Summary
धूमकेतु परख क्षार अस्थायी साइटों और hippocampal न्यूरॉन्स सहित सभी कोशिकाओं में डीएनए पर DNA-DNA/DNA-protein पार लिंक सहित एकल और डबल भूग्रस्त टूटता है, का पता लगाने का एक कारगर तरीका है. विधि डीएनए के अंतर प्रवास के डीएनए की क्षति की राशि में अंतर की वजह से एक बिजली के क्षेत्र में लाभ लेता है.
Abstract
दवाओं के एक नंबर डीएनए की मरम्मत रास्ते लक्ष्य और प्रेरित सेल डीएनए की क्षति बनाकर मार. इस प्रकार, प्रक्रियाओं के लिए सीधे डीएनए की क्षति को मापने के लिए बड़े पैमाने पर मूल्यांकन किया गया है. पारंपरिक तरीकों समय लेने, महंगी संसाधन, गहन और नकल कोशिकाओं की आवश्यकता होती है. इसके विपरीत, धूमकेतु परख, एक एकल कोशिका जेल वैद्युतकणसंचलन परख, एक तेज, गैर इनवेसिव, सस्ती, डीएनए की क्षति और मरम्मत के प्रत्यक्ष और संवेदनशील उपाय है. डीएनए की मरम्मत के डीएनए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से क्षति के सभी रूपों एकल कोशिका स्तर पर इस शक्तिशाली तकनीक का उपयोग करते हुए देखे जा सकते हैं.
धूमकेतु परख अंतर्निहित सिद्धांत यह है कि कि बरकरार डीएनए अत्यधिक जबकि डीएनए की क्षति के इस संगठन को बाधित करने के लिए आदेश दिया है. agarose मैट्रिक्स में क्षतिग्रस्त डीएनए seeps और जब एक बिजली के क्षेत्र के अधीन है, नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए कैथोड जो सकारात्मक आरोप लगाया है की ओर migrates. बड़े undamaged डीएनए strands नाभिक से दूर ओर पलायन कर नहीं कर रहे हैं. डीएनए की क्षतिछोटे डीएनए टुकड़े जो बरकरार डीएनए से दूर यात्रा बनाता है. धूमकेतु परख, एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, उपाय और नाभिक में डीएनए कि नाभिक के बाहर चले गए है के साथ डीएनए के समग्र फ्लोरोसेंट तीव्रता तुलना. माइग्रेट डीएनए फ्लोरोसेंट संकेत से डीएनए की क्षति के आनुपातिक है. लंबा उज्जवल डीएनए पूंछ बढ़ डीएनए की क्षति का प्रतीक है. मापदंडों मापा जाता है कि कुछ पूंछ पल जो दोनों डीएनए की मात्रा और डीएनए की पूंछ, पूंछ की लंबाई में वितरण और पूंछ में डीएनए के प्रतिशत के एक उपाय है. इस परख डीएनए की मरम्मत के उपाय के रूप में अच्छी तरह से की अनुमति देता है के बाद से डीएनए की क्षति के संकल्प का प्रतीक है मरम्मत जगह ले ली है. संवेदनशीलता की सीमा लगभग द्विगुणित स्तनधारी सेल 1,2 प्रति 50 भूग्रस्त टूटता है. Etoposide के रूप में किसी भी डीएनए हानिकारक एजेंटों के साथ इलाज किया कोशिकाओं, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रकार धूमकेतु परख डीएनए की क्षति को मापने के लिए एक त्वरित और कारगर प्रक्रिया है.
Protocol
1. सेल संस्कृति
- संस्कृति neuronal कोशिकाओं और उन्हें इलाज के रूप में की जरूरत है.
- 15 मिलीलीटर ट्यूब में हार्वेस्ट कोशिकाओं: Aspirate मीडिया, फॉस्फेट से कुल्ला buffered खारा (पीबीएस, कैल्शियम और मैग्नीशियम मुफ्त), trypsin जोड़ने के लिए, 15 मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा करने और उचित सीरम युक्त मीडिया के साथ trypsin बेअसर.
- 5 मिनट के लिए 1000 XG पर स्पिन.
- मीडिया Aspirate.
- पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend.
- 5 मिनट के लिए 1000 XG पर स्पिन.
- ताजा पीबीएस में मीडिया और resuspend कोशिकाओं Aspirate.
- एक hemacytometer या अपनी पसंद के सेल काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गणना.
- सेल नमूने परख शुरू करने से पहले तुरंत तैयार किया जाना चाहिए.
- पराबैंगनी प्रकाश से डीएनए की क्षति को रोकने के सभी नमूनों अंधेरे या पीले रंग की रोशनी में नियंत्रित किया जाना चाहिए.
2. धूमकेतु परख
1. स्लाइड तैयार
- 1% agarose (1X Tris बेस, बोरिक एसिड, EDTA, टीबी में 1/100 ग्राम मिलीलीटर पिगलोई) 3 मिनट के लिए माइक्रोवेव में जब तक सभी granules गायब हो जाते हैं.
- पिघला हुआ agarose में डुबकी स्लाइड्स और एक तरफ पोंछे kimwipe साथ साफ. एक पारदर्शी फिल्म करने के लिए हवा सूखी agarose की अनुमति दें. यह अग्रिम और स्लाइड में किया जा सकता है संग्रहित किया जा सकता है.
2. तटस्थ धूमकेतु परख
- शांत 4 डिग्री सेल्सियस पर lysis (2.5 एम NaCl, 100 मिमी EDTA 10 पीएच, 10 मिमी Tris बेस, 1% सोडियम lauryl sarcosinate, और 1% ट्राइटन X-100, पीएच 10) का उपयोग करने से पहले कम से कम 1 घंटा के लिए समाधान.
- 2.2.2. 3 मिनट के लिए माइक्रोवेव में 1% कम पिघलने बिंदु agarose (1X Tris बेस में 1 ग्राम / 100ml, बोरिक एसिड, EDTA) पिगलो जब तक सभी granules गायब हो जाते हैं. agarose ° सी एक पानी में स्नान 37 को ठंडा किया धूमकेतु की पूंछ की कृत्रिम प्रेरण से बचने की जरूरत है. आदर्श रूप में, agarose उपयोग करने से पहले आधे घंटे के लिए ठंडा करने के लिए किया जाना चाहिए.
- 2.2.3. सेल निलंबन पतला इतना है कि वहाँ मिलीग्राम प्रति 100.000 कोशिकाओं रहे हैं. कम पिघलने बिंदु (37 डिग्री सेल्सियस) agarose के साथ सेल निलंबन का मिश्रण01:10 (v / v), भंवर संक्षिप्त, अनुपात और तुरंत धूमकेतु स्लाइड पर 50 μl विंदुक. विंदुक टिप की ओर प्रयोग नमूना क्षेत्र पर सेल के निलंबन को समान रूप से वितरित करने के लिए. प्रत्येक उपचार समूह तीन प्रतियों में कम से कम होना चाहिए.
- 30 मिनट के लिए फ्रिज में फ्लैट स्लाइड जब तक एक चक्र स्लाइड की परिधि में प्रकट होता है.
- Prechill lysis समाधान और 4 पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में डूब स्लाइड इस समाधान में डिग्री सेल्सियस (या एक रेफ्रिजरेटर में).
- बंद डालो या lysis समाधान निकालना और 1X तटस्थ वैद्युतकणसंचलन बफर (Tris आधार, बोरिक एसिड, EDTA, 1X tbe) जोड़ें. फ्रिज में आधे घंटे के लिए इस बफर में स्लाइड्स छोड़ें.
- Prechilled 1X वैद्युतकणसंचलन कक्ष में तटस्थ वैद्युतकणसंचलन (tbe) बफर, वैद्युतकणसंचलन स्लाइड ट्रे में जगह स्लाइड्स जोड़ें. स्लाइड इतना है कि वे इलेक्ट्रोड से समदूरस्थ संरेखित करें.
- डालो 1X तटस्थ वैद्युतकणसंचलन स्लाइड्स ऊपर 0.2 इंच करने के लिए बफर. अतिरिक्त बफर अंतर होगावैद्युतकणसंचलन साथ FERE.
- सेमी प्रति 1 वी (इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोड मापा) सेट करने के लिए बिजली की आपूर्ति वोल्टेज और 4 डिग्री सेल्सियस (या ठंडे कमरे) में अंधेरे में 30 मिनट के लिए चला.
3. Alkaline धूमकेतु परख
- शांत 4 डिग्री सेल्सियस पर lysis (2.5 एम NaCl, 100 मिमी EDTA 10 पीएच, 10 मिमी Tris बेस, 1% सोडियम lauryl sarcosinate, और 1% ट्राइटन X-100, पीएच 10) का उपयोग करने से पहले कम से कम 1 घंटा के लिए समाधान.
- एक माइक्रोवेव में 1% कम पिघलने बिंदु agarose (1X Tris बेस में 1/100 ग्राम मिलीलीटर, बोरिक एसिड, EDTA) 3 मिनट के लिए जब तक सभी granules गायब पिगलो. तो कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शांत है.
- पिघला हुआ कम पिघलने बिंदु agarose के साथ 1 एक्स 105 / 01:10 (v / v), भंवर संक्षिप्त, एक अनुपात (37 डिग्री सेल्सियस) मिलीलीटर में कोशिकाओं का मिश्रण है और तुरंत धूमकेतु स्लाइड पर 50 μl विंदुक. विंदुक टिप की ओर प्रयोग नमूना क्षेत्र पर सेल के निलंबन को समान रूप से वितरित करने के लिए. प्रत्येक उपचार समूह तीन प्रतियों में कम से कम होना चाहिए.
- प्लेस गिरावटतों फ्लैट 30 मिनट के लिए फ्रिज में जब तक एक चक्र स्लाइड की परिधि में प्रकट होता है.
- Prechilled lysis समाधान में और 4 पर छोड़ सी ° 1 घंटे के लिए अंधेरे में रात भर विसर्जित स्लाइड.
- Lysis समाधान से स्लाइड्स निकालें, स्लाइड नाली और अवशिष्ट डिटर्जेंट और लवण हटाने के कदम क्षार unwinding पहले 5 मिनट के लिए ठंडा निराकरण बफर के साथ एक बार कुल्ला.
- एक जेल वैद्युतकणसंचलन कक्ष में जगह स्लाइड prechilled ताजा बना वैद्युतकणसंचलन (300 मिमी NaOH, 1 मिमी EDTA,> पीएच 13) बफर स्लाइड्स ऊपर 0.5 सेमी से अधिक नहीं होनी के साथ भरा. स्लाइड इतना है कि वे इलेक्ट्रोड से समदूरस्थ संरेखित करें.
- चलो स्लाइड अंधेरे में 30 मिनट के लिए alkaline बफर में बैठने के लिए डीएनए और क्षार उत्तरदायी नुकसान की अभिव्यक्ति के unwinding के लिए अनुमति देने के लिए.
- सेमी प्रति 1 वी (इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोड मापा) के लिए बिजली की आपूर्ति वोल्टेज सेट और 4 पर 30 मिनट के लिए चलाने ° C (या ठंडे कमरे).
4. फिक्सिंग और स्टेडियमining प्रकोष्ठों
- अतिरिक्त वैद्युतकणसंचलन बफर नाली
- आरटी पर 5 मिनट के लिए पूर्व ठंडा आसुत जल में विसर्जित स्लाइड.
- पूर्व ठंडा आरटी पर 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में विसर्जित स्लाइड.
- सूखी रातोंरात नमूने हैं. उज्ज्वल प्रकाश को बेनकाब मत स्लाइड. नमूने इस स्तर पर स्कोरिंग करने से पहले कमरे के तापमान में महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है.
- फ्रिज में 20 मिनट के लिए SYBR हरे (1X पीबीएस में पतला) में डुबो कर स्लाइड दाग.
- स्लाइड्स निकालें और उन्हें पूरी तरह से अंधेरे में शुष्क करने की अनुमति. agarose पारदर्शी हो जब पूरी तरह से सूखे.
4. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण
- फ्लोरोसेंट खुर्दबीन हरे (Zeiss AxioVision) फिल्टर और धूमकेतु परख सॉफ्टवेयर (ज्ञानविषयक उपकरण) का उपयोग का विश्लेषण करने के लिए सेट का उपयोग कर छवियों मोल.
- "धूमकेतु सिर" (नाभिक) पर क्लिक करें और सॉफ्टवेयर मापदंडों मतलब पूंछ और डीएनए की मात्रा सहित पल खरीदते हैंनाभिक.
- उपचार के प्रति कम से कम 200 कोशिकाओं का विश्लेषण.
- Microsoft Excel में डेटा निर्यात.
- प्रत्येक उपचार समूह और उचित रूप में साजिश डेटा के लिए पूंछ पल मतलब की गणना.
5. प्रतिनिधि परिणाम
धूमकेतु neuronal कोशिकाओं पर परख विश्लेषण का एक उदाहरण चित्रा 2 और 3 चित्र में दिखाया गया है. इस मामले में, neuronal कोशिकाओं के विकिरण डीएनए की क्षति को प्रेरित करता है. कोशिकाओं के रूप में बिजली के क्षेत्र के अधीन हैं, डीएनए अलग आकार में अंतर है जो बाद में धूमकेतु परख सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया जाता है के कारण दरों पर migrates. अधिक डीएनए की क्षति, आगे डीएनए नाभिक के बाहर migrates. यह नाभिक में फ्लोरोसेंट तीव्रता जो बाद में सॉफ्टवेयर और उच्च पूंछ पल में परिणाम के द्वारा उठाया है 1 टेबल घट जाती है. धूमकेतु परख विश्लेषण और चित्रा 4 से एक प्रतिनिधि तालिका दर्शाया गया है एक प्रतिनिधि से पता चलता हैtative ग्राफ धूमकेतु परख द्वारा मापा के विकिरण के रूप में के बाद neuronal कोशिकाओं में डीएनए की क्षति की तुलना.
चित्रा 1. धूमकेतु परख का प्रवाह चार्ट बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2 neuronal कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों (ए) के बिना और (ख) धूमकेतु की पूंछ के साथ.
चित्रा 3. धूमकेतु परख धूमकेतु परख सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण. (ए) छवि के प्रतिनिधि स्क्रीन शॉट्स कार्ल Zeiss फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर हासिल कर लिया और धूमकेतु का उपयोग कर का विश्लेषणपरख सॉफ्टवेयर. (बी) के नाभिक या "धूमकेतु सिर" (हरे रंग में परिक्रमा) पर क्लिक करके एक फ्लोरोसेंट नक्शा और ग्राफ (पीले रंग में परिक्रमा) और (सी) डेटा तालिका (लाल रंग में परिक्रमा) उत्पन्न करता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 4 प्रतिनिधि मतलब पूंछ विकिरणित और गैर विकिरणित neuronal तटस्थ धूमकेतु परख का उपयोग कोशिकाओं में डीएनए की क्षति का विश्लेषण करके प्राप्त पल की साजिश रचने के द्वारा प्राप्त ग्राफ. जैसी उम्मीद थी, 3Gy विकिरण (एक्स - रे) डीएनए की क्षति लाती विकिरणित neuronal कोशिकाओं में उच्च मतलब है पूंछ पल रूप में चित्रित है. ** पी 0.01 <मतलब पूंछ (मानक त्रुटि + /) पल दिखाया गया है.
तालिका 1. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
धूमकेतु परख व्यक्ति की कोशिकाओं का विश्लेषण करने की अद्वितीय क्षमता है. यह कोशिकाओं के subpopulations है कि अंतर साइटोटोक्सिक एजेंटों के लिए जवाब प्रदर्शित की पहचान करने में फायदेमंद है. कुछ व्यावहारिक सीमाओं को ध्यान में रखा जाना है. कोशिकाओं की संख्या है कि व्यक्तिगत रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है व्यक्ति के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. नमूने का आकार वृद्धि की जरूरत है अगर वहाँ एक जनसंख्या के भीतर डीएनए की क्षति में भिन्नता है. व्यवहार्य एकल कोशिका निलंबन इस परख के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि परिगलित या apoptotic कोशिकाओं की प्रमुख उपस्थिति में त्रुटि के लिए जोड़ देगा. lysis और वैद्युतकणसंचलन कदम apoptotic कोशिकाओं, छोटे डीएनए टुकड़े (50kb तुलना में छोटे), और mitochondrial डीएनए के छुटकारा हो जाता है. इस प्रकार, वे धूमकेतु 1,3-11 परख के द्वारा नहीं पाया जाता है.
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, धूमकेतु परख क्षार अस्थायी साइटों और पर DNA-DNA/DNA-protein पार लिंक सहित एकल और डबल भूग्रस्त टूटता है, का पता लगाने का एक कारगर तरीका हैडीएनए. यहाँ हम दो अलग प्रोटोकॉल को रेखांकित किया है: alkaline परख भी कतरा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से टूट जाता है डबल भूग्रस्त टूटता का पता लगाने की अनुमति देता है, जबकि तटस्थ धूमकेतु परख केवल डबल भूग्रस्त टूटता का पता लगाने की अनुमति देता है. एनजाइम संशोधित धूमकेतु परख करने के लिए oxidative डीएनए adducts का पता लगाने के लिए लागू कर दिया गया है. उदाहरण के लिए, Endo (endonuclease) तृतीय और hOGG1 (glycosylase) के साथ उपचार pyrimidines थिमाइन glycol और uracil glycol 12,13 और 8-oxo-7 (8-oxoGua), 8 - dihydroguanine 14,15 क्रमशः सहित ऑक्सीकरण हो जाता है पहचान. डीएनए - glycosylase Formamidopyrimidine (FPG) इसी तरह इस्तेमाल किया जा सकता है. इस संशोधित परख के लिए, एंजाइमों के साथ इलाज unwinding कदम पछाड़ दिया है. घाव विशिष्ट endonucleases के अलावा धूमकेतु के रूप में अच्छी तरह से परख 13 की संवेदनशीलता बढ़ जाती है.
यहाँ हम डीएनए की क्षति के वर्णनकर्ता के रूप में पूंछ पल का उपयोग करें. पूंछ पल निम्न सूत्र का उपयोग कर की गणना की है: डीएनए की पूंछ में प्रतिशत लेन से गुणाधूमकेतु की पूंछ 1,3-7 gth. धूमकेतु की पूंछ की लंबाई (पूंछ लंबाई) नाभिक के डीएनए के प्रवास के दूर बात करने के लिए केंद्र से दूरी है. सिर की लंबाई नाभिक का व्यास है. प्रधान तीव्रता और पूंछ तीव्रता सिर और धूमकेतु की पूंछ में मतलब पिक्सेल तीव्रता, क्रमशः रहे हैं. कुल क्षेत्रफल 1,3-7 धूमकेतु की सतह की समग्र क्षेत्र है.
हालांकि वहाँ γ H2AX foci धुंधला हो जाना और स्पंदित क्षेत्र जेल वैद्युतकणसंचलन के रूप में इस तरह के डीएनए की क्षति को मापने के अन्य तरीके हैं, इन assays अपनी कमियां 4,6,11,16,17 में अच्छी तरह से किया है. उदाहरण के लिए, प्रतिकृति तनाव अक्सर γ H2AX 18 स्तरों के माप में एक confounder है. Γ-H2AX foci के गठन के बाद से डीएनए की मरम्मत प्रोटीन की भर्ती पर निर्भर है, डीएनए की मरम्मत प्रोटीन और एक संघनित chromatin संरचना की भर्ती करने में विफलता झूठा कम γ H2AX foci के स्तर के रूप में अच्छी तरह से हो सकता है. इसी तरह, स्पंदित क्षेत्र जेल electrophoresis बहुत समय गहन और केवल बड़े डीएनए 19,20 अणुओं के अलग होने के लिए फायदेमंद है. इस प्रकार, धूमकेतु परख एक अपेक्षाकृत आसान है, कुशल, और सस्ती, डीएनए की क्षति और 10,11,21 मरम्मत के प्रत्यक्ष और संवेदनशील उपाय है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम विकिरण कैंसर विज्ञान, बर्मिंघम अलबामा यूनिवर्सिटी व्यापक कैंसर केंद्र, लड़ बच्चों के कैंसर फाउंडेशन, और गेबरियल एन्जिल फाउंडेशन (esy.) विभाग से प्रभाव पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
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