Summary
혜성 분석은 알칼리 불안정한 사이트와 hippocampal 뉴런을 포함한 모든 세포의 DNA에 DNA-DNA/DNA-protein 상호 링크 등 단일 및 이중 가닥 휴식을 검출 효율적인 방법입니다. 방법은 DNA 손상의 양의 차이로 인해 전기 분야에서 DNA의 차동 마이그레이션을 활용합니다.
Abstract
약물의 수는 DNA 복구 경로를 타겟으로하고 세포가 DNA 손상을 만들어 죽 유도. 따라서, 직접 DNA 손상을 측정하기위한 프로세스를 광범위하게 평가되었습니다. 전통적인 방법은 시간이 소요, 비용, 리소스를 집중하고 세포가 복제를 필요로합니다. 반면, 혜성 분석, 단일 세포 겔 전기 영동 분석은 DNA 손상 및 수리를 빠르고 비 침습적, 저렴한, 직접 민감한 측정하기위한 한 방법입니다. DNA 손상뿐만 아니라 DNA 수리의 모든 양식이 강력한 기술을 사용하여 단일 세포 수준에서 시각화 할 수 있습니다.
혜성 분석의 기초 원리는 DNA 손상이 조직을 방해 반면에 그대로 DNA가 높은 주문이다. 손상된 DNA의 아가로 오스 매트릭스에 새어 나온 및 전기 분야의 대상이 때, 부정적인 청구 DNA가 긍정적으로 청구됩니다 음극으로 마이그레이션합니다. 큰 피해 DNA의 가닥 훨씬 핵에서 마이그레이션 할 수 없습니다. DNA 손상더 손상 DNA보다 여행 작은 DNA 조각을 만듭니다. 혜성 분석, 이미지 분석 소프트웨어, 조치하고 핵에서 마이그레이션 DNA와 핵에서 DNA의 전체 형광 강도를 비교합니다. 마이그레이션 DNA의 형광 신호가 DNA 손상에 비례합니다. 긴 밝은 DNA 꼬리 증가 DNA 손상을 의미합니다. 측정 매개 변수 중 일부는 꼬리에있는 DNA의 금액과 꼬리, 꼬리 길이 DNA의 유통 및 DNA의 비율 모두의 척도입니다 꼬리 순간입니다. 이 분석은 DNA 손상의 해상도가 복구가 자리를 차지하게 때문에뿐만 아니라 DNA 복구를 측정 할 수 있습니다. 감도의 제한 diploid 포유류의 세포 1,2 당 약 50 스트랜드 나누기입니다. 같은 etoposide와 같은 DNA 손상 대리인과 치료 세포는 긍정적 인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 따라서 혜성 분석은 DNA 손상을 측정 할 수있는 신속하고 효과적인 절차입니다.
Protocol
1. 세포 배양
- 문화 neuronal 세포와이를 필요에 따라 취급합니다.
- 15 ML 튜브에 수확 세포 : 기음 미디어, 인산염과 린스 (PBS, 칼슘, 마그네슘 무료) 생리 버퍼, 15 ML 튜브에 수집하고 적절한 혈청이 포함 된 미디어와 트립신을 중화, 트립신을 추가합니다.
- 5 분 1,000 XG에서 봐.
- 미디어를 대기음.
- PBS에 세포를 Resuspend.
- 5 분 1,000 XG에서 봐.
- 신선한 PBS에서 미디어 및 resuspend 세포를 대기음.
- hemacytometer이나 선호하는 셀 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다.
- 세포 샘플은 분석을 시작하기 바로 전에 준비해야합니다.
- 모든 샘플은 자외선에서 DNA 손상을 방지하기 위해 어둡거나 노란 빛으로 처리해야합니다.
2. 혜성 분석
1. 슬라이드 준비
- 1% 아가로 오스를 (1X 트리스베이스, 붕산, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), TB의 1g / 100 ML 녹음E) 3 분의 전자 레인지의 모든 과립가 사라 때까지.
- 수영 용융 아가로 오스에 슬라이드과 측면을 닦아은 kimwipe으로 청소하십시오. 투명 필름에 공기 건조에 아가로 오스 할 수 있습니다. 이것은 저장할 수 있습니다 사전 및 슬라이드에 수행 할 수 있습니다.
2. 중성 혜성 분석
- 사용하기 전에 적어도 1 시간에 ° C 4에 얼음 용해 용액 (2.5 M NaCl, 100 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 10, 10 MM 트리스베이스, 1 %의 나트륨 라 우릴의 sarcosinate, 그리고 1퍼센트 튼 X-100, 산도 10).
- 2.2.2. 모든 과립이 사라 때까지 전자 레인지에 1% 낮은 녹는 점 아가로 오스는 (1X 트리스 자료의 1g / 100ml, 붕소의 산성, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 3 분 동안 녹음. 아가로 오스는 혜성 꼬리의 인공 유도를 방지하기 위해 ° C 물 목욕에서 37로 냉각해야합니다. 이상적으로, 아가로 오스는 사용하기 전에 반 시간 동안 냉각해야합니다.
- 2.2.3. ML 100,000 세포가되도록 세포 현탁액을 희석. 낮은 녹는 점 아가로 오스 (37시 ° C)에있는 세포 현탁액을 결합1시 10분 (V / V), 와류 짧게의 비율과 즉시 혜성 슬라이드에 50 μl를 피펫. 샘플 영역 골고루 세포 현탁액을 확산하기 위해 피펫 팁의 측면을 사용합니다. 각 치료 그룹은 적어도 세중의에 있어야합니다.
- 원은 슬라이드의 주변에 나타날 때까지 장소 30 분에 냉장고에 평면 슬라이드.
- Prechill 4에 어둠 속에서 30 분이 솔루션에 용해 솔루션과 잠수함 슬라이드 ° C (또는 냉장고에).
- 오프 넣어 또는 용해 솔루션을 기음과 1X 중립적 인 전기 영동 버퍼 (트리스베이스, 붕산, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1X TBE)을 추가합니다. 냉장고에 30 분 동안이 버퍼에 슬라이드를 둡니다.
- 전기 챔버에서 prechilled 1X 중성 전기 영동 버퍼 (TBE), 전기 슬라이드 트레이에 장소 슬라이드를 추가 할 수 있습니다. 사람들이 전극에서 등거리되도록 슬라이드를 맞 춥니 다.
- 1X 중립 전기가 슬라이드 위에 0.2 인치까지 버퍼 네요. 초과 버퍼 간 것전기와 fere.
- cm 당 1 V (전극에 전극을 측정)에 전원 공급 장치의 전압을 설정하고 어둠 속에서 4 ° C (또는 차가운 방)에서 30 분에 실행합니다.
3. 알칼리성 혜성 분석
- 사용하기 전에 적어도 1 시간에 ° C 4에 얼음 용해 용액 (2.5 M NaCl, 100 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 10, 10 MM 트리스베이스, 1 %의 나트륨 라 우릴의 sarcosinate, 그리고 1퍼센트 튼 X-100, 산도 10).
- 모든 과립이 사라 때까지 3 분을 위해 전자 레인지에 1% 낮은 녹는 점 아가로 오스를 (1X 트리스 자료의 1g / 100 ML, 붕소의 산성, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 녹음. 그럼 적어도 30 분에 37 ° C의 물을 욕조에 좋아.
- 1시 10분 (V / V), 와류 잠시의 비율로 용융 낮은 녹는 점 아가로 오스와 1 개 105 / ML (37시 ° C)에서 세포를 결합하고 즉시 혜성 슬라이드에 50 μl를 피펫. 샘플 영역 골고루 세포 현탁액을 확산하기 위해 피펫 팁의 측면을 사용합니다. 각 치료 그룹은 적어도 세중의에 있어야합니다.
- 장소는 미끄러에스 평면은 30 분에 냉장고에있는 원은 슬라이드의 주변에 나타납니다 때까지.
- prechilled 용해 용액과 4에 남겨 ° C를 어둠 속에서 야간에 1 시간에 젖어 슬라이드.
- 용해 용액에서 슬라이드를 제거 슬라이드를 배출하고 알칼리 긴장을 풀기 단계로 사전에 잔류 세제와 소금을 제거하는 5 분을위한 차가운 중화 버퍼로 한 번 씻어.
- 겔 전기 영동 챔버의 장소 슬라이드 슬라이드 위에 0.5 cm를 초과하지 prechilled 갓 만든 전기 영동 버퍼 (300 MM NaOH, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산),> 13 PH)로 가득. 사람들이 전극에서 등거리되도록 슬라이드를 맞 춥니 다.
- 슬라이드가 DNA와 알칼리 - 책임 손상의 표현의 긴장을 풀기을 할 수 있도록 어둠 속에서 30 분 동안 알칼리 버퍼에 앉아 보자.
- cm 당 1 V (전극에 전극을 측정)에 전원 공급 장치의 전압을 설정하고 4시 30 분에 실행 ° C (또는 추운 방).
4. 고정과 역ining 셀
- 초과 전기 버퍼를 배수
- 젖어은 RT에서 5 분을 위해 사전에 차가운 증류수에 슬라이드.
- RT에서 5 분을위한 사전 차가운 70 % 에탄올에 젖어 슬라이드.
- 밤새 드라이 샘플. 밝은 빛에 슬라이드를 노출시키지 마십시오. 샘플은 이전 단계에서 골을 실온에서 몇 달 동안 저장 될 수 있습니다.
- 냉장고에 20 분에 Sybr 녹색 (PBS에 희석 1X)에 immersing하여 슬라이드를 청바지.
- 슬라이드를 제거하고 그 어둠 속으로 완전히 건조 할 수 있습니다. 때 완전히 건조 아가로 오스는 투명이 될 것입니다.
4. 이미지 수집 및 분석
- 녹색 필터 (Zeiss AxioVision)와 혜성 분석 소프트웨어 (지각 악기)를 사용하여 분석으로 설정 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득.
- "혜성의 머리"(핵)를 클릭하고 소프트웨어에서 평균 꼬리 순간 DNA의 양을 포함하여 매개 변수를 계산핵.
- 치료 당 최소한 200 세포를 분석합니다.
- Microsoft Excel로 데이터를 내보낼 수도 있습니다.
- 각 치료 그룹과 적절한 플롯 데이터 꼬리 순간을 의미 계산합니다.
5. 대표 결과
neuronal 세포에 혜성 분석 분석의 예는 그림 2와 그림 3에 표시됩니다. 이 경우 neuronal 세포의 방사선은 DNA 손상을 유도한다. 세포는 전기 분야의 대상이됨에 따라, DNA는 이후 혜성 분석 소프트웨어를 사용하여 분석 크기의 차이로 인해 서로 다른 속도로 마이그레이션합니다. 더 DNA 손상은 멀리 DNA는 핵에서 마이그레이션합니다. 이 이후 높은 꼬리 순간의 소프트웨어와 결과에 의해 포착 된 핵의 형광 강도를 낮 춥니 다. 표 1은 혜성 분석 분석 및 그림 4에서 대표 표를 묘사 represen를 보여줍니다tative 그래프는 혜성 분석에 의해 측정으로 방사선에 따라 neuronal 세포의 DNA 손상을 비교.
그림 1. 혜성 분석의 흐름 차트. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. neuronal 세포의 대표 이미지 (A)없이와 (B) 혜성 꼬리.
혜성 분석 소프트웨어를 사용하여 그림 3. 혜성 분석 분석. (A) 이미지의 대표 스크린 샷은 칼 Zeiss 형광 현미경을 사용하여 획득과 혜성을 사용하여 분석분석 소프트웨어. (B) 핵 또는 "혜성의 머리"(녹색 동그라미)을 클릭하면 형광지도와 그래프 (노란색 동그라미)와 (C) 데이터 테이블을 (빨간색 원)으로 생성합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 중립적 인 혜성 분석을 사용하여 방사능과 비 방사능 neuronal 세포의 DNA 손상을 분석하여 얻은 평균 꼬리 순간을 음모하여 얻은 대표 그래프. 예상대로 방사능 neuronal 세포에서 높은 평균 꼬리의 순간에 의해 묘사로 3Gy 방사선 (x-선)은 DNA 손상을 유도한다. , ** P <0.01 - 평균 꼬리 순간 (표준 오류 + /)입니다 표시됩니다.
표 1. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
혜성 분석은 개별 세포를 분석의 고유 한 능력이 있습니다. 이 세포 독성 요원에게 차등 응답을 보여 세포의 subpopulations의 식별에 유리한 것입니다. 몇 실제적인 제한이 고려되어야한다. 개별적으로 평가 될 수있는 세포의 수는 개인에 따라 다를 수 있습니다. 인구 내에서 DNA 손상에 차이가있을 경우 표본의 크기가 증가해야합니다. 괴사 또는 apoptotic 세포의 주된 존재가 에러가 추가되므로 가능한 단일 셀 정지이 분석에 중요합니다. 용해와 전기 단계는 apoptotic 세포, 작은 DNA 조각 (50킬로바이트보다 작)과 mitochondrial DNA의 제거됩니다. 따라서, 그들은 혜성 분석 1,3-11에 의해 감지되지 않습니다.
위에서 언급 한 바와 같이, 혜성 분석은 알칼리 불안정한 사이트에 DNA-DNA/DNA-protein 상호 링크 등 단일 및 이중 가닥 휴식을 검출 효율적인 방법입니다DNA. 중립 혜성 분석은 두 번 스트랜드 나누기 만 감지 할 수 있습니다 반면, 알칼리 분석은 단일 스트랜드 바꿈뿐만 아니라 두 번 스트랜드 나누기의 검색을 할 수 있습니다 : 여기 우리는 서로 다른 두 프로토콜을 설명하고 있습니다. 효소 - 수정 혜성 분석은 산화 DNA의 알데히드 부가 물을 감지 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, 엔도 III (endonuclease)와 hOGG1 (glycosylase)와 치료 thymine 글리콜과 uracil 글리콜 12,13 각각 8 - 옥소-7 ,8-dihydroguanine (8 oxoGua) 14,15 등의 pyrimidines을 산화 인식합니다. Formamidopyrimidine DNA-glycosylase은 (FPG)와 유사하게 사용할 수 있습니다. 이 수정 검정은 효소 치료는 긴장을 풀기 단계를 앞에. 병변 별 endonucleases의 추가는 혜성 분석뿐만 아니라 13의 감도를 증가시킵니다.
여기 DNA 손상의 설명으로 꼬리 순간을 사용합니다. 꼬리 순간은 다음 공식을 사용하여 계산됩니다 꼬리의 DNA의 비율은 렌을 곱한혜성 꼬리 1,3-7의 gth. 혜성 꼬리 (꼬리 길이)의 길이는 DNA의 마이그레이션 멀리 지점에 핵의 중심에서의 거리에 있습니다. 머리 길이는 핵의 직경입니다. 헤드 강도와 꼬리 강도는 혜성의 머리와 꼬리의 평균 픽셀 농도는 각각 있습니다. 총 면적은 혜성 1,3-7의 전체 표면 영역입니다.
이러한 γ-H2AX foci의 착색 및 펄스 - 필드 겔 전기 영동 등의 DNA 손상을 측정하는 다른 방법이 있습니다하지만, 이러한 assays도 4,6,11,16,17 자신의 단점을 가지고있다. 예를 들어, 복제 스트레스는 종종 γ-H2AX 수준 18 측정에 confounder입니다. γ-H2AX foci 형성은 DNA 수리 단백질의 채용에 따라 달라집니다 때문에, DNA 수리 단백질과 압축 염색질 구조를 모집하지 않을뿐만 아니라 거짓 낮은 γ-H2AX foci 수준으로 이어질 수 있습니다. 마찬가지로, 펄스 - 필드 겔 electrophoresis은 매우 시간이 집중하고 큰 DNA 분자 19,20의 분리에 대해서만 유용합니다. 따라서, 혜성 분석은 DNA 손상 및 수리 10,11,21 비교적 쉽고 효율적이며 저렴, 직접 민감한 측정하기위한 한 방법입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 방사선 종양학, 앨라배마 - 버밍햄 대학 종합 암 센터, 파이팅 어린이 암 재단과 가브리엘의 엔젤 재단 (ESY 있습니다.)의 부에서 IMPACT 상에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
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