Summary
Det comet assay er en effektiv måde til afsløring af enkelt-og dobbelt-streng pauser, herunder alkali-labile sites og DNA-DNA/DNA-protein tværbindinger på DNA i alle celler, herunder hippocampus neuroner. Fremgangsmåden drager fordel af den differentielle vandring af DNA i et elektrisk felt på grund af forskelle i mængden af DNA-beskadigelse.
Abstract
En række lægemidler rettet mod de DNA-reparationsmekanismer og inducerer celledrab ved at skabe DNA-beskadigelse. Således har fremgangsmåder til direkte måler DNA-skader blevet omfattende evalueret. Traditionelle metoder er tidskrævende, dyre, ressource-intensive og kræver replikerende celler. I modsætning hertil er comet assay, en enkelt celle gelelektroforese assay, en hurtigere, non-invasiv, billig, direkte og følsomt mål for DNA-skader og reparation. Alle former for DNA-skader samt DNA-reparation kan visualiseres på enkelt celle niveau ved hjælp af dette kraftfulde teknik.
Princippet for kometen assay er, at intakt DNA er meget ordnet hvorimod DNA-skader forstyrrer denne organisation. De beskadigede DNA trænger ind i agarosematrix og når den udsættes for et elektrisk felt, det negativt ladede DNA vandrer mod katoden, som er positivt ladet. De store ubeskadigede DNA-strenge er ikke i stand til at migrere langt fra kernen. DNA-beskadigelseskaber mindre DNA-fragmenter, der rejser længere end den intakte DNA. Comet assay, et billedanalyse-software, foranstaltninger og sammenligner den samlede fluorescerende intensitet af DNA'et i kernen med DNA, der er migreret ud af kernen. Fluorescerende signal fra migrerede DNA er proportional med DNA-beskadigelse. Længere lysere DNA hale betyder øget DNA-skader. Nogle af de parametre, der måles, er tail moment, som er et mål for både mængden af DNA og fordeling af DNA i halen, halelængde og procentdel af DNA i halen. Dette assay kan måle DNA-reparation samt da opløsning af DNA-skader betyder reparationen har fundet sted. Grænsen for følsomhed er omkring 50 strengbrud pr diploid pattedyrcelle 1,2. Celler behandles med DNA-beskadigende midler, såsom etoposid, kan anvendes som en positiv kontrol. Således comet assay er en hurtig og effektiv procedure til at måle DNA-skader.
Protocol
1. Cellekultur
- Kultur neuronale celler og behandle dem efter behov.
- Høst celler i 15 ml rør: aspireres medierne, skylles med phosphatpufret saltvand (PBS, calcium-og magnesiumfri), tilsættes trypsin, opsamles i 15 ml rør og neutralisere trypsin med passende serum indeholdende media.
- Spin ved 1.000 x g i 5 min.
- Sug mediet.
- Resuspender cellerne i PBS.
- Spin ved 1.000 x g i 5 min.
- Aspirér medier og Resuspendér celler i frisk PBS.
- Tælle celler ved anvendelse af et hæmacytometer eller din foretrukne celletæller.
- Celleprøver skal tilberedes umiddelbart før analysen startes.
- Alle prøver skal håndteres i mørke eller gult lys for at forhindre DNA-skader fra ultraviolet lys.
2. Comet Assay
1. Slide Forberedelse
- Smelt 1% agarose (1 g / 100 ml i 1X Tris Base, borsyre, EDTA, TBE) i en mikrobølgeovn i 3 minutter, indtil alle granuler forsvinder.
- Dip glider ind i smeltede agarose og tør en side rent med en Kimwipe. Tillade agarose at lufttørre til en transparent film. Dette kan gøres på forhånd, og objektglas kan lagres.
2. Neutral Comet Assay
- Chill lyseopløsning (2,5 M NaCI, 100 mM EDTA, pH 10, 10 mM Tris Base, 1% sodium lauryl sarcosinat, og 1% Triton X-100, pH 10) ved 4 ° C i mindst 1 time før brug.
- 2.2.2. Smelt 1% agarose med lavt smeltepunkt (1 g / 100 ml i 1X Tris Base, borsyre, EDTA) i en mikrobølgeovn i 3 min, indtil alle granuler forsvinder. Agarosen skal køles til 37 ° C i et vandbad for at undgå kunstig induktion af komet hale. Ideelt set agarose skal køles i en halv time før brug.
- 2.2.3. Fortynd cellesuspensionen, således at der er 100.000 celler per ml. Kombiner cellesuspensionen med agarose med lavt smeltepunkt (ved 37 ° C) vedet forhold på 1:10 (v / v), vortexes kort, og straks pipetteres 50 ul på Comet Slide. Brug side af pipettespidsen for at sprede cellesuspensionen jævnt over prøvearealet. Hver behandlingsgruppe bør være mindst in triplo.
- Glassene anbringes fladt i køleskabet i 30 minutter, indtil en cirkel vises i periferien af diaset.
- Prechill lyseopløsningen og oversvømme objektglassene i denne opløsning i 30 minutter i mørke ved 4 ° C (eller i køleskab).
- Hæld eller sug lyseopløsning, og der tilsættes 1X neutral elektroforese buffer (Tris-base, borsyre, EDTA, 1X TBE). Lad objektglassene i denne buffer i en halv time i køleskabet.
- Tilføj forafkølet 1X Neutral Electrophoresis Buffer (TBE) i elektroforese kammer, placer objektglassene i elektroforese glidebakken. Juster slides, så de er lige langt fra elektroder.
- Hæld 1X neutral elektroforese buffer op til 0,2 inches over dias. Overskydende puffer vil interFere med elektroforese.
- Indstil forsyningsspændingen til 1 V pr cm (målt elektrode til elektrode) og køre i 30 minutter ved 4 ° C (eller det kolde rum) i mørke.
3. Alkalisk Comet Assay
- Chill lyseopløsning (2,5 M NaCI, 100 mM EDTA, pH 10, 10 mM Tris Base, 1% sodium lauryl sarcosinat, og 1% Triton X-100, pH 10) ved 4 ° C i mindst 1 time før brug.
- Smelt 1% agarose med lavt smeltepunkt (1 g / 100 ml i 1X Tris Base, borsyre, EDTA) i en mikrobølgeovn i 3 min, indtil alle granuler forsvinder. Hvorefter der afkøles i et 37 ° C vandbad i mindst 30 min.
- Kombiner celler ved 1 x 105 / ml med smeltet agarose med lavt smeltepunkt (ved 37 ° C) i et forhold på 1:10 (v / v), vortexes kort, og straks pipetteres 50 ul på Comet Slide. Brug side af pipettespidsen for at sprede cellesuspensionen jævnt over prøvearealet. Hver behandlingsgruppe bør være mindst in triplo.
- Place gledes fladt i køleskabet i 30 minutter, indtil en cirkel vises i periferien af diaset.
- Fordybe dias i forafkølet lyseopløsning og forlade ved 4 ° C i 1 time til natten over i mørke.
- Fjern diassene fra lyseopløsning, dræne objektglassene og skylles en gang med kold neutralisation puffer i 5 minutter for at fjerne resterende detergent og salte forud for alkali-unwinding trin.
- Glassene anbringes i en gelelektroforese kammer fyldt med forafkølet frisk elektroforese buffer (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH> 13) ikke overstiger 0,5 cm over objektglas. Juster slides, så de er lige langt fra elektroder.
- Lad objektglassene sidde i den alkaliske puffer i 30 minutter i mørke for at tillade afvikling af DNA og ekspression af alkali-ansvarlige skade.
- Indstil forsyningsspændingen til 1 V pr cm (målt elektrode til elektrode) og køre i 30 minutter ved 4 ° C (eller det kolde rum).
4. Fastsættelse og Stalingen Celler
- Dræne overskydende elektroforesebuffer
- Nedsænkes glider i præ-afkølet destilleret vand i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Nedsænkes objektglassene i præ-kølet 70% ethanol i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Tørre prøver natten over. Udsæt ikke slides for stærkt lys. Prøver kan opbevares i måneder ved stuetemperatur før scoring på nuværende tidspunkt.
- Stain objektglassene ved neddypning i SYBR Green (1X fortyndet i PBS) i 20 minutter i køleskab.
- Fjern dias og lad dem tørre helt i mørke. Den agarose bliver transparent, når helt tørre.
4. Billedoptagelse og-analyse
- Erhverve billeder ved hjælp af fluorescerende mikroskop indstillet til grønt filter (Zeiss AxioVision) og analysere ved hjælp af Comet Assay software (indsigtsfuld Instruments).
- Klikke på "komet hovedet" (kernen) og softwaren beregner parametrene herunder middelværdien halen øjeblik og mængden af DNA ikerne.
- Analysere mindst 200 celler pr behandling.
- Eksportere data til Microsoft Excel.
- Beregn betyde hale øjeblik for hver behandlingsgruppe og plot data som er relevant.
5. Repræsentative resultater
Et eksempel på comet assay analyse på neuronale celler er vist i figur 2 og figur 3. I dette tilfælde inducerer bestråling af de neuronale celler DNA-beskadigelse. Når cellerne udsættes for det elektriske felt, DNA vandrer ved forskellige hastigheder på grund af forskelle i størrelse, som efterfølgende analyseres ved hjælp af Comet Assay software. Jo mere DNA-skader, jo længere DNA'et migrerer ud af kernen. Dette formindsker fluorescensintensiteten i kernen, som derefter samlet op af software og resulterer i højere hale øjeblik. Tabel 1 viser et repræsentativt skema fra comet assay analyse og 4 viser en reprætativ graf, der sammenligner DNA-skader i neuronale celler efter bestråling som målt ved comet assay.
Figur 1. Rutediagram af kometen assay. Klik her for at se større figur .
Figur 2. Repræsentative billeder af neuronale celler (A) uden og (B) med komet hale.
Figur 3. Comet assay analyse ved hjælp Comet Assay software. (A) Repræsentative skærmbilleder af billedet erhvervet ved hjælp af Carl Zeiss fluorescerende mikroskop og analyseres ved hjælp CometAssay software. (B) Ved at klikke på kernen eller "komet hovedet" (i cirkel i grøn) genererer et fluorescerende kort og graf (kredsede i gult) og en (C) datatabel (rød cirkel). Klik her for at se større figur .
Figur 4. Repræsentant graf opnået ved at afbilde den gennemsnitlige hale tidspunkt opnået ved at analysere DNA-skader i bestrålede og ikke-bestrålede neuronale celler under anvendelse neutral comet assay. Som forventet 3Gy stråling (røntgen) forårsager DNA-skader, som vist ved den højere middel hale øjeblik i de bestrålede neuronale celler. Vist er den gennemsnitlige hale øjeblik (+ / - standard error), ** P <0,01.
Tabel 1. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den comet assay har den unikke evne til at analysere de enkelte celler. Dette er fordelagtigt i identifikationen af subpopulationer af celler, der viser forskellen reaktion på cytotoksiske midler. Nogle få praktiske begrænsninger skal tages i betragtning. Antallet af celler, som kan evalueres individuelt kan variere afhængigt af individet. Prøvens størrelse skal øges, hvis der er varians i DNA-skader inden for en population. Levedygtig enkelt-cellesuspension er kritisk for dette assay, da fremherskende tilstedeværelse af nekrotiske eller apoptotiske celler vil øge fejl. Lysis og elektroforese trin slipper af apoptotiske celler, små DNA-fragmenter (mindre end 50 KB), og mitokondrie-DNA. Således er de ikke registreres af comet assay 1,3-11.
Som nævnt ovenfor er comet assay er en effektiv metode til påvisning af enkelt-og dobbelt-strengbrud, herunder alkali-labile steder og DNA-DNA/DNA-protein-tværbindinger påDNA. Her har vi skitseret to forskellige protokoller: det alkaliske assay muliggør påvisning af enkelt strengbrud samt dobbelt strengbrud, hvorimod den neutrale comet assay kun tillader detektion af dobbeltstrengede brud. Enzym-modificeret comet assay kan blevet anvendt til påvisning oxidative DNA-addukter. For eksempel genkender behandling med Endo III (endonuklease) og hOGG1 (glycosylase) oxideret pyrimidiner, herunder thymin glycol og uracil glycol 12,13 og 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoGua) 14,15 hhv. Formamidopyrimidine DNA-glycosylase (FPG) kan anvendes på lignende måde. Til denne modificerede assay, forud behandling med enzymerne tilbageføring trin. Tilsætningen af læsion-specifikke endonukleaser forøger følsomheden af comet assay samt 13.
Her bruger vi hale øjeblik som deskriptor af DNA-skader. Tail øjeblik beregnes efter følgende formel: procentdel af DNA i halen multipliceret med lenGTH af kometen hale 1,3-7. Længden af komet hale (halelængde) er afstanden fra midten af kernen til det fjerneste punkt af migration af DNA'et. Hoved længde er diameteren af kernen. Hoved intensitet og hale intensitet er de gennemsnitlige pixel intensiteter i hoved og hale af kometen, hhv. Samlet areal er det samlede overfladeareal af kometen 1,3-7.
Selvom der er andre metoder til måling DNA-skade, såsom γ-H2AX foci farvning og pulserende felt-gelelektroforese, disse assays har deres ulemper og 4,6,11,16,17. For eksempel er replikation stress ofte en confounder i målingen af γ-H2AX niveauer 18. Siden dannelsen af γ-H2AX foci er afhængig af rekruttering af DNA reparation proteiner, kan undladelse af at ansætte DNA reparation proteiner og et kondenseret kromatin struktur føre til falsk lave γ-H2AX foci niveauer samt. Tilsvarende pulseret-field gel electrophoresis er meget tidskrævende og er kun gavnlig for separation af store DNA-molekyler 19,20. Således kometen analysen er en forholdsvis nem, effektiv og billig, direkte og følsomt mål for DNA-skader og reparation 10,11,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af IMPACT Award fra Institut for Radiation Oncology, University of Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, Fighting Børnecancerfonden, og Gabrielles Angel Foundation (til ESY.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L. Impact of the comet assay in radiobiology. Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al. [gamma]H2AX and cancer. Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).
- Finney, M. Pulsed Field Gel Electrophoresis. Current protocols in molecular biology. , (2000).
- Electrophoresis, F. I., et al. Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
