Summary
コメットアッセイは、アルカリに不安定なサイトや海馬ニューロンを含むすべての細胞のDNAにDNA-DNA/DNA-proteinクロスリンクを含むシングルと二重鎖切断を検出する効率的な方法です。この方法は、DNA損傷の量の違いに起因する電界中のDNAの差のマイグレーションを活用しています。
Abstract
多くの薬剤は、DNA修復経路を標的とし、細胞がDNA損傷を作成することによって殺す誘発する。したがって、直接DNA損傷を測定するためのプロセスが広く評価されている。従来の方法は時間がかかり、高価な、リソースを大量に消費され、複製細胞を必要とする。これとは対照的に、コメットアッセイ、単一細胞ゲル電気泳動アッセイは、DNA損傷と修復の高速化、非侵襲的、安価、直接的かつ敏感な尺度である。 DNA損傷だけでなく、DNA修復のすべてのフォームは、この強力な技術を用いて、単一細胞レベルで可視化することができる。
コメットアッセイの基礎となる原理は、DNA損傷がこの組織を混乱させるのに対し、無傷のDNAが高度に秩序化されています。損傷したDNAをアガロースマトリックスに汚水を垂れ流すと、電界にさらされたとき、負に荷電したDNAは正に帯電している陰極に向かって移動する。大きな損傷を受けていないDNA鎖は核から遠くに移行することはできません。 DNA損傷遠く無傷のDNAより旅行小さなDNA断片を作成します。コメットアッセイでは、画像解析ソフト、対策や核外移行したDNAを用いて核内のDNAの全体的な蛍光強度を比較します。移行されたDNAからの蛍光シグナルは、DNA損傷に比例します。長く明るいDNAテールは、増加したDNA損傷を意味します。測定されるパラメータの一部は、尾部のDNA量と尾、尾の長さのDNAの分布とDNAのパーセンテージの両方の尺度であるテールモーメントです。このアッセイは、DNA損傷の解像度は修理が行われたことを表しますので、同様にDNA修復を測定することができます。感度の限界は、二倍体の哺乳類細胞1,2あたり約50鎖の切断である。例えば、エトポシドなどの任意のDNA損傷剤で処理した細胞を、ポジティブコントロールとして使用することができる。したがって、コメットアッセイ、DNA損傷を測定するための迅速かつ効果的な手順です。
Protocol
1。細胞培養
- 培養神経細胞および必要に応じてそれらを扱う。
- 15 mlチューブに細胞を回収します：吸引メディアは、リン酸でリンス液（PBS、カルシウム及びマグネシウムを含まない）緩衝生理食塩水、15 mlチューブに収集し、適切な血清含有培地にトリプシンを中和し、トリプシンを追加します。
- 5分間、1,000×gで遠心する。
- メディアを吸引します。
- PBSに細胞を再懸濁する。
- 5分間、1,000×gで遠心する。
- 新鮮なPBSでメディアを再懸濁した細胞を吸引します。
- 血球計算盤またはお好みのセルカウンターを用いて細胞をカウントする。
- 細胞サンプルは、アッセイを開始する前に、すぐに準備する必要があります。
- すべてのサンプルは、紫外線からのDNA損傷を防止するために暗いまたは黄色の光で処理する必要があります。
2。コメット解析
1。スライドの準備
- 1％アガロースを（1Xトリス塩基、ホウ酸、EDTA、TBで1グラム/ 100ミリリットル溶かすE）の3分間電子レンジですべての顆粒が消えるまで。
- 溶融アガロースにスライドを浸し、キムワイプできれいな側を拭いてください。透明フィルムに空気乾燥にアガロースを許可します。これは、事前に行うことができ、スライドを保存することができます。
2。中性コメットアッセイ
- 使用前に少なくとも1時間、4°Cで一チル溶解液（2.5MのNaCl、100mMのEDTA pHが10、10mMトリスベース、1％ラウリルサルコシン、および1％Triton X-100、pHは10）。
- 2.2.2。すべての顆粒が消えるまで3分間電子レンジで1％低融点アガロース（1Xトリスベースで1グラム/ 100ミリリットル、ホウ酸、EDTA）を溶かす。アガロースは、彗星の尾の人工的な誘導を避けるために、℃の水浴で37に冷却する必要があります。理想的には、アガロースは、使用前に半時間のために冷却する必要がある。
- 2.2.3。 ml当たり100,000個の細胞があるように細胞懸濁液を希釈します。低融点アガロース（37℃）で一緒に細胞懸濁液を組み合わせる直ちに1:10（v / v）で、渦簡潔に、との比率は、コメットスライド上に50μlを移します。サンプルエリアに均等に細胞懸濁液を広めるために、ピペットチップのサイドを使用しています。各治療群は、少なくとも三連でなければなりません。
- 円はスライドの周囲に表示されるまで、場所は、30分間冷蔵庫でフラットスライドします。
- Prechill 4℃、暗所で30分間この溶液中の溶解液と水没スライド℃（または冷蔵庫で）。
- 捨てや溶解液を吸引し、1Xニュートラル電気泳動バッファー（トリス塩基、ホウ酸、EDTA、1×TBE）を追加します。冷蔵庫で半時間のために、このバッファにスライドしたままにします。
- 電気泳動槽内の予冷1Xニュートラル電気泳動バッファー（TBE）、電気泳動スライドトレイ内のプレーススライドを追加します。彼らは、電極から等距離にあるように、スライドの位置を合わせます。
- スライド上0.2インチに1Xニュートラル電気泳動バッファーを注ぐ。過剰なバッファはインター意志電気泳動でFERE。
- cmあたり1 V（電極に電極を測定）に電源電圧を設定し、暗所で4℃（または寒い部屋）で30分間実行します。
3。アルカリコメットアッセイ
- 使用前に少なくとも1時間、4°Cで一チル溶解液（2.5MのNaCl、100mMのEDTA pHが10、10mMトリスベース、1％ラウリルサルコシン、および1％Triton X-100、pHは10）。
- すべての顆粒が消えるまで3分間電子レンジで1％低融点アガロース（1Xトリスベースで1グラム/ 100ミリリットル、ホウ酸、EDTA）を溶かす。その後、少なくとも30分間37℃の水浴中で冷却する。
- コメットスライド上1:10（v / v）で、渦簡単に、すぐにピペットを50μlの割合で溶融した低融点アガロース（37℃）で1×105個/ mlの細胞を組み合わせています。サンプルエリアに均等に細胞懸濁液を広めるために、ピペットチップのサイドを使用しています。各治療群は、少なくとも三連でなければなりません。
- 場所は、スライドESフラットは、30分間冷蔵庫で円はスライドの周囲に表示されるまで。
- 予冷した溶解液中で、4℃のまま℃に暗闇の中で一晩に1時間浸しスライド。
- 溶解液からスライドを外し、スライドを排出し、アルカリ巻き戻しステップの前に残留洗剤と塩を除去するために5分間冷中和バッファーで1回すすいでください。
- スライドよりも0.5センチメートルを超えないように予冷した作りたての電気泳動バッファー（300 mMのNaOHを、1mMのEDTA、pH値> 13）を充填したゲル電気泳動槽に入れ、スライド。彼らは、電極から等距離にあるように、スライドの位置を合わせます。
- スライドはDNAやアルカリ責任損傷の発現の巻き戻しを可能にするために暗所で30分間アルカリ性緩衝液中で座ってみましょう。
- cmあたり1 V（電極に電極を測定）に電源電圧を設定して、4℃で30分間実行℃（または寒い部屋）。
4。固定と駅iningセル
- 過剰な電気泳動バッファをドレイン
- 室温で5分間予備冷却スライドを蒸留水で浸す。
- 室温で5分間予備冷却70％エタノールに浸しスライド。
- 一晩乾燥したサンプル。明るい光にスライドを公開しないでください。サンプルはこの段階で得点する前に室温で数ヶ月のために保存することができる。
- 冷蔵庫で20分間のSYBR Green（PBSで希釈1X）に浸漬することにより、スライドを染色する。
- スライドを削除し、それらは、暗闇の中で完全に乾燥させます。ときに完全に乾いたアガロースは透明になります。
4。画像の収集と解析
- 緑色フィルタに設定された蛍光顕微鏡（Zeiss AxioVisionの）を使って画像を取得し、コメットアッセイソフトウェア（パーセプティブInstruments）を用いて分析する。
- "彗星の頭部"（核）をクリックすると、ソフトウェアは、平均テールモーメントおよびDNAの量などのパラメータを計算核。
- 治療ごとに少なくとも200個の細胞を分析します。
- Microsoft Excelにデータをエクスポートします。
- 各治療群及び必要に応じてプロットデータのテールモーメントの平均を計算。
5。代表的な結果
神経細胞上のコメットアッセイ分析の一例を図2及び図3に示します。このケースでは、神経細胞の照射はDNA損傷を誘導する。細胞が電界にさらされるように、DNAは、その後コメットアッセイソフトウェアを使用して分析されている大きさの違いにより、異なるレートで移行されます。より多くのDNA損傷は、遠いDNAが核の外に移行されます。これは、その後高いテールモーメントのソフトウェアおよび結果によってピックアップされ、核内蛍光強度が低下します。 表1は、図4 represenコメットアッセイ分析や図から代表的なテーブルを示すtativeグラフは、コメットアッセイによって測定された放射線に続く神経細胞におけるDNA損傷を比較する。
図1。コメットアッセイのフローチャート。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2：神経細胞の代表的なイメージ（）なしと（B）の彗星の尾を持つ。
コメットアッセイソフトウェアを使用して、 図3コメットアッセイ分析。 （A）画像の代表的なスクリーンショットでは、カールツァイス蛍光顕微鏡を用いて取得し、Cometを使用して分析アッセイソフトウェア。 （B）は、核または"彗星の頭部"（緑の円内）をクリックすると、蛍光灯、地図とグラフ（黄色の丸で囲んだ）と（C）データテーブル（赤丸部分）を生成します。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4中性コメットアッセイを用いて、照射と非照射神経細胞におけるDNA損傷を解析して得られた平均テイルモーメントをプロットして得られた代表的なグラフ。予想されるように照射された神経細胞においてより高い平均のテールモーメントによって示されるように、3Gyの放射線（X線）は、DNA損傷を誘導する。 、** P <0.01 - 平均テールモーメントは（標準誤差+ / - ）も示されている。
表1。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
コメットアッセイは、個々の細胞を分析するユニークな能力を持っています。これは、細胞毒性薬に反応差を実証する細胞の亜集団の同定に有利である。いくつかの実用的な制限は考慮に入れなければならない。個別に評価することができる細胞の数は、個々によって異なります。集団内のDNA損傷のばらつきがある場合にはサンプルサイズを増やす必要があります。壊死またはアポトーシス細胞の優勢な存在がエラーに加わるので、実行可能な単一細胞懸濁液は、このアッセイのために重要である。溶解し、電気泳動のステップは、アポトーシス細胞、小さなDNA断片（50キロバイトより小さい）と、ミトコンドリアDNAを取り除きます。したがって、それらはコメットアッセイ1,3-11では検出されません。
前述したように、コメットアッセイではアルカリに不安定なサイトやDNA-DNA/DNA-proteinクロスリンクを含むシングルと二重鎖切断を検出するための効率的な方法であるDNA。中性コメットアッセイは、二本鎖切断の検出のみを許可する一方、アルカリ性アッセイは単鎖切断だけでなく、二本鎖切断の検出を可能にする：ここでは、2つの異なるプロトコルを概説しました。酵素修飾されたコメットアッセイは、酸化的DNA付加体を検出するために適用されてすることができます。例えば、遠藤Ⅲ（エンドヌクレアーゼ）とhOGG1（グリコシラーゼ）による治療は、チミングリコールおよびウラシルグリコール12,13と8 -オキソ-7,8 - dihydroguanine（8 oxoGua）はそれぞれ14,15含む酸化ピリミジンを認識しています。 Formamidopyrimidine DNA-グリコシラーゼ（FPG）も同様に使用することができます。この修正されたアッセイのために、酵素を用いた治療は、巻き戻しのステップの前にあります。病変特異的エンドヌクレアーゼの添加は、コメットアッセイならびに13の感度を向上させます。
ここでは、DNA損傷の記述子としてテールモーメントを使用しています。テールモーメントは次の式で計算されます尾のDNAの割合は、lenを乗じ彗星の尾1,3-7のGTH。彗星の尾（テール長）の長さはDNAの移動の最遠点に核の中心からの距離である。頭長は、核の直径である。ヘッド強度とテールの強度はそれぞれ、彗星の頭部と尾部の平均ピクセル強度である。総面積は彗星1,3-7全体の表面積である。
例えば、γ-H2AX病巣染色およびパルスフィールド·ゲル電気泳動などのDNA損傷を測定する他の方法があるが、これらのアッセイは、同様4,6,11,16,17それらの欠点を持っています。たとえば、複製ストレスは、しばしば、γ-H2AXのレベル18の測定において交絡因子である。 γ-H2AXフォーカスの形成は、DNA修復タンパク質の動員に依存しているので、DNA修復タンパク質と凝縮したクロマチン構造を採用する故障も偽って低γ-H2AX病巣レベルにつながる可能性があります。同様に、パルスフィールド·ゲルelectrophoresisは非常に時間集約的であり、大きなDNA分子19,20の分離のためにのみ有益です。したがって、コメットアッセイ、DNA損傷と修復10,11,21の比較的簡単で効率的、かつ安価な、直接的かつ敏感な尺度である。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、放射線腫瘍学、アラバマバーミンガム大学総合がんセンター、ファイティングがんの子供を守る財団、ガブリエルのエンジェル財団（ESYへ。）の部門からインパクト賞によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
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