Summary
Kometen analysen er en effektiv måte å oppdage enkelt-og dobbelt-tråd pauser, inkludert alkali-labile områder og DNA-DNA/DNA-protein kryssbindinger på DNA i alle celler, inkludert hippocampus nevroner. Metoden utnytter differensial migrasjon av DNA i et elektrisk felt på grunn av forskjeller i mengden av DNA-skade.
Abstract
En rekke medikamenter rettet mot de DNA-reparasjon stier og overtale celle drepe ved å opprette DNA-skader. Dermed har prosesser å direkte måle DNA skade blitt omfattende vurdert. Tradisjonelle metoder er tidkrevende, dyrt, ressurskrevende og krever Replikere celler. I motsetning er kometmetode, en enkelt celle gelelektroforese analysen, en raskere, non-invasiv, billig, direkte og følsom mål på DNA skade og reparasjon. Alle former for DNA-skade, så vel som DNA-reparasjon kan visualiseres på enkelt celle-nivå ved hjelp av denne kraftig teknikk.
Prinsippet kometen analysen er at intakt DNA svært bestilt mens DNA-skader forstyrrer denne organisasjonen. Den skadede DNA siver inn i agarose matrisen og når den utsettes for et elektrisk felt, vandrer negativt ladet DNA mot katoden som er positivt ladet. De store uskadet DNA-strengene er ikke i stand til å migrere langt fra kjernen. DNA-skaderlager mindre DNA-fragmenter som reise lenger enn den intakte DNA. Kometmetode, en bildeanalyse programvare, tiltak og sammenligner den samlede fluorescerende intensiteten av DNA i kjernen med DNA som har vandret ut av kjernen. Fluorescenssignalet fra migrert DNA er proporsjonal til DNA-skade. Lengre lysere DNA halen betyr økt DNA-skader. Noen av parametrene som er målt, er halen øyeblikket som er et mål på både mengden av DNA og distribusjon av DNA i halen, hale lengde og prosentandel av DNA i halen. Denne analysen gjør det mulig å måle DNA reparasjon samt siden oppløsningen av DNA skade betyr reparasjon har funnet sted. Grensen for følsomhet er ca 50 tråd pauser per diploid pattedyrcelle 1,2. Celler behandles med DNA skadelige midler, slik som etoposid, kan anvendes som en positiv kontroll. Dermed kometanalysen er en rask og effektiv prosedyre for å måle DNA-skader.
Protocol
1. Cellekultur
- Kultur nerveceller og behandle dem etter behov.
- Høste cellene inn 15 ml rør: Aspirer media, skyll med fosfatbufret saltvann (PBS, kalsium og magnesium fri), legge trypsin, samle seg i 15 ml rør og nøytralisere trypsin med egnede serum inneholdende medier.
- Spinne på 1000 xg i 5 min.
- Aspirer media.
- Resuspender celler i PBS.
- Spinne på 1000 xg i 5 min.
- Aspirer media og resuspender celler i frisk PBS.
- Telle celler ved hjelp av en hemacytometer eller din foretrukne celleteller.
- Celleprøver bør være forberedt umiddelbart før du starter analysen.
- Alle prøver skal håndteres i mørke eller gult lys for å hindre DNA-skader fra ultrafiolett lys.
2. Comet Assay
1. Slide Forberedelse
- Smelt 1% agarose (1 g / 100 ml i 1X Tris Base, borsyre, EDTA, TBE) i en mikrobølgeovn i 3 minutter inntil alle granulene forsvinner.
- Dyppglass inn den smeltede agarose og tørk en side rengjøre med en kimwipe. Tillat agarosen lufttørke til en gjennomsiktig film. Dette kan gjøres på forhånd og lysbilder kan lagres.
2. Nøytral Comet Assay
- Chill lysis oppløsning (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% natriumlaurylsulfat sarcosinate, og 1% Triton X-100, 10 pH) ved 4 ° C i minst 1 time før bruk.
- 2.2.2. Smelt 1% lavt smeltepunkt agarose (1 g / 100ml i 1X Tris Base, borsyre, EDTA) i en mikrobølgeovn i 3 minutter inntil alle granulene forsvinner. Agarosen må avkjøles til 37 ° C i et vannbad for å unngå kunstig induksjon av komet halen. Ideelt må agarosen skal kjøles i en halv time før bruk.
- 2.2.3. Fortynn cellesuspensjonen slik at det blir 100000 celler pr ml. Kombiner cellesuspensjonen med lavt smeltepunkt agarose (ved 37 ° C) vedforholdet 1:10 (v / v), vortex kort, og umiddelbart pipetteres 50 pl på Comet Slide. Bruk siden av pipettespissen å spre cellesuspensjonen jevnt over prøveområdet. Hver behandlingsgruppe bør være minst i triplikat.
- Plass lysbilder flatt i kjøleskapet i 30 min til en sirkel vises i periferien av lysbildet.
- Prechill lysis løsningen og senk lysbilder i denne løsningen i 30 minutter i mørket ved 4 ° C (eller i kjøleskap).
- Hell av eller aspirere lysis løsningen og tilsett 1X nøytral elektroforese buffer (Tris-base, borsyre, EDTA, 1X TBE). La lysbilder i denne bufferen for en halv time i kjøleskapet.
- Legg prechilled 1X Nøytral Elektroforese Buffer (TBE) i elektroforese kammer, sted lysbilder i elektroforese lysbilde skuffen. Juster lysbilder slik at de er like langt fra elektrodene.
- Hell 1X nøytral elektroforese buffer opptil 0,2 inches over lysbilder. Overflødig buffer vil blantFere med elektroforese.
- Sett tilførselsspenning til 1 V per cm (målt til elektroden) og løpe i 30 minutter ved 4 ° C (eller kjølerom) i mørket.
3. Alkalisk Comet Assay
- Chill lysis oppløsning (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% natriumlaurylsulfat sarcosinate, og 1% Triton X-100, 10 pH) ved 4 ° C i minst 1 time før bruk.
- Smelt 1% lavt smeltepunkt agarose (1 g / 100 ml i 1X Tris Base, borsyre, EDTA) i en mikrobølgeovn i 3 minutter inntil alle granulene forsvinner. Deretter kjølig i et 37 ° C vannbad i minst 30 min.
- Kombiner celler ved 1 x 105 / ml med smeltet lavt smeltepunkt agarose (ved 37 ° C) i et forhold på 1:10 (volum / volum), vortex kort, og umiddelbart pipetteres 50 pl på Comet Slide. Bruk siden av pipettespissen å spre cellesuspensjonen jevnt over prøveområdet. Hver behandlingsgruppe bør være minst i triplikat.
- Sted gledes flat i kjøleskapet i 30 min til en sirkel vises i periferien av lysbildet.
- Immerse lysbilder i prechilled lysis løsningen og la ved 4 ° C i 1 time til over natten i mørket.
- Fjern lysbildene fra lysis løsning, drenere lysbildene og skyll gang med kaldt nøytralisering buffer i 5 min for å fjerne gjenværende vaskemiddel og salter forut for den alkali-slappe trinn.
- Place lysbilder i en gelelektroforese kammer fylt med prechilled ferske elektroforese buffer (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH> 13) for ikke å overstige 0,5 cm over lysbildene. Juster lysbilder slik at de er like langt fra elektrodene.
- La lysbilder sitte i alkalisk buffer i 30 min i mørket for å tillate avvikling av DNA og ekspresjon av alkali-ansvarlig skade.
- Still tilførselsspenning til 1 V per cm (målt til elektroden) og kjøre i 30 min ved 4 ° C (eller kjølerommet).
4. Festing og Staining Cells
- Drenere overflødig Electrophoresis Buffer
- Dypp glir i pre-kjølt destillert vann i 5 min ved RT.
- Fordype lysbilder i pre-kjølt 70% etanol i 5 min ved RT.
- Tørre prøver over natten. Ikke utsett lysbilder for sterkt lys. Prøver kan oppbevares i månedsvis i romtemperatur før du scoring på dette stadiet.
- Stain lysbilder ved å dyppe i SYBR grønt (1X fortynnet i PBS) i 20 min i kjøleskapet.
- Fjerne lysbilder og la dem tørke helt i mørket. Agarosen blir gjennomsiktig når du er helt tørr.
4. Image Acquisition and Analysis
- Hente bilder med fluorescerende mikroskop satt til grønt filter (Zeiss AxioVision) og analysere ved hjelp av Comet Assay programvare (Perceptive Instruments).
- Klikk på "komet hodet" (kjernen) og programvaren beregner parametere inkludert middelverdien halen øyeblikket og mengden av DNA i denkjerne.
- Analyser minst 200 celler per behandling.
- Eksportere data til Microsoft Excel.
- Beregn bety halen øyeblikk for hver behandlingsgruppe og plotte data som passer.
5. Representant Resultater
Et eksempel på kometanalysen analyse på neuronale celler er vist i figur 2 og figur 3. I dette tilfellet, induserer bestråling av neuronale celler DNA-skader. Som cellene er utsatt for det elektriske feltet, migrerer DNA med forskjellige satser grunn av forskjeller i størrelse som deretter analyseres kometsystemet programvaren. Jo mer den DNA-skade, desto lenger DNA migrerer ut av kjernen. Dette reduserer den fluorescerende intensitet i kjernen som deretter plukket opp av programvaren og resulterer i høyere hale øyeblikk. Tabell 1 viser en representativ tabell fra kometanalysen analyse og Fig. 4 viser et representantertant grafen sammenligne DNA-skader i nerveceller etter stråling målt ved kometsystemet.
Figur 1. Flytskjema av kometsystemet. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Representative bilder av nevronale celler (A) uten og (B) med komet hale.
Figur 3. Comet assay analyser ved hjelp av Comet Assay programvare. (A) Representative skjermbilder av bilde ervervet med Carl Zeiss fluorescerende mikroskop og analyseres ved hjelp av CometAssay programvare. (B) Ved å klikke på kjernen eller "komet hodet" (innringet i grønt) genererer et fluorescerende kart og graf (innringet i gult) og en (C) datatabell (innringet i rødt). Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Representant grafen oppnås ved plotting middelverdien halen øyeblikket oppnådd ved å analysere DNA-skade i bestrålte og ikke-bestrålt nerveceller med nøytral kometsystemet. Som forventet, induserer 3Gy stråling (røntgen) DNA skade som avbildet ved høyere middelverdi halen øyeblikk i bestrålte nevronale celler. Vist er den midlere halen øyeblikket (+ / - standard feil), ** P <0,01.
Tabell 1. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kometen analysen har den unike evnen til å analysere individuelle celler. Dette er fordelaktig i identifikasjon av subpopulasjoner av celler som demonstrerer differensial respons overfor cytotoksiske midler. Noen praktiske begrensninger må tas i betraktning. Antall celler som kan bli vurdert individuelt kan variere avhengig av den enkelte. Prøven størrelse må økes hvis det er avvik i DNA skade innen en populasjon. Levedyktig encellede suspensjon er avgjørende for denne analysen siden dominerende tilstedeværelse av nekrotiske eller apoptotiske celler vil legge til feil. Lysis og elektroforese skritt blir kvitt apoptotiske celler, små DNA-fragmenter (mindre enn 50 kB), og mitokondrie DNA. Dermed er de ikke oppdaget av kometanalysen 1,3-11.
Som nevnt ovenfor, er kometanalysen en effektiv måte å detektere enkelt-og dobbelt-tråd pauser, inkludert alkalimetall-labile områder og DNA-DNA/DNA-protein kryssbindinger påDNA. Her har vi skissert to distinkte protokoller: den alkaliske analysen tillater påvisning av single strengbrudd samt dobbel tråd leiligheter, mens den nøytrale kometanalysen tillater bare registrering av doble strengbrudd. Enzym-modifisert kometanalysen kan blitt brukt til å oppdage oksidative DNA-addukter. For eksempel, erkjenner behandling med Endo III (endonuklease) og hOGG1 (glykosylase) oksidert pyrimidiner inkludert tymin glykol og uracil glykol 12,13 og 8-okso-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoGua) 14,15 henholdsvis. Formamidopyrimidin DNA-glykosylase (FPG) kan brukes på samme måte. For denne modifiserte analysen, forut behandling med enzymene avvikling trinnet. Tilsetningen av lesjon-spesifikke endonukleaser øker følsomheten av kometanalysen samt 13.
Her bruker vi hale øyeblikk som descriptor av DNA-skade. Hale øyeblikk beregnes ved hjelp av følgende formel: Prosent av DNA i halen multiplisert med LenGTH av kometen hale 1,3-7. Lengden kometen halen (hale lengde) er avstanden fra sentrum av kjernen til det fjerneste punktet av migrasjon av DNA. Hodelengde er diameteren av kjernen. Hode intensitet og hale intensitet er de gjennomsnittlige pixel intensiteter i hodet og halen av kometen, henholdsvis. Totalt areal er samla areal på kometen 1,3-7.
Selv om det finnes andre metoder for å måle DNA-skader som γ-H2AX foci flekker og pulset felt gelelektroforese, disse assays har sine ulemper også 4,6,11,16,17. For eksempel er replikering stress ofte en confounder i måling av γ-H2AX nivåer 18. Siden dannelsen av γ-H2AX foci er avhengig rekruttering av DNA-reparasjon proteiner, kan unnlatelse av å rekruttere DNA-reparasjon proteiner og en kondensert kromatin struktur føre til feilaktig lave γ-H2AX brennpunktene nivå også. Tilsvarende pulset felt gel electrophoresis er veldig tidkrevende, og er bare gunstig for separasjon av store DNA-molekyler 19,20. Dermed er kometanalysen en relativt enkel, effektiv og billig, direkte og følsom måling av DNA-skade og reparasjon 10,11,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av IMPACT Award fra Institutt for Radiation Oncology, University of Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, Fighting Barnas Cancer Foundation, og Gabrielle Angel Foundation (til Esy.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L. Impact of the comet assay in radiobiology. Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al. [gamma]H2AX and cancer. Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).
- Finney, M. Pulsed Field Gel Electrophoresis. Current protocols in molecular biology. , (2000).
- Electrophoresis, F. I., et al. Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
