القياسات وظيفة العضلات تسهم في تقييم العلاجات المحتملة لأمراض العضلات، وكذلك لتحديد الآليات الكامنة وعلم وظائف الأعضاء من هذا النسيج. سوف نظهر إعداد الطويلة الباسطة لأصابع وعضلات الحجاب الحاجز للاختبار وظيفية. سيظهر بروتوكولات لتقلصات متساوي القياس وغريب الأطوار، وكذلك الاختلافات في النتائج بين عضلات التصنع، وهو ما يمثل حالة مرضية، والعضلات wildtype.
حاسمة بالنسبة لتقييم العلاجات المحتملة لمرض العضلات هي التقييمات الفسيولوجية الحساسة وقابلة للتكرار وظيفة العضلات. لأن الكثير التجارب ما قبل السريرية تعتمد على نماذج الماوس لهذه الأمراض، فقد أصبح معزولا وظيفة العضلات واحدة من معايير الذهاب / NoGo القرارات في تحريك المرشحين المخدرات قدما في المرضى. سوف نظهر إعداد الطويلة الباسطة لأصابع (EDL) والحجاب الحاجز عضلات لاختبار وظيفي، والتي هي الغالبة العضلات المستخدمة لهذه الدراسات. هندسة العضلات EDL مثالية لتحضير العضلات المعزولة، مع اثنين من الأوتار يمكن الوصول إليها بسهولة، وحجم صغير يمكن أن تكون معتمدة من قبل superfusion في حمام. يسلك الحجاب الحاجز علم الأمراض في الحيوانات التدريجي عميق التصنع، ويمكن أن تكون بمثابة منصة لتقييم العلاجات المحتملة العديد من مواجهة التليف، وتعزيز الاستقرار ليف عضلي. بروتوكولات للاختبار روتيني، بما في ذلك متساوي القياس وeccenسيظهر تقلصات tric. متساوي القياس يوفر قوة تقييم قوة، وتقلصات غريب الأطوار تساعد على تقييم غمد الليف العضلي الاستقرار، التي تعطلت في العديد من أنواع ضمور العضلات. كما مقارنات بين النتائج المتوقعة من العضلات العضلات wildtype والتصنع تقديمها. يمكن لهذه التدابير تكمل القياسات المورفولوجية والبيوكيميائية من التوازن الأنسجة، فضلا عن التقييمات الحيوان كاملة من وظيفة العضلات.
القياسات وظيفة العضلات تسهم في تقييم العلاجات المحتملة لأمراض العضلات، وكذلك لتحديد الآليات الكامنة وعلم وظائف الأعضاء من هذا النسيج. لمرض في العضلات، وقد أصبح استخدام نماذج الماوس عنصرا مركزيا لفهم الروابط بين النمط الجيني والنمط الظاهري، ولتقديم هذه المعرفة في تصميم واختبار العلاجات المحتملة. وضمور العضلات، على وجه الخصوص، وقد اعتمدت على الفئران لتقييم هذه العوامل وإقامة ما قبل السريرية البيانات المطلوبة للمضي قدما في المحاكمة في المرضى. A قياس النتيجة متكررة يستخدم معزولة وظيفة العضلات لتحديد القوة، والتي تنطبق على مجموعة واسعة من الدراسات. وهناك تدبير آخر هو استخدام غريب الأطوار، أو إطالة، تقلصات لتحديد التغيرات في غشاء سلامة العضلات، والتي تعاني من عجز في ضمور العضلات دوشين، ونموذج الفأر لهذا المرض (MDX). ولذلك، من الضروري لهذه الأنواع من measuremالوالدان أن تكون حساسة وقابلة للتكرار.
تم استخدام الماوس للأصابع الطويلة الباسطة (EDL) العضلات على نطاق واسع لوظيفة العضلات المعزولة بسبب هندسة المثالي والحجم، بما في ذلك التوجه الألياف موحدة ونهائية الأوتار 2 و 5 و 6 و 10 و 12. وقد وصفت وسائل للعضلات EDL القياسات الفنية متساوي القياس في منشور إن الرب السابق 8، وكذلك في علاج SOP-NMD 1. فإننا قمنا بمد وصف هذه الأساليب لتشمل كلا من تقلصات متساوي القياس وغريب الأطوار. بصمات واضحة المرض في مؤسسة كهرباء لبنان، بما في ذلك دورات heighted الضمور / التجديد وتقلص الناتج القوة.
يسلك الحجاب الحاجز الماوس تطور أسرع المرضية من ضمور العضلات مقارنة العضلات الأخرى في الماوس 11. من 6 أشهر من العمر، والتليف التراكمي تضم ما يقرب من 50٪ من العضلات. وهذا يؤدي إلى حد كبير impaireد قوة الانتاج 11. ولذلك، يمكن تقييم العوامل العلاجية التي يمكن أن تمنع تسلل تليفي بكفاءة في الحجاب الحاجز.
فقدان العضلات dystrophin في هشاشة يؤدي إلى زيادة الأضرار وتقلص العضلات المتزايد في جميع 9. وتوجه العديد من العلاجات بالتالي ضمور العضلات دوشين لاستبدال dystrophin. على هذا النحو، والفحص التي أصبحت ضرورية لتقييم هذه الاستراتيجيات هو انكماش غريب الأطوار، والتي يمكن التمييز بين العضلات طبيعية والتصنع، وكذلك تحديد ما تستفيد استراتيجية معينة لحماية والتصنع في عضلة من التلف مقلص 2، 3، 4، 12. هذا الإجراء يتطلب إما في وضع مزدوج مضاعفات الحركية التي يمكن أن تعدل / الطول القياسي والقوة، أو وسيلة لضبط طول منفصلة بسرعة من محول القوة.
والهدف من هذه المقالة هو تقديم التوجيه لأداء وظيفة العضلات المعزولة على اثنين من العضلات الفئران – في مؤسسة كهرباء لبنان والحجاب الحاجز. يمكن تقييم هذه العضلات توفير نظرة ثاقبة أم لا المرشحين العلاجية لمرض العضلات هي مفيدة. لكل من العضلات، والعامل الرئيسي في الحصول على بيانات قوية هو تشريح نظيفة. ولذلك، وممارسة واتقان الخطوة الأولي العزلة أمر ضروري قبل الانتقال الى التجارب الفنية. وبالإضافة إلى ذلك، وضع معايير وظيفية للعضلة طبيعية أمر بالغ الأهمية قبل إجراء المقارنات لعضلة التصنع، أو بين العلاجات. وهذا يؤكد أن نتائج الدراسة لا تخضع لتقلبات عالية الكشف عنها من قبل في قدرة الشخص الذي يؤدي هذه التجارب. يمكن استخدام غشاء صبغ impermeant مساعدة في تحسين إعداد تشريح، لحضانة أي عضلة في محلول يحتوي على مثل هذا سيمثل صبغ ألياف أكثرها تضررا، ويمكن أن يكون بمثابة مؤشر دالissection النجاح. والتقليل من عدد من الألياف العضلية التالفة في تساعد على تحسين القياس. الألياف التي تضررت من تشريح يتألق أكثر من تلك الزاهية التي تضررت من انكماش غريب الأطوار، وذلك إذا تم استخدام الصبغة أيضا أثناء عملية الميكانيكا، ويمكن للمرء أن استخدام كثافة صبغة للتمييز بين هذين النوعين من الضرر.
سوف تشريح شرائط الحجاب الحاجز دائما تقريبا الضرر الألياف، وذلك ببساطة عن طريق قطع على طول الألياف، وبعض لا محالة الحصول على تدميرها. امتصاص الصبغة قوية في تلك الألياف التالفة، وعادة يتم تقييد هذه إلى الحواف الخارجية للإعداد. في المتوسط، نلاحظ مجموعة من الألياف التالفة التي لا ~ 3 الألياف في العرض (~ 120 ميكرون) على جانبي الشريط العضلات. إذا كانت الفرقة التالفة يضم أكثر من 15٪ من العضلات، ثم يتم تجاهل البيانات. إعداد الحجاب الحاجز أيضا القيود على الحجم الأمثل للتدابير وظيفية. لقد وجدنا أن قطعة من دiaphragm التي هي أوسع من 5 مم تبدأ في طيها على أنفسهم، لأن التعادل وتر المركزية ليست سوى في نقطة واحدة. انخفضت هذه النتائج في قوة محددة في إعداد. لقد تم العثور على شرائط أضيق أيضا أن يكون أيضا أقل قوة محددة، الذي نعتقد أنه بسبب أعداد الألياف تضررت خلال تشريح تشمل نسبة أكبر من العدد الكلي لمجموع الألياف. على سبيل المثال، في حالة تلف 0.1 ملم على كل جانب، ثم وهذا هو 5٪ (2×0.1 ملم / 4 مم قطاع) من إعداد العضلات التي لا تساهم في القوة، في حين إذا الشريط هو فقط 1 ملم، ثم 20 معطوب٪ من إعداد العضلات. وبالتالي، فإن كلا من العرض في المنطقة المتضررة، فضلا عن إعداد عرض كامل من العوامل الهامة للسيطرة.
قياسات التوتر متساوي القياس يقتضي أن الحد الأقصى يتم تحفيز جميع الألياف العضلية في العضلات. لأن هناك تفاوتا هائلا في مكونات جهاز وظيفة، لا بد من تحديد ذلك لكل فرد مجموعةحتى. على سبيل المثال، يمكن أن حجم الحمام أو نوع محفز يؤثر على كثافة التحفيز. التحفيز هو وسيلة نشل معقولة لتحديد ظروف التحفيز فوق الأعظمي. إذا تقرر هذا لإعداد محددة والعضلات، ويمكن استغلاله لدراسات لاحقة.
في المقابل، فإن طول الأمثل للأي عضلة معينة يحتاج إلى أن يقاس لكل إعداد باستخدام عملية تكرارية المذكورة أعلاه. هذا يضمن أن التداخل خيوط سميكة ورقيقة هو الأمثل ويتم قياس الحد الأقصى توليد القوة المحتملة القدرات. إجراءات بديلة يمكن الاعتماد على أنماط الحيود المرتبطة التصدعات العضلات، ولكن هذا يتطلب معدات إضافية غير الوارد وصفها هنا.
نستخدم عادة 500 ميللي ثانية فترات التحفيز، ويندرج في نطاق وسط هذه المعلمة المستخدمة من قبل المحققين الآخرين في هذا المجال. ورغم أن هذا قد يسبب بعض التعب في العضلات خلال الانكماش، الذي هو واضحمن قبل "تبلد" في إنتاج القوة القصوى، وهذا يمكن أن يكون في حد ذاته بالمعلومات. على سبيل المثال، يمكن أن يتحقق تغيير في التعب من أنواع مختلفة من العلاجات بما في ذلك التعامل مع الهدف الكالسيوم التي، وبالتالي تبلد في القوة خلال الانكماش بالموقع يمكن أن يكون بمثابة مؤشر للتحسن. بدلا من ذلك، يمكن أن فقدان القوة تشير إلى أن خيوط على الأوتار ليست ضيقة بما يكفي، وأنهم الانزلاق خلال الانكماش. يجب إزالة العضلات من الحمام ويجب أن يكون إعادة ربط الخيوط الجراحية إذا حدث هذا. ونحن أيضا استخدام سلسلة من 3 تقلصات كزازي، مما يساعد على تقييم استقرار الإعداد. مرة أخرى، سوف ينزلق خياطة تؤدي إلى فقدان القوة بين الانقباضات، والتي تتطلب إعادة ربط الخيط. قد العضلات الكبيرة تولد أيضا النوى نقص الأكسجين، مما يؤدي إلى خسائر للقوة خلال البروتوكول. حجم العضلات هو العامل المحدد لأداء اختبار وظيفة العضلات المعزولة، حيث العضلات EDL مع الجماهير أكبر من 20 ملغ تفقد قوة مع كل العقود مع القطاع الخاصنشوئها، ولا يمكن أن تكون معتمدة من قبل superfusion في حمام. شرائط الحجاب الحاجز لا تعاني من مضاعفات نفسه لأنها رقيقة بما يكفي ليكون لفترات طويلة البقاء في الحمام.
ويمكن استخدام العضلات الأخرى عن وظيفة العضلات المعزولة، بما في ذلك العضلات النعلية، والذي يستخدم عادة، ولكن ليس وصفها هنا. ويمكن اعتماد العديد من الإجراءات لنفس النعلية من حيث إعداد واختبار وظيفي. ومع ذلك، فإن الاختلافات الرئيسية هي في وتيرة التحفيز، والمعلمات للانكماش غريب الأطوار. استخدام من أجل وظيفة النعلية يكمل ذلك من العضلات اثنين آخرين، وهكذا ينبغي النظر فيها كجزء من "صفقة قياسية" لتقييم الفئران التصنع 4 و 7.
انكماش غريب الأطوار يوفر مؤشر هشاشة مقلص، وأنه من المهم لاستخدام البروتوكول الذي يؤدي إلى فقدان متواضعا من القوة في العضلات من الحيوانات wildtype وخسارة كبيرة للقوة فيعضلات التصنع دون علاج حتى لا يكون هناك مجموعة واسعة ديناميكية للمقارنات. وعدم وجود أي خسارة قوة في العضلات العادية تشير إلى أن انكماش غريب الأطوار معتدل للغاية، وسوف لا تكون كافية للتمييز بين العلاجات التي ليست فعالة، وتلك التي هي مفيدة حقا. ومع ذلك، قد خسارة هائلة للقوة في العضلات العادية التعرض للانكماش غريب الأطوار يكون كبيرا جدا من استبعاد الاختلافات المرتبطة بهذا المرض. لدينا بروتوكول لمؤسسة كهرباء لبنان والحجاب الحاجز يستخدم معدل 0،5 تمتد لو / ثانية لإنتاج تغير طول 10٪. نقوم عادة 5 تقلصات غريب الأطوار، مما يؤدي إلى خسارة صغيرة للقوة في العضلات العادية وخسارة كبيرة للقوة في العضلات التصنع. بالتأكيد، يمكن أن تختلف كل من هذه المعلمات لزيادة الطول الاجمالي التغيير، فإن معدل التمدد، أو عدد من تقلصات غريب الأطوار من أجل تمييز الاختلافات بين العضلات المريضة وصحية، فضلا عن الآثار المترتبة على نوع معين من الطفرة أو رreatment واحد هو الدراسة. طالما هناك فرق واضح بين العضلات طبيعية والمريضة، ثم هناك معيار الذهب لتصل إلى لمن حيث العلاجات.
وباختصار، هذا البروتوكول يحدد المبادئ التوجيهية لأداء تقلصات متساوي القياس وغريب الأطوار، ونأمل أن يحدد المزالق المحتملة لتجنب عند وضع هذه التقنية في مختبر يصل الخاص بك.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل D. بول ولستون مركز البحوث التعاونية (AR052646).
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
in vitro Muscle Test System | Aurora Scientific | 1200A | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | |
ACE light source | Schott-Fostec | A20500 | |
Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
Angled dissecting scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | alternate dissecting tool |
Curved scalpel blades #12 | Fine Science Tools | 10012-00 | alternate dissecting tool |
Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
S&T suture tying forceps | Fine Science Tools | 00272-13 | |
Dumont SS forceps – angled | Fine Science Tools | 11203-25 | |
Braided silk suture size 6-0 | Teleflex Medical | 07-30-10 | |
Medical tape | Transpore | 3M | |
Ketamine hydrochloride 100 mg/ml | Hospira | NDC 0409-2051-05 | Final Dose is 80 mg/kg |
TranquiVed Injection (xylazine 100 mg/ml) | Vedco | NDC 50989-234-11 | Final Dose is 10 mg/kg |
Reactive orange 14 | Sigma-Aldrich | R-8254 | |
Ringers Solution Components | Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% CO2, final pH 7.4 | ||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Final Concentration: 118 mM |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | Final Concentration: 4.7 mM |
Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Final Concentration: 2.5 mM |
Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P-285 | Final Concentration: 1.2 mM |
Magnesium sulfate | J.T. Baker | 2500-01 | Final Concentration: 0.57 mM |
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BP310-500 | Final Concentration: 5.95 g/L |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Final Concentration: 5.5 mM |