Измерения функции мышц вклад в оценку потенциальных терапевтических средств для лечения патологии мышц, а также для определения механизмов, лежащих в основе физиологии этой ткани. Мы продемонстрируем подготовки разгибателя пальцев и мышцы диафрагмы для функционального тестирования. Протоколы для изометрических и эксцентричных сокращений будет показан, а также различия в результатах между дистрофические мышцы, представляющие патологическое состояние, и дикого типа мышц.
Важнейшее значение для оценки потенциальных терапевтических средств для лечения мышечных болезней, чувствительных и воспроизводимых физиологической оценки мышечной функции. Потому что многие доклинические испытания полагаться на мышиных моделях для этих заболеваний, изолированных функции мышц стала одним из стандартов для Go / NOGO решения в продвижении лекарств-кандидатов вперед в пациентах. Мы продемонстрируем подготовки разгибателя пальцев (EDL) и диафрагмы мышцы для функционального тестирования, которые являются преобладающими мышцы используются для этих исследований. EDL геометрии мышц идеально подходит для изолированных препаратов мышц, с двумя легко доступны сухожилий и небольших размеров, которые могут быть поддержаны superfusion в ванне. Мембрана обладает глубоким прогрессивным патологии дистрофические животных, и может служить в качестве платформы для оценки многих потенциальных терапии фиброза противодействия и содействия мышечных волокон стабильности. Протоколы для рутинного тестирования, в том числе изометрические и eccenэлектрических сокращений, будет показано. Изометрическая сила обеспечивает оценку прочности, и эксцентричных сокращений помочь оценить сарколеммы стабильности, которая нарушается при многих типах мышечной дистрофии. Сравнение ожидаемых результатов между мышцами от дикого типа и дистрофических мышц также будет предоставлена. Эти меры могут дополнять морфологические и биохимические показатели тканевого гомеостаза, а также целый оценки животных мышечной функции.
Измерения функции мышц вклад в оценку потенциальных методов лечения мышечной патологии, а также определение механизмов, лежащих в основе физиологии этой ткани. Для мышечных заболеваний, использование мыши модели стали центральным элементом для понимания связей между генотипом и фенотипом, так и для расширения этих знаний в процессе разработки и тестирования потенциальных лекарственных препаратов. Мышечной дистрофии, в частности, опирались на мышах, чтобы оценить эти агентов и установления доклинические данные, необходимые для продвижения вперед в исследованиях у пациентов. Частые мера результата использует изолированные функции мышц, чтобы определить силу, которая применима к широкому кругу исследований. Еще одной мерой является использование эксцентричных или удлинение, сокращение для определения изменений в мышцах целостность мембраны, которая является дефицит мышечной дистрофии Дюшенна, и модель мыши для этого заболевания (MDX). Таким образом, важно, чтобы эти типы Измерительнродители, чтобы быть чувствительным и воспроизводимым.
Мышь пальцев мышцы (EDL) мышц широко используется для изолированной функции мышц благодаря своей идеальной геометрии и размеров, в том числе однородной ориентации волокон и сухожилий окончательные 2, 5, 6, 10, 12. Методы EDL мышцы изометрическое функциональных измерений были описаны в предыдущей публикации Юпитера 8, а также в Treat-NMD SOP 1. Мы расширили описание этих методов включают в себя как изометрических и эксцентричных сокращений. Признаки болезни проявляются в EDL, в том числе heighted циклы дегенерации / регенерации и снижение выхода силы.
Мышь диафрагма обладает самым быстрым прогрессированием патологического мышечной дистрофии по сравнению с другими мышц у мышей 11. По 6-месячного возраста, совокупный фиброза составляет около 50% мышц. Это приводит к значительной impaireD выходной силы 11. Таким образом, терапевтические агенты, которые могут предотвратить проникновение фиброзных может быть оценена эффективность в диафрагме.
Потеря дистрофина в мышцах приводит к повышенной ломкости и повышенной сократительной ущерб во всех мышцах 9. Поэтому много методов лечения мышечной дистрофии Дюшенна направлены на замену дистрофина. Таким образом, анализ, что стало необходимым для оценки этих стратегий является эксцентричный сокращения, которые могут различить нормальное и дистрофически мышц, а также определить, какие выгоды конкретной стратегии для защиты дистрофические мышцы от повреждения сократительной 2, 3, 4, 12. Эта процедура требует либо двухрежимный сервопривода, которые могут модулировать / длина записи и силы, или способ регулирования длины быстрее отдельно от датчик силы.
Цель этой статьи заключается в предоставлении рекомендаций для проведения изолированной функции мышц на две мышцы у мышей – EDL и диафрагмы. Оценка этих мышц может дать представление или нет терапевтический кандидатов в мышечных заболеваний являются полезными. Для обеих мышц, основным фактором в получении надежных данных является чистым рассечение. Таким образом, практика и совершенствование начальном этапе изоляция необходима, прежде чем перейти на функциональное тестирование. Кроме того, установление функциональных тестов для нормальных мышц имеет решающее значение до принятия сравнение с дистрофические мышцы, или между процедурами. Это будет гарантировать, что результаты исследования не подлежат высокая изменчивость передается по способности человека проведении экспериментов. Использование красителя impermeant мембрана может помочь в оптимизации вскрытия подготовки, для инкубации любых мышц в растворе, содержащем такой краситель будет отмечать наиболее поврежденных волокон, и может служить индекс гissection успех. Сведение к минимуму количество волокон повреждения в мышцах поможет оптимизировать измерения. Волокна повреждены рассечение светиться гораздо ярче, чем те, повреждены эксцентричного сжатия, и поэтому, если краситель используется также в процессе механики, можно использовать интенсивность красителя различать два типа повреждений.
Рассечение диафрагмы полос почти всегда имеют повреждения волокон, просто потому, что за счет сокращения по длине волокна, некоторые неизбежно разрушаются. Красителя силен в этих поврежденных волокон, и это, как правило, ограничивается внешними краями подготовки. В среднем, мы наблюдаем полосу поврежденных волокон, что составляет ~ 3 волокон в ширину (~ 120 мкм) по обе стороны от полосы мышц. Если поврежденный группа состоит из более, чем 15% мышц, то данные отбрасываются. Диафрагмы подготовки также имеет ограничения на оптимальный размер для функциональных мер. Мы обнаружили, что куски Diaphragm, которые шире, чем на 5 мм начинают складываться на себя, потому что центральный галстук сухожилия только в одной точке. Это приводит к снижению удельной силы в подготовке. Мы также обнаружили, что узкие полоски также имеют более низкую удельную силу, которую мы верим в том, что количество волокна повреждены во время рассечения составляют большую долю от общего количества клетчатки. Например, если 0,1 мм с каждой стороны поврежден, то, что составляет 5% (2×0.1 мм / 4 мм полосы) мышц препарат, который не способствует силе, а если полоса составляет всего 1 мм, затем 20 % от мышечного препарата повреждены. Таким образом, как ширина поврежденной области, а также ширину всей подготовки являются важными факторами для контроля.
Измерения максимального изометрического напряжения требует, чтобы все мышечных волокон в мышцах стимулируется. Потому что есть огромные различия в компонентах функцию аппарата, это должны быть определены для каждого наборавверх. Например, размер ванны или тип стимулятора может повлиять на интенсивность стимуляции. Twitch стимуляции является разумным способом определить сверхмаксимальных условиях стимуляции. Как только это установлено для конкретной установки и мышцы, он может быть использован для последующих исследований.
В отличие от этого, оптимальная длина любой мышцы должны быть измерены для каждого препарата помощью итерационного процесса, описанного выше. Это гарантирует, что толстые и тонкие перекрытия нитей является оптимальным и максимально возможного генерирующих мощностей сила измеряется. Альтернативные процедуры могут рассчитывать на дифракционные картины, связанные с мышцей страт, но это требует дополнительных устройств, не описанных здесь.
Мы регулярно использовать 500 мс стимуляции длительности, которая попадает в середину диапазона этого параметра используются другими исследователями в этой области. Хотя это может вызвать некоторую усталость мышц при сжатии, что видноот «провисания» в максимальном производстве силы, это само по себе может быть информативным. Например, разница в усталости может быть достигнуто путем различных видов терапии, включая те, что обработка кальция мишени, следовательно, прогиб в силе во время активного сокращения может служить показателем для улучшения. Кроме того, потеря силы может означать, что швов на сухожилия не достаточно плотно, и что они скольжения при сжатии. Мышцы должны быть удалены из ванны и швы должны быть вновь связали если это произойдет. Мы также используем серии из 3 тетаническое сокращений, которая помогает оценить стабильность препарата. Опять же, шовный скользит приведет к потере силы между схватками, требующих шов повторного связывания. Большие мускулы могут также создавать бескислородных ядер, которые приводят к потерям силу в протоколе. Размер мышц является ограничивающим фактором для выполнения изолированного тестирования функции мышц, где EDL мышцы с массой более 20 мг утрачивают силу с каждым подрядчикомния, и не может быть поддержан superfusion в ванне. Мембранные полоски не страдают от тех же осложнений, потому что они достаточно тонкие, чтобы иметь длительные жизнеспособность в ванной.
Другие мышцы могут быть использованы для изолированной функции мышц, в том числе камбаловидной мышцы, которые обычно используются, но не описан здесь. Многие из тех же процедур могут быть приняты для камбаловидной в плане подготовки и функционального тестирования. Тем не менее, основные различия заключаются в стимуляции частоты и параметры для эксцентричных сокращений. Использование камбаловидной для функции дополняет, что из двух других мышц, и поэтому он должен рассматриваться как часть «стандартный пакет» для оценки дистрофических мышей 4, 7.
Эксцентричный сокращение предоставляет индекса сократительной хрупкость, и важно использовать протокол, который приводит к потере скромные силы в мышцах от дикого типа животных и значительная потеря силы внеобработанной мышцы дистрофического так что есть широкий динамический диапазон для сравнения. Отсутствие силы потери в нормальных мышцах предполагает, что эксцентричный сокращений является слишком мягким, и не будет адекватно различать методы лечения, которые не являются эффективными, и те, которые действительно полезны. Тем не менее, драматические потери силы в нормальном мышцы подвергаются эксцентричный сокращения могут быть слишком велики, чтобы дразнить различия, связанные с болезнью. Наш протокол для EDL и диафрагмы используются на 0,5 Lo / сек участке скорость для получения 10% длины изменения. Мы обычно выполняют 5 эксцентричных сокращений, которые приводят к небольшой потере силы в нормальных мышцах и значительная потеря силы в дистрофических мышц. Конечно, все эти параметры могут быть изменены для повышения общего изменения длины, скорости растяжения, или количество эксцентричных сокращений, чтобы отличить различий между больными и здоровыми мышцы, а также о влиянии определенного типа мутации или тreatment один изучения. Пока существует заметная разница между нормальной и пораженной мышцы, то есть золотой стандарт, чтобы достигнуть в плане лечения.
В целом, этот протокол устанавливает руководящие принципы для выполнения изометрических и эксцентричных сокращений, и, надеюсь, определяет потенциальные ловушки, чтобы избежать при установке этой техники в Вашей лаборатории.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Paul D. Wellstone Совместный исследовательский центр (AR052646).
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
in vitro Muscle Test System | Aurora Scientific | 1200A | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | |
ACE light source | Schott-Fostec | A20500 | |
Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
Angled dissecting scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | alternate dissecting tool |
Curved scalpel blades #12 | Fine Science Tools | 10012-00 | alternate dissecting tool |
Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
S&T suture tying forceps | Fine Science Tools | 00272-13 | |
Dumont SS forceps – angled | Fine Science Tools | 11203-25 | |
Braided silk suture size 6-0 | Teleflex Medical | 07-30-10 | |
Medical tape | Transpore | 3M | |
Ketamine hydrochloride 100 mg/ml | Hospira | NDC 0409-2051-05 | Final Dose is 80 mg/kg |
TranquiVed Injection (xylazine 100 mg/ml) | Vedco | NDC 50989-234-11 | Final Dose is 10 mg/kg |
Reactive orange 14 | Sigma-Aldrich | R-8254 | |
Ringers Solution Components | Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% CO2, final pH 7.4 | ||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Final Concentration: 118 mM |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | Final Concentration: 4.7 mM |
Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Final Concentration: 2.5 mM |
Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P-285 | Final Concentration: 1.2 mM |
Magnesium sulfate | J.T. Baker | 2500-01 | Final Concentration: 0.57 mM |
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BP310-500 | Final Concentration: 5.95 g/L |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Final Concentration: 5.5 mM |