근육 기능 측정은 근육 병리에 대한 잠재적 인 치료학의 평가뿐만 아니라,이 조직의 생리를 근간 메커니즘의 결정에에 기여합니다. 우리는 기능 테스트를위한 신근 digitorum longus의와 격막 근육의 준비를 보여줍니다. isometric 및 편심 수축을위한 프로토콜은 병적 인 상태를 나타내는 dystrophic 근육 사이에 결과의 차이, 그리고 wildtype 근육뿐만 아니라 표시됩니다.
근육 질환에 대한 잠재적 치료학의 평가에 중요한 근육 기능의 민감하고 재현 생리적 평가입니다. 많은 사전 임상 실험이 질환 마우스 모델에 의존하기 때문에, 절연 근육 기능은 환자에 앞으로 약물 후보를 이동에서 이동 / NoGo 결정을위한 기준의 하나가되었습니다. 우리는이 연구에 활용 지배적 인 근육 아르 기능 테스트를위한 신근 digitorum longus의 (편집 판단리스트)과 격막 근육의 준비를 보여줍니다. 편집 판단리스트 근육 구조는 두 쉽게 접근 할 수 힘줄 및 욕조에서 superfusion에서 지원 할 수있는 작은 크기로, 분리 된 근육 준비에 이상적입니다. 다이어프램은 dystrophic 동물에 깊은 진보적 인 병리학을 전시하고, 섬유증을 countering 많은 잠재적 인 치료를 평가하고, myofiber의 안정성을 홍보하기위한 플랫폼 역할을 할 수 있습니다. isometric와 eccen 등의 일상적인 테스트 프로토콜,tric 수축이 표시됩니다. Isometric 힘은 힘의 평가를 제공하며, 편심 수축이 근육 dystrophies 많은 종류의에서 중단되어 sarcolemma의 안정성을 평가하는 데 도움이됩니다. wildtype 및 dystrophic 근육에서 근육 사이의 예상 결과의 비교도 제공됩니다. 이러한 조치는 조직 항상성의 형태학 및 생화학 측정뿐만 아니라, 근육 기능의 전체 동물 평가를 보완 할 수 있습니다.
근육 기능 측정은 근육 병리학뿐만 아니라이 조직의 생리를 근간 메커니즘의 결정에 대한 잠재적 인 치료의 평가에 기여합니다. 근육 질환의 경우, 마우스 모델의 사용은 잠재적 인 치료학의 설계 및 테스트에 그 지식을 확장하는 유전자형과 표현형 사이의 링크를 이해하는 중앙 구성 요소가 있습니다. 근육 dystrophies는 특히,이 에이전트를 평가하고 환자의 시련으로 이동하는 데 필요한 사전 임상 데이터를 설정하는 마우스에 의존하고 있습니다. 자주 결과 측정은 연구의 다양한 적용됩니다 강도를 측정하기 위해 절연 근육 기능을 사용합니다. 또 다른 조치가 편심, 또는 길이를 사용하는 것입니다, 수축이 Duchenne 근육질 영양 장애에 결함이 근육 막 무결성의 변화,이 질환 (MDX)의 마우스 모델을 결정합니다. 따라서 measurem 이러한 유형의에 필수적입니다엔트 민감하고 재현 할 수 있습니다.
마우스 신근 digitorum longus의 (편집 판단리스트) 근육이 균일 한 섬유 방향 및 최종 힘줄 2, 5, 6, 10, 12를 포함한 이상적인 형상과 크기로 인해 절연 근육 기능에 광범위하게 사용되었습니다. 편집 판단리스트 근육 isometric 기능 측정 방법은 치료 – NMD SOP 1 이전 주피터 간행물 8,뿐만 아니라에 설명되어 있습니다. 우리는 isometric와 편심 수축을 모두 포함하려면 다음 방법의 설명을 연장했다. 질병의 특징은 변성 / 재생 및 감소 힘 출력 heighted 사이클을 포함, 편집 판단리스트에 분명합니다.
마우스 다이어프램은 마우스 11의 다른 근육에 비해 근육 영양 장애의 가장 빠른 병적 진행을 전시하고 있습니다. 생후 6 개월 누적 섬유증은 근육의 약 50 %로 구성되어 있습니다. 크게 impaire이 결과D 강제로 출력 11. 따라서, fibrotic 침투를 방지 할 수 있습니다 치료 요원의 입장에서 효율적으로 평가 될 수있다.
근육의 dystrophin의 손실은 모든 근육이 9 증가 취약성과 상승 수축성 피해로 연결됩니다. Duchenne 근육질 영양 장애에 대한 따라서 많은 치료는 dystrophin 교체를 위해 준비되어 있습니다. 따라서 이러한 전략을 평가하는 중요한되고있다 분석 할뿐만 아니라 수축성 손상 2, 3, 4에서 dystrophic 근육을 보호하기위한 특정 전략을 한 혜택을할지 결정으로, 정상 및 dystrophic 근육을 구별 할 수 편심 수축,이 12. 이 절차는 / 레코드 길이와 힘, 또는 힘 변환기에서 빠르게 별도의 길이를 조정하는 방법을 조절 할 수 있습니다 중 듀얼 모드 서보 모터가 필요합니다.
편집 판단리스트와 격막 -이 문서의 목적은 쥐에서 두 개의 근육에 격리 된 근육 기능을 수행하기위한 지침을 제공하는 것입니다. 이러한 근육의 평가는 근육 질환에 대한 치료 후보가 도움 여부에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 두 근육의 경우 강력한 데이터를 취득의 주요 요소는 깨끗한 절개입니다. 따라서 연습하고 초기 절연 단계를 완성하면 기능 테스트에 이동하기 전에 필수적입니다. 또한, 일반 근육에 대한 기능 벤치 마크를 설정하면 이전 dystrophic 근육에 비교하는, 또는 트리트먼트를 사이에 중요합니다. 이 연구 결과는 실험을 수행하는 사람의 능력에 의해 이수 높은 다양성의 대상이 아니라는 것을 보장합니다. 막 impermeant의 염료의 사용은 염료는 대부분 손상된 섬유를 표시합니다 포함 된 솔루션의 모든 근육의 부화를 들어, 분해 준비를 최적화에 도움이 수 있으며, D의 인덱스로 제공 할 수issection 성공. 근육에 손상 섬유의 수를 최소화하면 측정을 최적화하는 데 도움이 될 것입니다. 해부에 의해 손상 섬유는 편심 수축에 의해 손상보다 훨씬 더 밝게을 형광 및 염색도 기계 과정에서 사용하는면, 하나는 손상의 두 가지 유형을 구별하기 염색의 강도를 사용할 수 있습니다.
격막 스트립의 해부는 거의 항상 섬유의 길이를 따라 절단하여 일부 불가피하게 파괴하게하기 때문에, 섬유 손상을 갖게됩니다. 염료 이해는 그 손상된 섬유에 강한이며, 이러한은 일반적으로 준비의 바깥 가장자리으로 제한됩니다. 평균적으로, 우리는 근육 스트립의 양쪽에 폭 ~ 3 섬유 (~ 120 μm)입니다 손상된 섬유의 밴드를 관찰합니다. 손상된 밴드 근육의 15 % 이상을 포함하는 경우, 데이터가 삭제됩니다. 다이어프램 준비는 기능 측정을위한 최적의 크기에 제약이 있습니다. 우리는 발견 한 그 D 조각중앙 힘줄이 넥타이가 한 지점에 불과하기 때문에 5mm보다 폭 아르 iaphragm은 자신에 접어 시작합니다. 에있는이 결과는 준비에서 특정 힘을 감소. 우리는 또한 절개하는 동안 손상 섬유의 숫자가 전체 섬유 번호의 큰 비율을 구성하기 때문에 좁은 스트립은 또한 우리가 믿고 낮은 특정 힘을 가지고 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 각면에 0.1 mm가 손상되면, 그건 강제로 기여하지 않는 근육 준비의 5 % (2×0.1 mm / 4 밀리미터 스트립)입니다 반면 스트립는 단 1mm, 20 인 경우 근육 준비 %가 손상되었습니다. 따라서, 손상된 영역의 폭뿐만 아니라 전체 준비의 폭을 모두 제어 할 중요한 요소입니다.
최대 isometric 긴장 측정은 근육의 모든 근육 섬유가 자극해야합니다. 함수 장치의 구성 요소에 엄청난 변화가 있기 때문에, 이것은 각 세트에 대해 결정되어야한다까지. 예를 들어, 욕조 크기 또는 stimulator의 유형은 자극의 강도에 영향을 미칠 수 있습니다. 트의 자극은 supramaximal 자극 조건을 결정하는 합리적인 방법입니다. 이것은 특정 설치 및 근육에 설립되면, 후속 연구에 활용 될 수있다.
반면, 특정 근육의 최적 길이는 위에서 설명한 반복 프로세스를 사용하여 각 준비를 위해 측정해야합니다. 이것은 두께 얇은 필라멘트 중복 최적이고 최대 잠재적 인 힘을 창출 능력이 측정됩니다 보장합니다. 다른 절차는 근육 강선과 관련된 회절 패턴에 의존 할 수 있지만이 여기에 설명되지 않은 추가 장비가 필요합니다.
우리는 정기적으로이 분야의 다른 조사에 의해 사용이 매개 변수의 중간 범위에 속하는 500 밀리 초를 자극 기간을 사용합니다. 이 자궁이 수축하는 동안 근육의 일부 피로가 발생할 수 있지만, 이는 분명하다최대 힘 생산에 "처지"로, 그 자체가이 정보를 제공 할 수 있습니다. 예를 들어, 피로의 차이는 따라서 활성 자궁이 수축하는 동안 힘의 처지가 개선을위한 인덱스로 제공 할 수있는 그 대상 칼슘 처리를 포함한 요법의 다른 유형에 의해 달성 될 수있다. 또는 힘의 손실이 힘줄에 봉합이 충분히 빡빡하지 나타냅니다, 그리고 그들이 자궁이 수축하는 동안 미끄러지는 것을 수 있습니다. 근육은 목욕탕에서 제거해야하며이 경우 봉합이 다시 묶여해야합니다. 우리는 또한 준비의 안정성을 평가하는 데 도움이 3 파상풍의 수축, 일련의를 사용합니다. 다시 봉합 용지는 다시 봉합을 필요로 묶는, 수축 사이의 힘의 손실로 이어질 것입니다. 대형 근육은 또한 프로토콜 중 힘의 손실로 이어질있는 anoxic 코어를 생성 할 수 있습니다. 근육 크기가 분리 된 근육 기능 테스트를 수행하기위한 제한 요소입니다, 어디서 20 밀리그램보다 더 큰 질량과 편집 판단리스트 근육은 각 contrac과 힘을 잃게기, 욕조에 superfusion에서 지원 할 수 없습니다. 사람들이 목욕탕에서 장시간 생존을 할 수있을만큼 얇은 때문에 격막 스트립 같은 합병증으로 고통하지 않습니다.
다른 근육은 일반적으로 사용되는 soleus 근육을 포함한 절연 근육 기능에 대한 활용하지만, 여기에 설명 된 수는 없습니다. 동일한 절차의 많은 준비와 기능 테스트의 측면에서 soleus을 위해 채택 할 수 있습니다. 그러나, 주된 차이점은 자극 주파수에 있으며, 편심 수축에 대한 매개 변수입니다. 함수의 soleus를 사용 다른 두 근육의 것을을 보완, 그래서는 dystrophic 마우스에게 7 4 평가 "표준 패키지"의 일부로 간주해야합니다.
편심 수축은 수축 취약성의 색인을 제공하며,이 프로토콜을 사용하는 것이 중요합니다 그 wildtype 동물의 근육에 힘 겸손한 손실 및에 힘 상당한 손실 결과치료 dystrophic 근육 비교에 대한 다양한 동적 범위가되도록. 정상적인 근육에 힘 손실의 부족은 편심 수축이 너무 온화 것을 제안하고, 효과적이지 않을 테라피와 진정으로 도움이되어있는 사이에 구별하기에 충분한 수 없습니다. 그러나, 편심 수축을 받게 일반 근육의 힘 극적인 손실이 질병과 관련된 차이를 올리지 너무 큰 수 있습니다. 편집 판단리스트와 격막에 대한 프로토콜은 10 %의 길이 변화를 생산하기 위해 0.5 소호 / 초 신축성 속도를 사용합니다. 우리는 일반적으로 5 편심 수축, 정상적인 근육의 힘의 작은 손실 및 dystrophic 근육의 힘의 상당한 손실 결과를 수행합니다. 물론, 이러한 매개 변수 중 모든 병에 걸린하고 건강한 근육 사이의 차이뿐만 아니라, 돌연변이의 특정 유형의 영향에를 구별하기 위해 전체 길이의 변화, 신장의 속도, 또는 편심 수축의 수를 늘리기 위해 다양 할 수 있습니다 또는 treatment 하나는 공부하고 있습니다. 그 동안 정상과 병에 걸린 근육 사이에 현저한 차이가 있으므로 다음 트리트먼트 측면에서에 접근 할 수있는 황금 표준이 있습니다.
요약이 프로토콜은 isometric 및 편심 수축을 수행하기위한 지침을 수립하고, 운이 좋다면 당신 실험실에서이 기법을 설정할 때 방지하기 위해 잠재적 인 함정을 식별합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 폴 D. Wellstone 협동 연구 센터 (AR052646)에 의해 지원되었다.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
in vitro Muscle Test System | Aurora Scientific | 1200A | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | |
ACE light source | Schott-Fostec | A20500 | |
Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
Angled dissecting scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | alternate dissecting tool |
Curved scalpel blades #12 | Fine Science Tools | 10012-00 | alternate dissecting tool |
Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
S&T suture tying forceps | Fine Science Tools | 00272-13 | |
Dumont SS forceps – angled | Fine Science Tools | 11203-25 | |
Braided silk suture size 6-0 | Teleflex Medical | 07-30-10 | |
Medical tape | Transpore | 3M | |
Ketamine hydrochloride 100 mg/ml | Hospira | NDC 0409-2051-05 | Final Dose is 80 mg/kg |
TranquiVed Injection (xylazine 100 mg/ml) | Vedco | NDC 50989-234-11 | Final Dose is 10 mg/kg |
Reactive orange 14 | Sigma-Aldrich | R-8254 | |
Ringers Solution Components | Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% CO2, final pH 7.4 | ||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Final Concentration: 118 mM |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | Final Concentration: 4.7 mM |
Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Final Concentration: 2.5 mM |
Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P-285 | Final Concentration: 1.2 mM |
Magnesium sulfate | J.T. Baker | 2500-01 | Final Concentration: 0.57 mM |
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BP310-500 | Final Concentration: 5.95 g/L |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Final Concentration: 5.5 mM |