Summary
Assay השביט הוא דרך יעילה לאיתור הפסקות בודדות וגדיל כפול, לרבות אתרים אלקלי רופפים וDNA-DNA/DNA-protein-קישורי צלב שעל ה-DNA בכל התאים, כוללים נוירונים ביפוקמפוס. השיטה מנצלת את הגירת ההפרש של ה-DNA בשדה חשמלי בשל הבדלים בכמות הניזק לדנ"א.
Abstract
מספר התרופות למקד את מסלולי תיקון DNA ולגרום לתא הורג על ידי יצירת ניזק לדנ"א. לפיכך, תהליכים ישירות למדידת ניזק לדנ"א נבדקו בהרחבה. שיטות מסורתיות הן זמן, משאבים רבים, יקרים אינטנסיביים ודורשות תאים משתכפלים. לעומת זאת, בדיקת השביט, assay אלקטרופורזה ג'ל תא בודד, הנה אמצעי מהיר, לא פולשנית, זול, ישיר ורגיש של ניזק לדנ"א ותיקון. כל הצורות של ניזק לדנ"א, כמו גם תיקון DNA יכולות להיות דמיינו ברמת התא הבודדה באמצעות טכניקה זו עצמה.
העיקרון העומד ביסוד assay השביט הוא שדנ"א שלם הוא הורה מאוד ואילו ניזק לדנ"א משבש את הארגון הזה. מחלחל לתוך DNA הפגום agarose המטריצה וכאשר נתון שדה חשמלי, ה-DNA הטעון שלילי נודד לכיוון הקתודה הטעונה במטען חיובי. את גדילי הדנ"א הניזוק הגדולים אינם מסוגלים להעביר רחוק מהגרעין. ניזק לדנ"איוצר מקטעי דנ"א קטנים שנוסעים רחוק יותר מאשר ה-DNA בשלמותה. השביט Assay, תוכנת תמונת ניתוח, אמצעים ומשווה את עוצמת הניאון הכוללת של ה-DNA בגרעין עם DNA שהגר אל מחוץ לגרעין. אות ניאון מהדנ"א הגר פרופורציונלית לניזק לדנ"א. זנב דנ"א כבר בהיר מסמל גדל ניזק לדנ"א. חלק מהפרמטרים שנמדדו הוא רגע זנב שהוא מדד של שניהם כמות ה-DNA וההפצה של ה-DNA בזנב, אורך הזנב והאחוז של ה-DNA בזנב. בדיקה זו מאפשרת למדוד תיקון DNA גם מאז רזולוציה של ניזק לדנ"א מסמנת תיקון התרחש. המגבלה של רגישות היא כ 50 הפסקות גדיל ל1,2 התא דיפלואידי יונקים. תאים שטופלו עם כל סוכנים מזיקים DNA, כגון etoposide, יכולים לשמש כביקורת חיובית. כך assay השביט הוא הליך מהיר ויעיל למדידת ניזק לדנ"א.
Protocol
1. תא תרבות
- תאי תרבות עצביים ולטפל בם כנדרש.
- תאי קציר לתוך צינורות 15 מ"ל: תקשורת לשאוב, לשטוף עם פוספט נאגרו מלוח (PBS, סידן ומגנזיום חינם), להוסיף טריפסין, לאסוף בצינורות 15 מ"ל, ולנטרל את טריפסין עם מדיה מתאימה המכילה סרום.
- ספין ב1000 XG למשך 5 דקות.
- לשאוב תקשורת.
- Resuspend תאים בPBS.
- ספין ב1000 XG למשך 5 דקות.
- לשאוב תקשורת ותאי resuspend ב PBS הטרי.
- ספירת תאים באמצעות hemacytometer או נגד התא המועדף עליך.
- דגימות תאים צריכות להיות מוכנות מייד לפני תחילת הבדיקה.
- כל הדגימות צריכות להיות מטופל באור הכהה או צהוב כדי למנוע ניזק לדנ"א מאור אולטרה סגול.
2. Assay שביט
1. הכנת מצגת
- ממסי 1% agarose (1 גר '/ 100 מ"ל ב1X טריס בסיס, בורה חומצה, EDTA, שהחפתה) במיקרוגל במשך 3 דקות עד שכל הגרגירים ייעלמו.
- טובלים את השקופיות לagarose המותך ולנגב צד לנקות עם kimwipe. אפשר agarose לאוויר יבש לסרט שקוף. ניתן לעשות זאת מראש ושקופיות ניתן לאחסן.
2. Assay שביט הניטראלי
- פתרון צינת תמוגה (2.5 מ 'NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM טריס בסיס, 1% sarcosinate אוריל נתרן, ו1% Triton X-100, 10 pH) בשעת 4 מעלות צלזיוס למשך שעות לפחות 1 לפני השימוש.
- 2.2.2. ממס% ההיתוך agarose נקודה נמוך 1 (1 גר '/ 100 מ"ל ב1X טריס בסיס, חומצה בורה, EDTA) במיקרוגל במשך 3 דקות עד שכל הגרגירים ייעלמו. Agarose צריך להיות מקורר ל 37 מעלות צלזיוס באמבט מים כדי להימנע מזירוז מלאכותי של זנב שביט. באופן אידיאלי, agarose צריך להיות מקורר למשך חצי שעה לפני השימוש.
- 2.2.3. לדלל את השעית התא כך שיש 100.000 תאים למ"ל. מערבב את השעית התא עם נקודת ההיתוך agarose הנמוך (על 37 מעלות צלזיוס) בשעהיחס של 1:10 (v / v), בקצרה מערבולת, ופיפטה 50 μl מייד על שקופיות השביט. השתמש בצד של קצה פיפטה להפיץ את השעית התא באופן שווה על פני שטח המדגם. כל קבוצת טיפול צריכה להיות לפחות בשלושה עותקים.
- מקום מחליק שטוח במקרר למשך 30 דקות עד שהעיגול מופיע בפריפריה של השקופית.
- Prechill פתרון תמוגה ושקופיות להטביע בפתרון זה למשך 30 דקות בחושך ב 4 ° C (או במקרר).
- יוצק מעל או לשאוב את פתרון תמוגה ולהוסיף חיץ אלקטרופורזה ניטראלית 1X (טריס בסיס, חומצה בורה, EDTA, 1X TBE). השאר שקופיות במאגר זה במשך חצי שעה במקרר.
- הוסף הצפת prechilled 1X ניטראלית אלקטרופורזה (TBE) בחדר אלקטרופורזה, שקופיות מקום בשקופית מגש אלקטרופורזה. יישר שקופיות, כך הם במרחק שווים מהאלקטרודות.
- יוצק אלקטרופורזה הניטראלית 1X חיץ עד 0.2 סנטימטרים מעל שקופיות. חיץ עודף ביןfere עם אלקטרופורזה.
- קבע מתח חשמל לV 1 לכל סנטימטר (נמדד האלקטרודה לאלקטרודה) ולהפעיל למשך 30 דקות ב 4 ° C (או בחדר הקר) בחושך.
3. Assay השביט אלקליין
- פתרון צינת תמוגה (2.5 מ 'NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM טריס בסיס, 1% sarcosinate אוריל נתרן, ו1% Triton X-100, 10 pH) בשעת 4 מעלות צלזיוס למשך שעות לפחות 1 לפני השימוש.
- ממסי 1% נמוך היתוך agarose נקודה (1 גר '/ 100 מ"ל ב1X טריס בסיס, חומצה בורה, EDTA) במיקרוגל במשך 3 דקות עד שכל הגרגירים ייעלמו. אז מגניב ב° אמבט מים 37 ג ללפחות 30 דקות.
- שלבו את התאים במיליליטר 1 x 105 / עם נקודת התכה הנמוכה agarose המותך (על 37 מעלות צלזיוס) ביחס של 1:10 (v / v), בקצרה מערבולת, ופיפטה 50 μl מייד על שקופיות השביט. השתמש בצד של קצה פיפטה להפיץ את השעית התא באופן שווה על פני שטח המדגם. כל קבוצת טיפול צריכה להיות לפחות בשלושה עותקים.
- המקום החליקes השטוח במקרר למשך 30 דקות עד למעגל מופיע בפריפריה של השקופית.
- שקופיות לטבול בתמיסת תמוגה prechilled ועוזב ב4 מעלות צלזיוס למשך שעות 1 עד הלילה בחושך.
- הסר את השקופיות מפתרון תמוגה, לנקז את השקופיות ולשטוף פעם אחת עם חיץ נטרול קר למשך 5 דקות כדי להסיר חומרי ניקוי ומלחים שיורית לפני צעד אלקלי התרה-.
- שקופיות מקום בתא אלקטרופורזה ג'ל מלא במאגר prechilled טרי אלקטרופורזה (300 המ"מ NaOH, 1 mM EDTA, pH> 13) לא יעלה על 0.5 סנטימטרים מעל שקופיות. יישר שקופיות, כך הם במרחק שווים מהאלקטרודות.
- בואו שקופיות לשבת במאגר הבסיסי למשך 30 דקות בחושך כדי לאפשר להתרה של ה-DNA והביטוי לניזק אלקלי אחראי.
- קבע מתח חשמל לV 1 לכל סנטימטר (נמדד האלקטרודה לאלקטרודה) ולהפעיל למשך 30 דקות ב 4 ° C (או בחדר הקר).
4. תיקון וStaתאי ining
- מסנן מאגר אלקטרופורזה עודפת
- לטבול במים מזוקקים מחליק מראש מקוררים למשך 5 דקות בRT.
- שקופיות לטבול באתנול 70% מראש מקורר למשך 5 דקות בRT.
- דגימות יבשות בן הלילה. אל תחשוף את שקופיות לאור בהיר. דוגמאות יכולות להיות מאוחסנות במשך חודשים בטמפרטורת חדר לפני הבקיע בשלב זה.
- כתם שקופיות על ידי הטבילה בSybr ירוק (1X המדולל ב PBS) למשך 20 דקות במקרר.
- הסר שקופיות ולאפשר להם להתייבש לגמרי בחושך. Agarose יהפוך שקוף כשיבש לחלוטין.
4. יבוא תמונות וניתוח
- לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המוגדר הירוק המסנן (Zeiss AxioVision) ולנתח באמצעות תוכנת Assay שביט (מכשירי Perceptive).
- לחץ על "ראש השביט" (גרעין) והתוכנה מחשבת את הפרמטרים כוללים רגע ממוצע הזנב וכמות ה-DNA בגרעין.
- לנתח לפחות 200 תאים לכל טיפול.
- יצוא נתונים ל-Microsoft Excel.
- חישוב מתכוון לרגע זנב לכל קבוצת טיפול ונתוני עלילה על פי צורך.
5. נציג תוצאות
דוגמה לניתוח assay שביט על תאים עצביים מוצגת באיור 2 ואיור 3. במקרה זה, הקרנה של התאים העצביים גורמת ניזק לדנ"א. כאשר התאים נחשפים לשדה החשמלי, ה-DNA נודד בשיעורים שונים בשל הבדלים בגודל שנותח לאחר מכן באמצעות תוכנת Assay שביט. יותר הניזק לדנ"א, רחוק יותר את ה-DNA נודד אל מחוץ לגרעין. זה מקטין את עוצמת הניאון בגרעין שהרימה לאחר מכן על ידי התוכנה ותוצאות ברגע זנב גבוה. טבלה 1 מציגה טבלת נציג מהניתוח והאיור 4 assay שביט תערוכות יציגותגרף באשר היא מסוגלת להשוות ניזק לדנ"א בתאים עצביים בעקבות קרינה, כפי שנמדד על ידי assay השביט.
איור 1. תרשים זרימה של assay השביט. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. תמונות מייצגות של תאים עצביים () ללא ו( ב ') עם זנב שביט.
איור 3. ניתוח assay שביט באמצעות תוכנת Assay שביט. () תמונות מסך יציג של תמונה נרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי Carl Zeiss ונותחה באמצעות שביטתוכנת assay. (ב) לחיצה על הגרעין או "ראש השביט" (מוקף בעיגול ירוק) יוצרת מפת ניאון וגרף (מוקף בעיגול צהוב) וטבלה (ג') נתונים (מוקף בעיגול אדום). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 4. גרף נציג מתקבל על ידי זומם רגע הזנב הממוצע שהושג על ידי ניתוח הניזק לדנ"א בתאים עצביים מוקרנים ובלתי מוקרנים באמצעות assay שביט ניטראלי. כצפוי, קרינת 3Gy (רנטגן) גורמת ניזק לדנ"א כמתואר על ידי רגע זנב הממוצע הגבוה יותר בתאים העצביים המוקרנים. שמוצג הוא רגע ממוצע הזנב (+ / - שגיאה סטנדרטית), ** P <0.01.
טבלת 1. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Assay השביט יש את היכולת הייחודית של ניתוח תאים בודדים. זהו יתרון בזיהוי של אוכלוסיות של תאים הממחישות תגובת הפרש לסוכנים ציטוטוקסיות. כמה מגבלות מעשיות צריכות להילקח בחשבון. מספר התאים שניתן להעריך בנפרד עשוי להשתנות בהתאם לפרט. גודל המדגם צריך להיות מוגבר אם יש שונה בניזק לדנ"א בתוך אוכלוסייה. השעית קיימא תא בודד היא קריטית עבור assay זה מאז נוכחות דומיננטית של תאים נמקית או אפופטוטיים תוסיף לשגיאה. צעדי תמוגה ואלקטרופורזה מסלק תאים אפופטוטיים, שברים קטנים של DNA (קטן מ 50kb), ו-DNA של המיטוכונדריה. לפיכך, הם לא זוהו על ידי בדיקת השביט 1,3-11.
כאמור, בדיקת השביט היא דרך יעילה לאיתור הפסקות בודדות וגדיל כפול, לרבות אתרים אלקלי רופפים וDNA-DNA/DNA-protein-קישורים צולבים עלה-DNA. כאן יש לנו התווינו שני פרוטוקולים שונים: בדיקת אלקליין מאפשרת זיהוי של הפסקות גדיל בודדות, כמו גם הפסקות גדיל כפולות, ואילו assay השביט הניטראלי רק מאפשר זיהוי של הפסקות גדיל כפולות. assay שביט אנזימים שונים יכול הוחל לזהות adducts DNA חמצונים. לדוגמה, הטיפול באנדו III (endonuclease) וhOGG1 (glycosylase) להכיר מתחמצן pyrimidines כולל גליקול תימין ואורציל גליקול 12,13 ו 8-אוקסו-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoGua) 14,15 בהתאמה. Formamidopyrimidine-DNA glycosylase (FPG) יכול לשמש באופן דומה. עבור assay זה שונה, טיפול באנזימים מקדים את שלב ההתרה. התוספת של endonucleases נגע ספציפי מגבירה את הרגישות של assay השביט, כמו גם 13.
כאן אנו משתמשים ברגע זנב כמתאר של ניזק לדנ"א. רגע זנב מחושב באמצעות הנוסחא הבאה: אחוז DNA בזנב כפול lenGTH של שביט זנב 1,3-7. אורכו של זנב השביט (אורך זנב) הוא המרחק ממרכז הגרעין לנקודה הרחוקה ביותר מהגירה של ה-DNA. אורך הראש הוא בקוטר של הגרעין. עוצמת הראש ועוצמת זנב הן עוצמות ממוצעות פיקסל בראש ובזנבו של כוכב, בהתאמה. שטח כולל הוא השטח הכולל של השביט 1,3-7.
אמנם יש שיטות אחרות למדידת ניזק לדנ"א, כגון צביעת γ-H2AX מוקדים ואלקטרופורזה ג'ל פעם שדה, המבחנים הללו יש חסרונות שלהם, כמו גם 4,6,11,16,17. למשל, מתח שכפול הוא לעתים קרובות confounder במדידת הרמות γ-H2AX 18. מאז הקמתה של γ-H2AX מוקדים תלויה בגיוס של חלבוני תיקון DNA, כישלון לגייס חלבוני תיקון DNA ומבנה הכרומטין מרוכז עלול להוביל לרמות נמוכות כוזב γ-H2AX מוקדים גם כן. כמו כן, פעם השדה ג'ל electrophoresis מאוד זמן אינטנסיבי ומועיל רק להפרדה של מולקולות דנ"א גדולות 19,20. לפיכך, בדיקת השביט היא מדד קל יחסית, יעיל וזול, ישיר ורגיש של ניזק לדנ"א ותיקון 10,11,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בפרס IMPACT מהמחלקה לאונקולוגיה קרינה, אוניברסיטת אלבמה-בירמינגהם המקיף במרכז הסרטן, קרן הסרטן של לחימת הילדים, ואנג'ל הקרן של גבריאל (לESY.) על ידי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L.
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al.
- Finney, M.
- Electrophoresis, F. I., et al. Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
