Summary
De komeet assay is een efficiënte manier voor het opsporen enkel-en dubbel-breuken, met inbegrip van alkali-labiele sites en DNA-DNA/DNA-protein cross-links op het DNA in alle cellen met inbegrip van hippocampale neuronen. De methode maakt gebruik van de differentiële migratie van DNA in een elektrisch veld als gevolg van verschillen in hoeveelheid DNA schade.
Abstract
Een aantal geneesmiddelen gericht op de DNA herstel routes en induceren celdoding door het creëren van DNA schade. Zo zijn processen om rechtstreeks DNA-beschadiging uitgebreid geëvalueerd. Traditionele methoden zijn tijdrovend, duur, arbeidsintensief en vereisen replicerende cellen. In tegenstelling, de comet assay, een cel gelelektroforese assay, een snellere, niet-invasieve, goedkoop, direct en gevoelige meting van DNA schade en herstel. Alle vormen van DNA-schade en DNA-herstel kan worden gevisualiseerd op de enkele cel niveau met behulp van deze krachtige techniek.
Het uitgangspunt van de comet assay is dat intact DNA sterk geordende terwijl DNA-schade verstoort deze organisatie. De beschadigde DNA sijpelt in de agarose matrix en wanneer onderworpen aan een elektrisch veld, het negatief geladen DNA migreert naar de kathode die positief geladen is. De grote onbeschadigd DNA strengen kunnen niet ver van de kern migreren. DNA schademaakt kleinere DNA fragmenten die groter bereik dan het intacte DNA. Comet Assay een beeldanalyse software, meet en vergelijkt de totale fluorescentie-intensiteit van de DNA in de kern met DNA dat uit gemigreerd van de kern. Fluorescerend signaal van de gemigreerde DNA evenredig is met DNA schade. Langere helderder DNA staart betekent verhoogde DNA-schade. Enkele parameters die gemeten zijn staart moment dat een maat is voor zowel de hoeveelheid DNA en de verdeling van DNA in de staart, staartlengte en het percentage DNA in de staart. Deze test maakt het mogelijk om DNA repair meten en aangezien resolutie van DNA schade betekent herstel heeft plaatsgevonden. De grens van de gevoeligheid is ongeveer 50 breuken per diploïde zoogdiercellen 1,2. Cellen behandeld met een DNA beschadigende middelen, zoals etoposide, kan worden gebruikt als een positieve controle. Dus de comet assay is een snelle en effectieve procedure DNA schade te meten.
Protocol
1. Cultuur van de Cel
- Cultuur neuronale cellen en behandelen hen als dat nodig is.
- Oogst cellen in 15 ml buizen: aspiraat media, spoelen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, calcium en magnesium vrij), voeg trypsine in 15 ml buizen en trypsine passende serum bevattend medium te neutraliseren.
- Spin bij 1000 xg gedurende 5 minuten.
- Aspireren media.
- Resuspendeer cellen in PBS.
- Spin bij 1000 xg gedurende 5 minuten.
- Zuig media en resuspendeer cellen in verse PBS.
- Tellen cellen met behulp van een hemacytometer of uw favoriete celteller.
- Celmonsters onmiddellijk worden bereid voordat de assay.
- Alle monsters worden behandeld in het donker of licht gele DNA schade ultraviolet licht te voorkomen.
2. Comet Assay
1. Het prepareren van objectglaasjes
- Smelt 1% agarose (1 g / 100 ml in 1X Tris Base, boorzuur, EDTA, TBE) in een magnetron 3 min totdat alle korrels verdwijnen.
- Dip dia's in de gesmolten agarose en veeg een kant schoon met een Kimwipe. Laat de agarose aan de lucht drogen om een transparante film. Dit kan vooraf slides worden opgeslagen.
2. Neutraal Comet Assay
- Chill lysis oplossing (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% natrium lauryl sarcosinaat, en 1% Triton X-100, pH 10) bij 4 ° C gedurende ten minste 1 uur voor gebruik.
- 2.2.2. Smelt 1% laag smeltpunt agarose (1 g / 100 ml in 1X Tris Base, boorzuur, EDTA) in een magnetron 3 min totdat alle korrels verdwijnen. De agarose te koelen tot 37 ° C in een waterbad te voorkomen kunstmatige inductie van komeetstaartkanon. Idealiter de agarose te koelen gedurende een half uur voor gebruik.
- 2.2.3. Verdun de celsuspensie zodat er 100.000 cellen per ml. Combineer de celsuspensie met laag smeltpunt agarose (bij 37 ° C)een verhouding van 1:10 (v / v), vortex kort en direct Pipetteer 50 ul op de Comet Slide. Gebruik de zijkant van de pipetpunt aan de celsuspensie gelijkmatig over het testgebied. Elke behandelingsgroep moet ten minste in drievoud.
- Plaats de glaasjes plat in de koelkast gedurende 30 minuten tot een cirkel verschijnt in de periferie van de dia.
- Prechill de lysisoplossing en dompel slides in deze oplossing gedurende 30 minuten in het donker bij 4 ° C (of in de koelkast).
- Giet of zuigen de lysisoplossing en 1X voeg neutrale elektroforese buffer (Tris base, boorzuur, EDTA, 1X TBE). Laat dia's in deze buffer voor een half uur in de koelkast.
- Voeg voorgekoelde 1X Neutraal elektroforesebuffer (TBE) in elektroforese kamer, plaats dia's in elektroforese slide tray. Lijn slides zodat zij op gelijke afstand van elektroden.
- Giet 1X neutrale elektroforese tot bufferen tot 0,2 centimeter boven dia's. Overtollige buffer zal onderFere met elektroforese.
- Stel voedingsspanning tot 1 V per cm (gemeten elektrode naar elektrode) en gedurende 30 min bij 4 ° C (of de cel) in het donker.
3. Alkaline Comet Assay
- Chill lysis oplossing (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% natrium lauryl sarcosinaat, en 1% Triton X-100, pH 10) bij 4 ° C gedurende ten minste 1 uur voor gebruik.
- Smelt 1% laag smeltpunt agarose (1 g / 100 ml in 1X Tris Base, boorzuur, EDTA) in een magnetron 3 min totdat alle korrels verdwijnen. Vervolgens afkoelen in een 37 ° C waterbad gedurende ten minste 30 minuten.
- Combineer cellen bij 1 x 105 / ml met gesmolten laag smeltpunt agarose (bij 37 ° C) in een verhouding van 1:10 (v / v), vortex kort en direct 50 ui pipet op de Comet Slide. Gebruik de zijkant van de pipetpunt aan de celsuspensie gelijkmatig over het testgebied. Elke behandelingsgroep moet ten minste in drievoud.
- Plaats geschovenes plat in de koelkast gedurende 30 minuten tot een cirkel verschijnt in de periferie van de dia.
- Dompel de objectglaasjes in voorgekoelde lysis oplossing en laat bij 4 ° C gedurende 1 uur om 's nachts in het donker.
- Verwijder de dia's van de lysis oplossing, laat u de dia's en spoel een keer met koud neutralisatiebuffer gedurende 5 minuten om zeepresten en zouten te verwijderen voorafgaand aan het alkali-afwikkelen stap.
- Plaats de glaasjes in een gel elektroforese kamer gevuld met verse voorgekoelde elektroforese buffer (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH> 13) niet tot 0,5 cm boven dia overschrijden. Lijn slides zodat zij op gelijke afstand van elektroden.
- Laat slides in de alkalische buffer zitten voor 30 min in het donker mogelijk te maken afwikkelen van het DNA en de expressie van alkali-aansprakelijk schade.
- Stel voedingsspanning tot 1 V per cm (gemeten elektrode de elektrode) en 30 min bij 4 ° C uitgevoerd (of cel).
4. Bevestiging en Staining Cellen
- Giet het overtollige elektroforesebuffer
- Dompel de objectglaasjes in voorgekoeld gedestilleerd water gedurende 5 min bij RT.
- Dompel de objectglaasjes in voorgekoeld 70% ethanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Droge monsters een nacht. Niet blootstellen dia's aan fel licht. Monsters kunnen maanden opgeslagen bij kamertemperatuur voor het maken van dit stadium.
- Vlek dia door onderdompeling in SYBR Green (1X verdund in PBS) gedurende 20 minuten in de koelkast.
- Verwijder dia's en laat ze goed drogen in het donker. De agarose wordt transparant als het geheel droog.
4. Image Acquisition and Analysis
- Acquire beelden met behulp van fluorescentie microscoop ingesteld op de groene filter (Zeiss AxioVision) en analyseren met behulp van Comet Assay software (Perceptive Instruments).
- Op de "comet head" (de kern) en berekent de software de parameters inclusief de gemiddelde staart moment hoeveelheid DNA in dekern.
- Analyseren ten minste 200 cellen per behandeling.
- Gegevens exporteren naar Microsoft Excel.
- Bereken betekenen staart moment voor elke behandelingsgroep en plotgegevens naargelang het geval.
5. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van comet assay analyse van neuronale cellen wordt getoond in Figuur 2 en Figuur 3. In dit geval bestraling van de neuronale cellen induceert DNA schade. De cellen worden onderworpen aan het elektrische veld, de DNA migreert met verschillende snelheden door verschillen in grootte, die vervolgens wordt geanalyseerd op de Comet Assay software. Hoe meer de DNA schade, hoe verder de DNA migreert uit de kern. Dit vermindert de fluorescentie-intensiteit in de kern, die vervolgens wordt opgepikt door de software en resulteert in hogere staart moment. Tabel 1 geeft een representatief tafel comet assay analyse en Figuur 4 een representatievetieve grafiek die DNA schade in neuronale cellen na bestraling zoals gemeten door de comet assay.
Figuur 1. Stroomschema van de komeet assay. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Representatieve beelden van neuronale cellen (A) en zonder (B) met komeetstaartkanon.
Figuur 3. Comet assay analyse met Comet Assay software. (A) Vertegenwoordiger screen shots van het beeld verkregen met Carl Zeiss fluorescentie microscoop en geanalyseerd met behulp van CometAssay software. (B) te klikken op de kern of het "komeet hoofd" (omcirkeld in groen) genereert een fluorescerende kaart en grafiek (geel omcirkeld) en een (C) gegevenstabel (rood omcirkeld). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Representatieve grafiek verkregen door het uitzetten van de gemiddelde staart tijdstip verkregen door analyse van DNA schade in bestraalde en niet-bestraalde neuronale cellen met neutrale comet assay. Zoals verwacht 3Gy straling (x-ray) veroorzaakt DNA beschadiging zoals afgebeeld door de hogere gemiddelde staart moment in de bestraalde neuronale cellen. Getoond wordt de gemiddelde staart moment (+ / - standaardfout), ** p <0,01.
Tabel 1. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De komeet assay heeft de unieke capaciteit van het analyseren van individuele cellen. Dit is voordelig in identificatie van subpopulaties van cellen die andere reactie op cytotoxische middelen tonen. Een aantal praktische beperkingen moeten worden gehouden. Het aantal cellen die afzonderlijk kunnen worden geëvalueerd kan variëren afhankelijk van het individu. De steekproefomvang te worden verhoogd indien er variatie in DNA schade binnen een populatie. Levensvatbare enkele celsuspensie noodzakelijk is voor deze assay sinds overheersende aanwezigheid van necrotisch of apoptotische cellen aan fouten. De lysis en elektroforese stappen krijgt ontdoen van apoptotische cellen, kleine DNA-fragmenten (kleiner dan 50kb), en mitochondriaal DNA. Zo worden ze niet gedetecteerd door de komeet assay 1,3-11.
Zoals hierboven vermeld, de comet assay is een efficiënte manier voor het opsporen enkel-en dubbel-breuken, met inbegrip van alkali-labiele sites en DNA-DNA/DNA-protein cross-links op deDNA. Hier hebben geschetst twee verschillende protocollen: de alkaline assay maakt de detectie van enkelstrengs breuken en dubbelstrengs breuken, terwijl de neutrale comet assay kan alleen de detectie van dubbelstrengsbreuken. Enzym-gemodificeerde comet assay kan toegepast op oxidatieve DNA adducten detecteren. Bijvoorbeeld herkennen behandeling met Endo III (endonuclease) en hOGG1 (glycosylase) geoxideerd pyrimidines zoals thymine glycol en uracil glycol 12,13 en 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoGua) 14,15 respectievelijk. Formamidopyrimidine DNA-glycosylase (FPG) kan eveneens worden gebruikt. Voor deze gemodificeerde test, behandeling met de enzymen vooraf de aflopende stap. De toevoeging van letselspecifieke endonucleasen verhoogt de gevoeligheid van de comet assay en 13.
Hier gebruiken we de staart moment als de descriptor van DNA-schade. Staart moment wordt berekend met de volgende formule: percentage van DNA in de staart vermenigvuldigd met de length van de komeet staart 1,3-7. De lengte van de komeetstaartkanon (staartlengte) de afstand van het midden van de kern naar het uiterste punt van migratie van het DNA. Koplengte de diameter van de kern. Kop en staart intensiteit intensiteit zijn de gemiddelde pixel intensiteiten in de kop en de staart van de komeet, respectievelijk. Totale oppervlakte is de totale oppervlakte van de komeet 1,3-7.
Hoewel er andere methoden om DNA schade zoals γ-H2AX foci kleuring en pulsed-field gelelektroforese deze assays hebben nadelen ook 4,6,11,16,17. Bijvoorbeeld replicatie stress is vaak een confounder in de meting van γ-niveaus H2AX 18. Sinds de oprichting van de γ-H2AX foci is afhankelijk van werving van DNA reparatie-eiwitten, kan het niet DNA reparatie-eiwitten en een gecondenseerde chromatine structuur te werven leiden tot een vals lage γ-H2AX foci niveaus ook. Ook pulsed-field gel electrophoresis is erg tijdsintensief en is alleen voordelig voor scheiding van grote DNA moleculen 19,20. Dus de comet assay is een relatief eenvoudig, efficiënt en goedkoop, direct en gevoelige meting van DNA schade en herstel 10,11,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de IMPACT Award van de afdeling Radiotherapie van de Universiteit van Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, de Fighting Children's Cancer Foundation, en de Gabrielle's Angel Foundation (tot ESY.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L.
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al.
- Finney, M.
- Electrophoresis, F. I., et al. Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
