筋機能の測定は、筋肉病理のための潜在的な治療法の評価と同様に、この組織の生理機能のメカニズムの決定に貢献しています。我々は、機能テストのための長趾伸筋と横隔膜の筋肉の準備のデモンストレーションを行います。アイソメトリックとエキセントリック収縮のためのプロトコルは、病理学的状態を表すジストロフィー筋の間で結果の違い、および野生型の筋肉だけでなく、表示されます。
筋肉の病気のための潜在的な治療法の評価に重要な筋機能の高感度で再現性の生理学的な評価です。多くの前臨床試験では、これらの疾患のマウスモデルに依存しているため、隔離された筋肉の機能は、患者にまで前方に新薬候補を移動する]の[移動/ NOGO意思決定のための基準の一つとなっている。私たちは、これらの研究のために利用優勢な筋肉である機能テスト用の長趾伸筋(EDL)と横隔膜の筋肉の準備のデモンストレーションを行います。 EDL筋肉のジオメトリは2簡単にアクセス腱、浴中の灌流によってサポートすることができる小型で、隔離された筋肉の準備に最適です。ダイヤフラムは、筋ジストロフィーの動物で深遠な進歩的な病態を示し、線維症に対抗する多くの潜在的な治療法を評価し、筋線維の安定を促進するためのプラットフォームとして機能することができます。アイソメトリックとeccenを含め、定期的なテストのためのプロトコル、TRIC収縮は、表示されます。アイソメトリック力が強さの評価を提供し、エキセントリック収縮は、筋ジストロフィーの多くの種類で破壊されている鞘の安定性を評価するのに役立ちます。野生型およびジストロフィー筋肉から筋肉の間に期待される結果の比較も提供されます。これらの措置は、組織の恒常性の形態学的および生化学的測定と同様に、筋機能の全体の動物アセスメントを補完することができます。
筋機能の測定は、筋肉病理のための治療の可能性の評価にだけでなく、この組織の生理機能のメカニズムの決定に貢献しています。筋疾患は、マウスモデルを使用することは、潜在的な治療薬の設計とテストにその知識を拡張するための遺伝子型と表現型の間のリンクを理解するための中心的なコンポーネントとなっています。筋ジストロフィーは、特に、これらのエージェントを評価し、患者での臨床試験に進めるために必要な前臨床データを確立するためにマウスに頼ってきた。頻繁なアウトカム指標は、研究の広い範囲に適用される強さを決定するために、隔離された筋肉の機能を使用しています。もう一つの指標は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを欠損している筋膜の完全性、およびこの疾患のマウスモデル(MDX)の変化を決定するために、偏心、または長く収縮の使用です。したがって、それはmeasuremこれらのタイプのために不可欠である親は高感度で再現性のあることが。
マウス長趾伸筋(EDL)筋肉が均一な繊維配向と決定的腱2、5、6、10、12を含む、理想的なジオメトリやサイズに起因する絶縁型筋機能のために広く使用されてきました。 EDL筋肉アイソメトリック機能測定のための方法は、以前のJove出版物8のと同様に、TREAT-NMDのSOPの1に記載されている。我々は、等尺性とエキセントリック収縮の両方が含まれるように、これらのメソッドの説明を拡張しました。病気の特徴は、変性/再生および減少力出力のheightedサイクルを含む、EDLに明らかである。
マウスの横隔膜は、マウス11の他の筋肉に比べて筋ジストロフィーの中で最も急速な病理の進行を示す。生後6ヶ月までに、累積線維症は、筋肉の約50%を構成している。大幅impaireこの結果、D力出力11。したがって、線維浸入を防ぐことができる治療薬は、横隔膜で効率的に評価することができます。
筋肉中のジストロフィンの損失が増加した脆弱性とすべての筋肉9の高まり収縮損傷につながる。したがってデュシェンヌ型筋ジストロフィーのための多くの治療法はジストロフィンの交換のために連動されています。このように、これらの戦略を評価するために不可欠となっている検定は、同様に収縮ダメージ2、3、4からジストロフィー筋を保護するために特定の戦略を持っているメリットは何かを判断として、正常およびジストロフィー筋を区別することができ伸張性収縮、、です12。この手順では、/レコード長と力、力変換器から急速に別々の長さを調整する方法を調節することができるどちらのデュアルモードサーボモータを必要とします。
EDL及びダイアフラム – この記事の目的は、マウスから2筋に孤立筋肉の機能を実行するための指針を提供することである。これらの筋肉の評価は、筋肉疾患の治療薬候補が有益であるか否かについての洞察を提供することができます。両方の筋肉のために、堅牢なデータを得るための重要な要因は、クリーン解剖です。したがって、初期分離ステップを練習し、完成すると、機能テストに移る前に、必要不可欠である。また、通常の筋肉のために機能的なベンチマークを確立することはジストロフィー筋へ、または治療間の比較を行う前に重要です。これは研究結果は、実験を行う人の能力によって与えられる高い変動の対象にはなりませんことが保証されます。膜透過性色素の使用は、染料を含む溶液中で、任意の筋肉のインキュベーションは、ほとんど損傷を受けた繊維をマークしますが、dの指標として役立つことができるため、解剖の準備を最適化することを支援することができますissection成功。筋肉で損傷繊維の数を最小限に抑えることにより、測定を最適化するのに役立ちます。解剖によって損傷繊維が伸張性収縮によって損傷したものよりもはるかに明るく蛍光を発すると、染料はまた力学プロセスの間に使用されていたら、人はダメージの2つのタイプを区別するために、色素の強度を使用することができます。
ダイアフラムストリップの解離はほぼ必ず、繊維の長さ方向に沿って切断することにより、いくつかは必然的に破壊さという理由だけで、繊維の損傷を持つことになります。色素の取り込みは、これらの破損した繊維で強力であり、これらは通常、準備の外縁に制限されています。平均的に、我々は、筋条片の両側に幅約3繊維(〜120μm)であり、破損した繊維のバンドを観察します。損傷したバンドは筋肉の15%以上を含む場合、そのデータは破棄されます。横隔膜標本は、機能の対策の最適なサイズ上の制約があります。我々は、dの部分ことを発見した腱中心のタイは一点のみであるため、5ミリメートルより広いiaphragmは、自分自身に畳むし始める。この結果は、準備のために特定の力を減少させた。我々はまた、狭いストリップはまた、我々は解剖中に破損した繊維の数字は総繊維数の大きな割合を含んでいるためであると考えて下の特定の力を持っていることを発見した。例えば、それぞれの側に0.1ミリメートルが破損している場合、それは、強制的に寄与しない筋標本の5%(2×0.1ミリメートル/ 4ミリメートルストリップ)であるのに対し、ストリップはその後わずか1mm、20の場合筋標本の%が損傷しています。したがって、損傷領域の幅だけでなく、製剤全体の幅の両方を制御するための重要な要因である。
最大等尺性張力の測定は、筋肉内のすべての筋線維が刺激されている必要があります。機能装置の部品の大幅な変動があるので、これは個々のセットのために決定されなければならないアップ。たとえば、お風呂の大きさや刺激の種類は刺激の強度に影響を与えることができる。単収縮刺激は最大上刺激条件を決定するために合理的な方法です。これは特定のセットアップや筋肉のために確立されると、それは、その後の研究のために利用することができる。
これとは対照的に、任意の筋肉の最適な長さは、上記の反復プロセスを使用して、各調製のために測定する必要があります。このことは、厚いと薄いフィラメントの重なりが最適であると発電容量を最大の潜在的な力が測定されることを保証します。代替手順は、筋肉の横紋に関連付けられた回折パターンに依存することができますが、これはここで説明されていない追加の機器が必要です。
我々は日常的にこの分野における他の研究者によって使用され、このパラメータの真ん中範囲内500ミリ秒の刺激の持続時間を使用します。これは明らかである収縮、筋肉の中にいくつかの疲労を引き起こすかもしれませんが最大の力生産の "ダレ"で、これ自体は有益なことができます。例えば、疲労の差が故にアクティブ収縮時の力のたるみは改善のための指標となることができ、その目標カルシウム処理も含めて治療法の異なる種類によって達成することができる。あるいは、力の損失は腱に縫合糸は十分なタイトではないことを示している、と彼らは収縮時に滑っていることでした。筋肉を浴から除去されなければならない、これが発生した場合の縫合糸は、再接続する必要があります。我々はまた、製剤の安定性を評価するのに役立ち3テタヌス収縮のシリーズを使用しています。繰り返しになりますが、縫合スリップは再抱き合わせ縫合を必要と収縮との間の力の喪失につながる。大きな筋肉は、プロトコルの間の力の損失につながる無酸素コアを生成することができる。筋肉のサイズが20より大きい質量を持つEDL筋肉がミリグラム各contracと力を失い孤立した筋機能テストを実行するための制限要因であるると、浴中の灌流でサポートすることはできません。彼らは風呂で長時間生存能力を持つのに十分薄いためダイヤフラムストリップは同じ合併症で苦しむことはない。
他の筋肉は一般的に使用されるが、ここで説明されていないヒラメ筋など、孤立した筋機能のために利用することができます。同じ手順の多くは、準備と機能テストの面でヒラメを採用することができる。しかし、主な相違点は、刺激周波数にあり、エキセントリック収縮のためのパラメータ。関数のヒラメを使用する他の二つの筋肉のことは、補完するものであり、従ってそれはジストロフィーマウス4,7を評価するための"標準パッケージ"の一部として考慮されるべきである。
エキセントリック収縮は、収縮もろさの指標を提供します、そして、それは野生動物からの筋肉の力のささやかな損失との力の大幅な損失をもたらしているプロトコルを使用することが重要です。比較のため、広いダイナミックレンジがあるように未処理ジストロフィー筋。通常の筋肉内の任意の力の損失の欠如は、伸張性収縮があまりにもマイルドであることを示唆し、かつ効果的な治療法はありませんし、真に有益なものを区別するのに十分ではありません。しかし、伸張性収縮を受け、通常の筋肉の力の劇的な損失は、疾患に関連する差異を引き出すには余りにも大きいかもしれません。 EDLとダイヤフラムのための私たちのプロトコルには10%の長さの変化を生成する0.5ロー/秒の伸び率を使用しています。我々は、典型的には5エキセントリック収縮は、正常な筋肉の力の小さい損失およびジストロフィー筋肉の力の大幅な損失に結果を実行します。確かに、これらのパラメータのすべてが病気の、健康的な筋肉の間に、同様の変異の特定のタイプの効果の違いを区別するために、全体の長さ変化、ストレッチのレート、またはエキセントリック収縮の数を増やすために変化させることができるまたはtreatment 1は勉強しています。限り正常と疾患筋肉の間に顕著な違いがあるように、その後の治療の観点からのために達するために、金本位制があります。
要約すると、このプロトコルでは、等尺性とエキセントリック収縮を実行するためのガイドラインを確立し、うまくいけば、あなたのラボでこのテクニックをセットアップするときに回避するために潜在的な落とし穴を識別します。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、ポール·D Wellstone共同研究センター(AR052646)によってサポートされていました。
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
in vitro Muscle Test System | Aurora Scientific | 1200A | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | |
ACE light source | Schott-Fostec | A20500 | |
Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
Angled dissecting scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | alternate dissecting tool |
Curved scalpel blades #12 | Fine Science Tools | 10012-00 | alternate dissecting tool |
Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
S&T suture tying forceps | Fine Science Tools | 00272-13 | |
Dumont SS forceps – angled | Fine Science Tools | 11203-25 | |
Braided silk suture size 6-0 | Teleflex Medical | 07-30-10 | |
Medical tape | Transpore | 3M | |
Ketamine hydrochloride 100 mg/ml | Hospira | NDC 0409-2051-05 | Final Dose is 80 mg/kg |
TranquiVed Injection (xylazine 100 mg/ml) | Vedco | NDC 50989-234-11 | Final Dose is 10 mg/kg |
Reactive orange 14 | Sigma-Aldrich | R-8254 | |
Ringers Solution Components | Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% CO2, final pH 7.4 | ||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Final Concentration: 118 mM |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | Final Concentration: 4.7 mM |
Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Final Concentration: 2.5 mM |
Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P-285 | Final Concentration: 1.2 mM |
Magnesium sulfate | J.T. Baker | 2500-01 | Final Concentration: 0.57 mM |
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BP310-500 | Final Concentration: 5.95 g/L |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Final Concentration: 5.5 mM |