Summary
ومقايسة المذنب هو وسيلة فعالة للكشف عن الانقطاعات منفردة ومزدوجة حبلا، بما في ذلك قلوي قابل للتغيير المواقع وDNA-DNA/DNA-protein عبر وصلات على الحمض النووي في خلايا جميع بما في ذلك الخلايا العصبية قرن آمون. الأسلوب يستفيد من الهجرة التفاضلية من الحمض النووي في المجال الكهربائي بسبب الاختلافات في كمية الحمض النووي من التلف.
Abstract
وهناك عدد من العقاقير تستهدف مسارات إصلاح الحمض النووي وحمل الخلية قتل عن طريق إنشاء الحمض النووي من التلف. وهكذا، تم العمليات مباشرة لقياس الحمض النووي من التلف تقييم على نطاق واسع. الطرق التقليدية وقتا، طويلا مكلفة، وتتطلب موارد كثيفة الخلايا تكرار. في المقابل، ومقايسة المذنب، هلام خلية واحدة مقايسة الكهربائي، هو أسرع وغير الغازية، وغير مكلفة، مقياسا مباشرا وحساسة من الحمض النووي من التلف والإصلاح. يمكن فيها إعمال جميع أشكال الحمض النووي من التلف وكذلك إصلاح الحمض النووي تصور على مستوى خلية واحدة باستخدام هذه التقنية القوية.
والمبدأ الذي يقوم عليه مقايسة المذنب هو أن أمر غاية في حين DNA الحمض النووي من التلف سليمة يعطل هذه المنظمة. ويتسرب DNA التالفة في مصفوفة الاغاروز وعندما تتعرض لمجال كهربائي، وDNA سالبة الشحنة يهاجر نحو القطب السالب الذي موجبة الشحنة. الكبيرة خيوط DNA غير التالفة ليست قادرة على الهجرة بعيدا عن النواة. DNA الضرريخلق شظايا أصغر DNA التي تسافر أبعد من DNA سليمة. المذنب الفحص، وهو برنامج تحليل الصور والتدابير ويقارن شدة الفلورسنت العام للDNA في نواة مع DNA الذي هاجر من النواة. إشارة الفلورسنت من DNA هاجر يتناسب مع الحمض النووي من التلف. أكثر إشراقا يعد الذيل يدل على زيادة DNA الحمض النووي من التلف. بعض المعلمات التي يتم قياسها هي اللحظة التي الذيل هو مقياس لكل من كمية الحمض النووي DNA وتوزيع في الذيل طول الذيل، والنسبة المئوية للDNA في الذيل. يسمح هذا الفحص لقياس إصلاح الحمض النووي وكذلك منذ قرار من الحمض النووي من التلف يعني إصلاح قد حدثت. الحد من الحساسية هو فواصل حبلا نحو 50 في 1،2 مضاعفا خلايا الثدييات. الخلايا تعامل مع أي وكلاء DNA الضارة، مثل إيتوبوسيد، يمكن استخدام كعنصر تحكم إيجابية. وبالتالي مقايسة المذنب هو إجراء سريع وفعال لقياس الحمض النووي من التلف.
Protocol
1. خلية ثقافة
- الخلايا العصبية وثقافة التعامل معهم حسب الحاجة.
- خلايا الحصاد في أنابيب مل 15: وسائل الإعلام الرشفة، وشطف مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، الكالسيوم والمغنيسيوم مجانا)، إضافة التربسين، وجمع في 15 مل أنابيب وتحييد التربسين مع وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل مناسب.
- تدور في 1،000 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح وسائل الإعلام.
- إعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني.
- تدور في 1،000 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح وسائل الإعلام والخلايا resuspend في برنامج تلفزيوني جديد.
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو لمكافحة صومعتك المفضل.
- وينبغي إعداد عينات الخلايا مباشرة قبل بدء الفحص.
- يجب التعامل مع جميع العينات في ضوء مظلمة أو أصفر لمنع تلف الحمض النووي من الأشعة فوق البنفسجية.
2. المذنب الفحص
1. الشريحة إعداد
- أذب 1٪ الاغاروز (1 جم / 100 مل في 1X تريس قاعدة، حمض البوريك، EDTA، TBE) في الميكروويف لمدة 3 دقائق حتى تختفي جميع حبيبات.
- تراجع الشرائح في الاغاروز المنصهر والقضاء على الجانب تنظيف مع kimwipe. السماح للالاغاروز إلى الهواء الجاف لفيلم شفافة. ويمكن أن يتم ذلك مسبقا ويمكن تخزين الشرائح.
2. الفحص المذنب محايدة
- البرد حل تحلل (2.5 M كلوريد الصوديوم، 100 مم EDTA درجة الحموضة 10، 10 ملي تريس قاعدة، 1٪ لوريل الصوديوم sarcosinate، وتريتون 1٪ X-100، الرقم الهيدروجيني 10) في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
- 2.2.2. تذوب 1٪ نقطة انصهار منخفضة الاغاروز (1 جم / 100ML في 1X تريس قاعدة، حمض البوريك، EDTA) في الميكروويف لمدة 3 دقائق حتى تختفي جميع حبيبات. والاغاروز يحتاج إلى أن تبرد إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي لتجنب تحريض الاصطناعي من ذيل المذنب. من الناحية المثالية، والاغاروز يحتاج إلى أن تبرد لمدة نصف ساعة قبل الاستخدام.
- 2.2.3. يخفف من التعليق الخلية بحيث هناك 100،000 خلية لكل مل. الجمع بين الخلية التي تحتوي على التعليق الاغاروز ذوبان نقطة منخفضة (عند 37 درجة مئوية) فينسبة 01:10 (ت / ت)، لفترة وجيزة الدوامة، وعلى الفور ماصة 50 ميكرولتر على الشريحة المذنب. استخدام جانب من تلميح ماصة لنشر تعليق الخلية بالتساوي فوق منطقة العينة. ينبغي لكل مجموعة العلاج تكون على الاقل في ثلاث نسخ.
- المكان الشرائح المسطحة في الثلاجة لمدة 30 دقيقة حتى تظهر دائرة في محيط الشريحة.
- Prechill الحل تحلل والشرائح يغرق في هذا الحل لمدة 30 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية (أو في الثلاجة).
- صب الخروج أو نضح الحل تحلل وإضافة 1X العازلة الكهربائي محايدة (تريس القاعدة، حمض البوريك، EDTA، 1X TBE). ترك الشرائح في هذا المخزن المؤقت لمدة نصف ساعة في الثلاجة.
- إضافة 1X العازلة prechilled الكهربائي متعادلة (TBE) في غرفة الكهربائي، والشرائح مكان في علبة الشريحة الكهربائي. محاذاة الشرائح بحيث تكون مسافة واحدة من الأقطاب الكهربائية.
- صب 1X العازلة محايدة الكهربائي يصل إلى 0.2 بوصة فوق الشرائح. سوف عازلة الفائض في جملةوحدة البائع مع الكهربائي.
- وضع السلطة امدادات التيار الكهربائي إلى 1 V لكل سم (قياس القطب الكهربائي ل) وتشغيل لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية (أو غرفة باردة) في الظلام.
3. القلوية المذنب الفحص
- البرد حل تحلل (2.5 M كلوريد الصوديوم، 100 مم EDTA درجة الحموضة 10، 10 ملي تريس قاعدة، 1٪ لوريل الصوديوم sarcosinate، وتريتون 1٪ X-100، الرقم الهيدروجيني 10) في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
- تذوب ذوبان منخفضة 1٪ نقطة الاغاروز (1 جم / 100 مل في 1X تريس قاعدة، حمض البوريك، EDTA) في الميكروويف لمدة 3 دقائق حتى تختفي جميع حبيبات. ثم بارد في حمام الماء ° 37 مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- الجمع بين الخلايا في 1 مل X / 105 مع انخفاض ذوبان المنصهر الاغاروز نقطة (عند 37 درجة مئوية) في نسبة 01:10 (ت / ت)، لفترة وجيزة الدوامة، وعلى الفور ماصة 50 ميكرولتر على الشريحة المذنب. استخدام جانب من تلميح ماصة لنشر تعليق الخلية بالتساوي فوق منطقة العينة. ينبغي لكل مجموعة العلاج تكون على الاقل في ثلاث نسخ.
- تراجع المكانES شقة في الثلاجة لمدة 30 دقيقة حتى تظهر دائرة في محيط الشريحة.
- الشرائح تزج في حل تحلل prechilled وترك ب 4 ل 1 ساعة ليلة وضحاها في الظلام C °.
- إزالة الشرائح من حل تحلل، واستنزاف وشطف الشرائح مرة واحدة مع تحييد العازلة الباردة لمدة 5 دقائق لإزالة الأملاح والمنظفات المتبقية قبل الخطوة قلوي ينحل.
- الشرائح مكان في هلام غرفة مليئة الكهربائي الاحتياطي الكهربائي prechilled الطازجة (300 ملم هيدروكسيد الصوديوم، EDTA 1 ملم، ودرجة الحموضة> 13) لا يتجاوز 0.5 سم فوق الشرائح. محاذاة الشرائح بحيث تكون مسافة واحدة من الأقطاب الكهربائية.
- اسمحوا الشرائح الجلوس في المخزن المؤقت القلوية لمدة 30 دقيقة في الظلام للسماح للاسترخاء من DNA والتعبير عن قلوي مسؤولا الضرر.
- وضع السلطة امدادات التيار الكهربائي إلى 1 V لكل سم (قياس القطب الكهربائي ل) وتشغيل لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية (أو غرفة باردة).
4. تحديد وستاining خلايا
- استنزاف فائض الاحتياطي الكهربائي
- تزج الشرائح في مرحلة ما قبل المبردة الماء المقطر لمدة 5 دقائق في RT.
- الشرائح تزج في مرحلة ما قبل المبردة الإيثانول 70٪ لمدة 5 دقائق في RT.
- عينات الجافة بين عشية وضحاها. لا تعرض الشرائح للضوء الساطع. قد يتم تخزين العينات لمدة شهور في درجة حرارة الغرفة قبل أن يسجل هدفا في هذه المرحلة.
- وصمة عار في الشرائح عن طريق غمر الخضراء Sybr (1X مخففة في PBS) لمدة 20 دقيقة في الثلاجة.
- إزالة الشرائح والسماح لهم حتى يجف تماما في الظلام. سوف تصبح شفافة عندما الاغاروز جافة تماما.
4. الحصول على الصور والتحليل
- الحصول على الصور باستخدام المجهر الفلورسنت لتعيين مرشح الأخضر (زايس AxioVision) وتحليل باستخدام البرمجيات الفحص المذنب (أدوات الادراك).
- انقر على "رأس المذنب" (نواة) والبرنامج يحسب المعلمات بما في ذلك لحظة والذيل متوسط كمية DNA فيالنواة.
- تحليل ما لا يقل عن 200 خلية في العلاج.
- تصدير البيانات إلى Microsoft Excel.
- يعني حساب حظة الذيل لكل مجموعة العلاج والبيانات مؤامرة حسب الاقتضاء.
5. ممثل النتائج
ويرد مثال على تحليل مقايسة المذنب على الخلايا العصبية في الشكل 2 والشكل 3. في هذه الحالة، تشعيع الخلايا العصبية يدفع الحمض النووي من التلف. كما تتعرض الخلايا إلى مجال كهربائي، ويهاجر DNA بمعدلات مختلفة بسبب الاختلافات في حجم والتي يتم تحليل في وقت لاحق باستخدام برنامج الفحص المذنب. كلما الحمض النووي من التلف، وأبعد من DNA يهاجر من النواة. هذا يقلل من شدة الفلورسنت في النواة التي يتم انتقاؤها في وقت لاحق من قبل البرنامج والنتائج في لحظة أعلى الذيل. الجدول 1 الجدول يصور ممثل من التحليل والفحص المذنب الشكل 4 يظهر تمثيلاالرسم البياني tative مقارنة الحمض النووي من التلف في الخلايا العصبية بعد الإشعاع التي تقاس على أساس مقايسة المذنب.
الشكل 1. الرسم البياني تدفق مقايسة المذنب. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 2. الصور الممثل من الخلايا العصبية (A) دون و(B) مع ذيل المذنب.
الرقم مقايسة المذنب 3. التحليل باستخدام برنامج الفحص المذنب. (A) المكتسبة لقطات الشاشة ممثل الصورة باستخدام المجهر الفلورسنت كارل زايس وتحليلها باستخدام المذنبفحص البرمجيات. (B) النقر على نواة أو "رئيس المذنب" (دائري باللون الأخضر) يولد خريطة الفلورسنت والرسم البياني (دائري باللون الأصفر) وجدول البيانات (C) (دائري باللون الأحمر). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 4. الرسم البياني الممثل حصلت عليها بالتآمر لحظة الذيل يعني الحصول على الحمض النووي من التلف عن طريق تحليل الخلايا العصبية في المشع وغير المشع التي تستخدم محايدة مقايسة المذنب. كما هو متوقع، والإشعاع 3Gy (الأشعة السينية) يدفع الحمض النووي من التلف كما هو مبين من قبل لحظة متوسط ارتفاع الذيل في خلايا العصبية المشع. أظهرت هي اللحظة ذيل يعني (+ / - خطأ قياسي)، ** P <0.01.
الجدول 1. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ومقايسة المذنب لديه قدرة فريدة على تحليل الخلايا الفردية. هذا هو مفيد في تحديد المجموعات السكانية الفرعية من الخلايا التي توضح الفرق استجابة للعوامل السامة للخلايا. عدد قليل من القيود العملية يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار. قد يكون عدد الخلايا التي يمكن تقييمها بشكل فردي تختلف تبعا للفرد. حجم العينة يحتاج إلى زيادة إذا كان هناك تباين في الحمض النووي من التلف ضمن السكان. قابلة للحياة وحيدة الخلية تعليق أمر حاسم بالنسبة لهذا الاختبار منذ جود الغالبة من الخلايا أفكارك نخرية أو ستضيف للخطأ. الخطوات تحلل والكهربائي يتخلص من الخلايا أفكارك، شظايا الحمض النووي الصغيرة (أقل من 50KB)، والحمض النووي. وبالتالي، لا يتم اكتشافها عن طريق الفحص المذنب 1،3-11.
كما ذكر أعلاه، ومقايسة المذنب هو وسيلة فعالة للكشف عن الانقطاعات منفردة ومزدوجة حبلا، بما في ذلك قلوي قابل للتغيير المواقع وDNA-DNA/DNA-protein عبر وصلات علىDNA. هنا وقد أوجزنا بروتوكولين مختلفين: الفحص القلوية يسمح للكشف عن فواصل حبلا واحدة وكذلك فواصل حبلا مزدوجة، في حين أن الفحص المذنب محايدة يسمح فقط للكشف عن فواصل حبلا مزدوجة. يمكن طبقت انزيم مقايسة المذنب تعديل للكشف عن الحمض النووي adducts التأكسدي. على سبيل المثال، والاعتراف تتأكسد مع العلاج III إندو (نوكلياز داخلية) وhOGG1 (glycosylase) البريميدينات بما في ذلك غليكول غليكول الثايمين واليوراسيل و12،13 8-OXO-7 ،8-dihydroguanine (8-oxoGua) 14،15 على التوالي. Formamidopyrimidine DNA-glycosylase يمكن (FPG) يمكن أن تستخدم أيضا. لهذا الفحص تعديل والعلاج مع الانزيمات تسبق الخطوة الفك. إضافة آفة محددة endonucleases يزيد من حساسية مقايسة المذنب وكذلك 13.
هنا نستخدم حظة والذيل واصف من الحمض النووي من التلف. ويحسب لحظة الذيل باستخدام الصيغة التالية: النسبة المئوية للDNA في الذيل مضروبا في ليونGTH من الذيل المذنب 1،3-7. طول الذيل المذنب (طول الذيل) هو المسافة من مركز النواة إلى أبعد نقطة من الهجرة من الحمض النووي. طول الرأس هو القطر من النواة. شدة وكثافة رأس الذيل هي شدة بكسل يعني في الرأس والذيل من المذنب، على التوالي. تبلغ المساحة الكلية للمساحة الإجمالية للالمذنب 1،3-7.
وإن كانت هناك وسائل أخرى لقياس الحمض النووي من التلف مثل تلطيخ بؤر γ-H2AX ونابض الميدان الكهربائي للهلام، وهذه المقايسات لها سلبياتها أيضا 4،6،11،16،17. على سبيل المثال، والإجهاد وغالبا ما يكون تكرار confounder في قياس مستويات γ H2AX-18. منذ تشكيل بؤر H2AX γ-تعتمد على توظيف البروتينات إصلاح الحمض النووي، قد فشل في تجنيد البروتينات إصلاح الحمض النووي وبنية الكروماتين المكثف يؤدي إلى انخفاض مستويات بؤر γ زورا-H2AX أيضا. وبالمثل، نابض الميدان هلام electrophoresis جدا مكثفة والوقت هو مفيد فقط للفصل جزيئات DNA كبيرة 19،20. وهكذا، فإن مقايسة المذنب هي سهلة نسبيا وفعالة، وغير مكلفة، مقياسا مباشرا وحساسة من الحمض النووي من التلف وإصلاح 10،11،21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل على جائزة IMPACT من قسم علاج الأورام بالإشعاع، جامعة ألاباما في برمنغهام مركز السرطان الشامل، ومؤسسة الأطفال مكافحة للسرطان، ومؤسسة غابرييل انجيل (لESY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L.
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al.
- Finney, M.
- Electrophoresis, F. I., et al. Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
