ويمكن استغلاله لدراسات لاحقة.
في المقابل، فإن طول الأمثل للأي عضلة معينة يحتاج إلى أن يقاس لكل إعداد باستخدام عملية تكرارية المذكورة أعلاه. هذا يضمن أن التداخل خيوط سميكة ورقيقة هو الأمثل ويتم قياس الحد الأقصى توليد القوة المحتملة القدرات. إجراءات بديلة يمكن الاعتماد على أنماط الحيود المرتبطة التصدعات العضلات، ولكن هذا يتطلب معدات إضافية غير الوارد وصفها هنا.
نستخدم عادة 500 ميللي ثانية فترات التحفيز، ويندرج في نطاق وسط هذه المعلمة المستخدمة من قبل المحققين الآخرين في هذا المجال. ورغم أن هذا قد يسبب بعض التعب في العضلات خلال الانكماش، الذي هو واضحمن قبل "تبلد" في إنتاج القوة القصوى، وهذا يمكن أن يكون في حد ذاته بالمعلومات. على سبيل المثال، يمكن أن يتحقق تغيير في التعب من أنواع مختلفة من العلاجات بما في ذلك التعامل مع الهدف الكالسيوم التي، وبالتالي تبلد في القوة خلال الانكماش بالموقع يمكن أن يكون بمثابة مؤشر للتحسن. بدلا من ذلك، يمكن أن فقدان القوة تشير إلى أن خيوط على الأوتار ليست ضيقة بما يكفي، وأنهم الانزلاق خلال الانكماش. يجب إزالة العضلات من الحمام ويجب أن يكون إعادة ربط الخيوط الجراحية إذا حدث هذا. ونحن أيضا استخدام سلسلة من 3 تقلصات كزازي، مما يساعد على تقييم استقرار الإعداد. مرة أخرى، سوف ينزلق خياطة تؤدي إلى فقدان القوة بين الانقباضات، والتي تتطلب إعادة ربط الخيط. قد العضلات الكبيرة تولد أيضا النوى نقص الأكسجين، مما يؤدي إلى خسائر للقوة خلال البروتوكول. حجم العضلات هو العامل المحدد لأداء اختبار وظيفة العضلات المعزولة، حيث العضلات EDL مع الجماهير أكبر من 20 ملغ تفقد قوة مع كل العقود مع القطاع الخاصنشوئها، ولا يمكن أن تكون معتمدة من قبل superfusion في حمام. شرائط الحجاب الحاجز لا تعاني من مضاعفات نفسه لأنها رقيقة بما يكفي ليكون لفترات طويلة البقاء في الحمام.
ويمكن استخدام العضلات الأخرى عن وظيفة العضلات المعزولة، بما في ذلك العضلات النعلية، والذي يستخدم عادة، ولكن ليس وصفها هنا. ويمكن اعتماد العديد من الإجراءات لنفس النعلية من حيث إعداد واختبار وظيفي. ومع ذلك، فإن الاختلافات الرئيسية هي في وتيرة التحفيز، والمعلمات للانكماش غريب الأطوار. استخدام من أجل وظيفة النعلية يكمل ذلك من العضلات اثنين آخرين، وهكذا ينبغي النظر فيها كجزء من "صفقة قياسية" لتقييم الفئران التصنع 4 و 7.
انكماش غريب الأطوار يوفر مؤشر هشاشة مقلص، وأنه من المهم لاستخدام البروتوكول الذي يؤدي إلى فقدان متواضعا من القوة في العضلات من الحيوانات wildtype وخسارة كبيرة للقوة فيعضلات التصنع دون علاج حتى لا يكون هناك مجموعة واسعة ديناميكية للمقارنات. وعدم وجود أي خسارة قوة في العضلات العادية تشير إلى أن انكماش غريب الأطوار معتدل للغاية، وسوف لا تكون كافية للتمييز بين العلاجات التي ليست فعالة، وتلك التي هي مفيدة حقا. ومع ذلك، قد خسارة هائلة للقوة في العضلات العادية التعرض للانكماش غريب الأطوار يكون كبيرا جدا من استبعاد الاختلافات المرتبطة بهذا المرض. لدينا بروتوكول لمؤسسة كهرباء لبنان والحجاب الحاجز يستخدم معدل 0،5 تمتد لو / ثانية لإنتاج تغير طول 10٪. نقوم عادة 5 تقلصات غريب الأطوار، مما يؤدي إلى خسارة صغيرة للقوة في العضلات العادية وخسارة كبيرة للقوة في العضلات التصنع. بالتأكيد، يمكن أن تختلف كل من هذه المعلمات لزيادة الطول الاجمالي التغيير، فإن معدل التمدد، أو عدد من تقلصات غريب الأطوار من أجل تمييز الاختلافات بين العضلات المريضة وصحية، فضلا عن الآثار المترتبة على نوع معين من الطفرة أو رreatment واحد هو الدراسة. طالما هناك فرق واضح بين العضلات طبيعية والمريضة، ثم هناك معيار الذهب لتصل إلى لمن حيث العلاجات.
وباختصار، هذا البروتوكول يحدد المبادئ التوجيهية لأداء تقلصات متساوي القياس وغريب الأطوار، ونأمل أن يحدد المزالق المحتملة لتجنب عند وضع هذه التقنية في مختبر يصل الخاص بك.
Disclosures
ويرعى الإنتاج وحرية الوصول إلى هذه المقالة عن طريق العلم أورورا.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل D. بول ولستون مركز البحوث التعاونية (AR052646).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| in vitro Muscle Test System |  Aurora Scientific |
1200A | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ6 | |
| ACE light source | Schott-Fostec | A20500 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Angled dissecting scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | alternate dissecting tool |
| Curved scalpel blades #12 | Fine Science Tools | 10012-00 | alternate dissecting tool |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
| S&T suture tying forceps | Fine Science Tools | 00272-13 | |
| Dumont SS forceps - angled | Fine Science Tools | 11203-25 | |
| Braided silk suture size 6-0 | Teleflex Medical | 07-30-10 | |
| Medical tape | Transpore | 3M | |
| Ketamine hydrochloride 100 mg/ml | Hospira | NDC 0409-2051-05 | Final Dose is 80 mg/kg |
| TranquiVed Injection (xylazine 100 mg/ml) | Vedco | NDC 50989-234-11 | Final Dose is 10 mg/kg |
| Reactive orange 14 | Sigma-Aldrich | R-8254 | |
| Ringers Solution Components | Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% CO2, final pH 7.4 | ||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Final Concentration: 118 mM |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | Final Concentration: 4.7 mM |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Final Concentration: 2.5 mM |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P-285 | Final Concentration: 1.2 mM |
| Magnesium sulfate | J.T. Baker | 2500-01 | Final Concentration: 0.57 mM |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BP310-500 | Final Concentration: 5.95 g/L |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Final Concentration: 5.5 mM |
References
- Barton, E. R., Khurana, T. S., Lynch, G. S. Measuring isometric force of isolated mouse muscles in vitro. TREAT-NMD. , (2008).
- Barton, E. R., Morris, L., Musaro, A., Rosenthal, N., Sweeney, H. L. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice. J. Cell Biol. 157, 137-148 (2002).
- Barton, E. R., Morris, L., Kawana, M., Bish, L. T., Toursel, T. Systemic administration of L-arginine benefits mdx skeletal muscle function. Muscle Nerve. 32, 751-760 (2005).
- Barton, E. R., Wang, B. J., Brisson, B. K., Sweeney, H. L. Diaphragm displays early and progressive functional deficits in dysferlin-deficient mice. Muscle Nerve. 42 (1), 22-229 (2010).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J. Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue. Neuromuscul. Disord. 17 (1), 47-55 (2007).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J. Physiol. 535 (Pt. 2), 591-600 (2001).
- Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (48), e2582 (2011).
- Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).
- Salomonsson, S., Grundtman, C., Zhang, S. J., Lanner, J. T., Li, C., Katz, A., Wedderburn, L. R., Nagaraju, K., Lundberg, I. E., Westerblad, H. Upregulation of MHC class I in transgenic mice results in reduced force-generating capacity in slow-twitch muscle. Muscle Nerve. 39 (5), 674-6782 (2009).
- Stedman, H. H., Sweeney, H. L., Shrager, J. B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy. Nature. 352, 536-539 (1991).
- Welch, E. M., et al. PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations. Nature. 447 (7140), 87-91 (2007).
