Summary
Il test della cometa è un modo efficiente di rilevare rotture a singolo e doppio filamento, compresi alcali-labili siti e DNA-DNA/DNA-protein legami incrociati sul DNA in tutte le cellule, compresi i neuroni dell'ippocampo. Il metodo sfrutta la migrazione differenziale di DNA in un campo elettrico dovuto a differenze nelle quantità di danno al DNA.
Abstract
Un certo numero di farmaci indirizzare i percorsi di riparazione del DNA e indurre cellule uccidere con la creazione di danno al DNA. Così, i processi per misurare direttamente il danno al DNA sono stati ampiamente valutati. I metodi tradizionali sono in termini di tempo, costosa, molte risorse e richiedono cellule replica. In contrasto, il test della cometa, un unico gel test cellulare elettroforesi, è più veloce, non invasivo, economico, misura diretta e sensibile di danno e riparazione del DNA. Tutte le forme di danno al DNA e riparazione del DNA possono essere visualizzate a livello di singola cellula utilizzando questa tecnica potente.
Il principio alla base del test della cometa è che il DNA intatto è altamente ordinato che i danni del DNA sconvolge questa organizzazione. Le sorgenti di DNA danneggiato nella matrice di agarosio e quando sottoposto ad un campo elettrico, il DNA carico negativamente migra verso il catodo, che è caricato positivamente. Le grandi filamenti di DNA non danneggiati non sono in grado di migrare lontano dal nucleo. Danno al DNAcrea frammenti di DNA più piccole che viaggiano oltre la DNA intatto. Comet Assay, un software di analisi delle immagini, misure e confronta l'intensità complessiva fluorescente del DNA nel nucleo con il DNA che è migrata dal nucleo. Segnale fluorescente dal DNA migrato è proporzionale al danno del DNA. Coda DNA più lungo luminoso indica il danno al DNA è aumentato. Alcuni dei i parametri che vengono misurati sono momento tail che è una misura della sia la quantità di DNA e distribuzione del DNA nella lunghezza tail, tail e percentuale di DNA nella coda. Questo test permette di misurare la riparazione del DNA e da risoluzione del danno al DNA significa riparazione ha avuto luogo. Il limite di sensibilità è di circa 50 rotture di filamenti per 1,2 cellula diploide mammiferi. Cellule trattati con un qualsiasi agenti DNA dannosi come etoposide, possono essere utilizzato come controllo positivo. Così il test della cometa è una procedura rapida ed efficace per misurare la danno al DNA.
Protocol
1. Colture Cellulari
- Cellule Cultura neuronali e trattarli come necessario.
- Cellule Harvest in provette da 15 ml: i media aspirato, sciacquare con tampone fosfato salino (PBS, calcio e magnesio libero), aggiungere tripsina, raccogliere in provette da 15 ml e neutralizzare tripsina con appropriati mezzi di siero contenenti.
- Centrifugare a 1.000 xg per 5 min.
- Aspirare media.
- Risospendere le cellule in PBS.
- Centrifugare a 1.000 xg per 5 min.
- Aspirare media e Risospendere le cellule in PBS fresco.
- Contare le celle utilizzando un emocitometro o il vostro contatore di cellule preferito.
- Campioni cellulari dovrebbe essere preparata immediatamente prima di iniziare il test.
- Tutti i campioni devono essere trattati alla luce scura o gialla per evitare danni del DNA dalla luce ultravioletta.
2. Comet Assay
1. Preparazione del vetrino
- Sciogliere 1% agarosio (1 g / 100 ml in 1X Tris base, acido borico, EDTA, TBE) in un microonde per 3 min finché tutti granuli scompaiono.
- Immergere i vetrini nella agarosio fuso e pulire un lato pulire con un Kimwipe. Permettono l'agarosio al aria-secco ad un film trasparente. Questo può essere fatto in anticipo e vetrini possono essere conservati.
2. Comet Assay Neutral
- Freddo soluzione di lisi (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% sarcosinato di sodio lauril, e 1% Triton X-100, pH 10) a 4 ° C per almeno 1 ora prima dell'uso.
- 2.2.2. Fondere 1% basso punto di fusione agarosio (1 g / 100 ml in 1X Tris Base, acido borico, EDTA) in un forno a microonde per 3 min finché tutti i granuli scompaiono. L'agarosio bisogno di essere raffreddato a 37 ° C in un bagno acqua per evitare induzione artificiale di tail cometa. Idealmente, l'agarosio bisogno di essere raffreddato per mezz'ora prima dell'uso.
- 2.2.3. Diluire la sospensione cellulare in modo che vi sono 100.000 cellule per ml. Combinare la sospensione cellulare con il punto di agarosio a bassa fusione (a 37 ° C) aun rapporto di 01:10 (v / v), brevemente vortice, e subito pipettare 50 pl nella diapositiva Comet. Utilizzare il lato della punta della pipetta per diffondere la sospensione cellulare uniformemente sulla superficie del campione. Ogni gruppo di trattamento deve essere almeno in triplicato.
- Posto scorre appartamento in frigorifero per 30 minuti fino a un cerchio appare nella periferia della slitta.
- Prechill la soluzione di lisi e Immergere vetrini in questa soluzione per 30 minuti al buio a 4 ° C (o in frigorifero).
- Versare o aspirare la soluzione di lisi e aggiungere 1X tampone neutro elettroforesi (Tris base, acido borico, EDTA, 1X TBE). Lasciare vetrini in questo buffer per una mezz'ora in frigorifero.
- Aggiungi prechilled tampone di 1X per elettroforesi Neutral (TBE) nella camera elettroforesi, porre i vetrini in vassoio di elettroforesi diapositiva. Allineare diapositive in modo che siano equidistanti da elettrodi.
- Versare 1X elettroforesi neutro buffer fino a 0,2 cm sopra le diapositive. Tampone in eccesso potrebbe, traFere con elettroforesi.
- Impostare la tensione di alimentazione 1 V per cm (misurata elettrodo per elettrodo) e correre per 30 min a 4 ° C (o cella) al buio.
3. Comet Assay alcalino
- Freddo soluzione di lisi (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% sarcosinato di sodio lauril, e 1% Triton X-100, pH 10) a 4 ° C per almeno 1 ora prima dell'uso.
- Fondere 1% basso punto di fusione agarosio (1 g / 100 ml in 1X Tris Base, acido borico, EDTA) in un forno a microonde per 3 min finché tutti i granuli scompaiono. Poi raffreddare in un bagno di acqua 37 ° C per almeno 30 min.
- Combinare celle a 1 x 105 / ml con fuso punto agarosio low melting (a 37 ° C) ad un rapporto di 01:10 (v / v), brevemente vortice, e subito pipettare 50 pl nella diapositiva Comet. Utilizzare il lato della punta della pipetta per diffondere la sospensione cellulare uniformemente sulla superficie del campione. Ogni gruppo di trattamento deve essere almeno in triplicato.
- Luogo scivolòes appartamento in frigorifero per 30 minuti fino a un cerchio appare nella periferia della slitta.
- Immergere i vetrini in una soluzione di lisi prechilled e lasciare a 4 ° C per 1 ora per una notte al buio.
- Rimuovere i vetrini dalla soluzione di lisi, drenare i vetrini e sciacquarli una volta con tampone di neutralizzazione fredda per 5 minuti per rimuovere detersivo residuo e sali prima alcali-svolgitore passo.
- I vetrini in una camera riempita con elettroforesi su gel elettroforesi prechilled tampone appena fatto (300 mM NaOH, 1 mM EDTA,> 13 pH) non superiore a 0,5 cm sopra le diapositive. Allineare diapositive in modo che siano equidistanti da elettrodi.
- Lasciate diapositive sedersi in tampone alcalino per 30 minuti al buio per consentire lo svolgimento del DNA e l'espressione di alcali-responsabili danni.
- Impostare la tensione di alimentazione 1 V per cm (misurata elettrodo per elettrodo) e correre per 30 min a 4 ° C (o cella).
4. Di fissaggio e StaCellule ra zione
- Scolare il tampone in eccesso elettroforesi
- Immergere i vetrini in pre-refrigerata acqua distillata per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Immergere i vetrini in pre-refrigerati etanolo al 70% per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Campioni a secco durante la notte. Non esporre i vetrini ad una luce forte. I campioni possono essere conservati per mesi a temperatura ambiente prima di segnare in questa fase.
- Colorare i vetrini immergendoli in SYBR Green (1X diluito in PBS) per 20 minuti in frigorifero.
- Estrarre i vetrini e permettere loro di asciugare completamente al buio. L'agarosio diventerà trasparente quando è completamente asciutto.
4. Acquisizione di immagini e analisi
- Acquisire immagini con microscopio a fluorescenza impostato il filtro verde (Zeiss AxioVision) e analizzare con il software Comet Assay (Strumenti percettive).
- Clicca sulla "testa cometa" (il nucleo) e il software calcola i parametri compreso il momento coda media e la quantità di DNA nelnucleo.
- Analizzare almeno 200 cellule per il trattamento.
- Esportare i dati in Microsoft Excel.
- Calcola media momento coda per ogni gruppo di trattamento e dati del diagramma a seconda dei casi.
5. Risultati rappresentativi
Un esempio di analisi Comet assay sul neuronali è mostrato in Figura 2 e Figura 3. In questo caso, l'irradiazione delle cellule neuronali induce danno al DNA. Come le cellule vengono sottoposto al campo elettrico, l'DNA migra a tassi differenti a causa di differenze di dimensioni che viene successivamente analizzati utilizzando il software Assay Comet. Più il danno al DNA, più lontano il DNA migra dal nucleo. Questo diminuisce l'intensità fluorescente nel nucleo che viene successivamente raccolto dal software e risultati in momento coda superiore. Tabella 1 illustra una tabella rappresentante analisi cometa dosaggio e la Figura 4 mostra un rappresentantegraph sentante confrontando danno del DNA in cellule neuronali seguendo radiazione misurata dal test della cometa.
Figura 1. Diagramma di flusso del test della cometa. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Immagini rappresentative di cellule neuronali (A) senza e (B) con la coda della cometa.
Figura 3. Comet l'analisi prova svolta utilizzando Assay il software Comet. (A) colpi di rappresentativi dello schermo di immagine acquisita utilizzando Carl microscopio a fluorescenza Zeiss e analizzati utilizzando CometAssay software. (B) Cliccando sul nucleo o la "testa cometa" (cerchiato in verde) genera una mappa fluorescente e grafico (cerchiato in giallo) e una (C) tabella di dati (cerchiato in rosso). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. Grafico rappresentativa ottenuta riportando il momento medio di coda ottenuto analizzando danno al DNA in cellule neuronali irradiati e non irradiati mediante saggio neutro cometa. Come previsto, le radiazioni 3GY (x-ray) induce danno del DNA come illustrato dal momento media superiore coda nelle cellule irradiate neuronali. Mostrato è il momento coda media (+ / - errore standard), ** P <0.01.
Tabella 1. Clicca qui per vedere più grande figura .
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Discussion
Il test della cometa ha la capacità unica di analizzare cellule singole. Ciò è vantaggioso in identificazione di sottopopolazioni di cellule che dimostrano risposta differenziale ad agenti citotossici. Alcune limitazioni pratiche devono essere presi in considerazione. Il numero di celle che possono essere valutati singolarmente possono variare a seconda dell'individuo. La dimensione del campione deve essere aumentato se vi sono variazioni nei danni al DNA all'interno di una popolazione. Vitale cella singola sospensione è fondamentale per questa analisi in quanto la presenza predominante di cellule necrotiche o apoptotiche si aggiungerà errore. La procedura di lisi e l'elettroforesi si libera di cellule apoptotiche, frammenti di DNA di piccole dimensioni (inferiori a 50kb), e il DNA mitocondriale. Pertanto, essi non vengono rilevati dal test della cometa 1,3-11.
Come accennato in precedenza, il test della cometa è un modo efficiente di rilevare le interruzioni di singole-e doppie-filamento, incluse alcali-labili siti e DNA-DNA/DNA-protein legami incrociati sulDNA. Qui abbiamo delineato due protocolli distinti: il dosaggio alcalino permette la rilevazione di rotture di filamenti singoli e rotture a doppio filamento, mentre il test della cometa neutro consente solo la rilevazione di rotture a doppio filamento. Enzima-modificato test della cometa può stato applicato per rilevare addotti di DNA ossidativi. Per esempio, il trattamento con Endo III (endonucleasi) e hOGG1 (glicosilasi) rilevare ossidato pirimidine compresi glicole timina e glicole uracile 12,13 e 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoGua) 14,15 rispettivamente. Formamidopyrimidine DNA-glicosilasi (FPG) può essere usato in modo simile. Per questo dosaggio modificato, trattamento con i enzimi precede la fase svolgitura. L'aggiunta di lesione specifici endonucleasi aumenta la sensibilità del test della cometa pure 13.
Qui usiamo momento coda come il descrittore di danni al DNA. Momento coda viene calcolata utilizzando la formula seguente: percentuale di DNA nella coda moltiplicato per il length della coda cometa 1,3-7. La lunghezza della coda cometa (lunghezza tail) è la distanza dal centro del nucleo al il punto più lontano della migrazione del DNA. Lunghezza della testa è il diametro del nucleo. Intensità testa e intensità coda sono le intensità dei pixel medi nella testa e la coda della cometa, rispettivamente. Superficie totale è la superficie complessiva della cometa 1,3-7.
Anche se ci sono altri metodi per misurare il danno al DNA, come γ-H2AX colorazione foci e pulsed-field gel elettroforesi, questi test hanno i loro inconvenienti e 4,6,11,16,17. Per esempio, lo stress replica è spesso un fattore confondente nella misurazione di γ-H2AX livelli 18. Poiché la formazione di γ-H2AX foci dipende dalla assunzione di proteine di riparazione del DNA, la mancata assunzione di proteine di riparazione del DNA e di una struttura della cromatina condensata può comportare erroneamente bassi γ-H2AX livelli foci pure. Allo stesso modo, in campo pulsato gel electrophoresis è molto tempo intenso ed è solo benefico per separazione di molecole di DNA grandi 19,20. Così, il test della cometa è un relativamente facile, efficiente e poco costoso, misura diretta e sensibile di danno e riparazione del DNA 10,11,21.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Premio IMPACT del Dipartimento di Radioterapia Oncologica, University of Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, Cancer Foundation i bambini da combattimento, e la Gabrielle Angelo Foundation (a ESY.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
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