Summary
O ensaio cometa é uma forma eficiente de detectar quebras simples e de fita dupla, incluindo álcali-lábeis sites e DNA-DNA/DNA-protein ligações cruzadas no DNA em todas as células, incluindo neurônios do hipocampo. O método tira partido da migração diferencial de DNA num campo eléctrico devido a diferenças na quantidade de danos no DNA.
Abstract
Um certo número de drogas como alvo as vias de reparação do ADN e induzem a morte de células através da criação de danos no DNA. Assim, os processos para medir directamente danos no ADN têm sido extensivamente estudados. Os métodos tradicionais são o tempo de consuming, de recursos,, caro, intensivo e requerem células de replicadoras. Em contraste, o ensaio cometa, uma única célula de ensaio de electroforese em gel, é mais rápido, não invasivo, medida, de baixo custo directo e sensível de danos no DNA e de reparação. Todas as formas de danos no DNA, bem como a reparação do ADN pode ser visualizado no nível de célula única usando esta técnica poderosa.
O princípio subjacente ao doseamento é que cometa DNA intacto é altamente ordenada ao passo que o dano ao DNA interrompe essa organização. Os danificadas escoa de ADN na matriz de agarose e quando sujeito a um campo eléctrico, o DNA carregado negativamente migra em direcção ao cátodo, que está carregado positivamente. As grandes cadeias de DNA não danificadas não são capazes de migrar longe do núcleo. Danos no DNAcria fragmentos menores de DNA que viajam mais longe do que o DNA intacta. Comet Assay, um software de de análise de imagem, as medidas de e compara o global de intensidade de fluorescente de o DNA em o com um núcleo com DNA de que tenha migrado para fora de o núcleo. Sinal fluorescente do DNA migrado é proporcional aos danos de DNA. Tail DNA mais brilhante significa danos no DNA aumentada. Alguns dos parâmetros que são medidos são momento da cauda, que é uma medida de tanto a quantidade de ADN e de distribuição de ADN no comprimento da cauda a cauda, e percentagem de DNA na cauda. Este ensaio permite medir a reparação do ADN, bem desde resolução de danos no DNA significa reparação teve lugar. O limite de sensibilidade é de aproximadamente 50 quebras na cadeia por diplóide 1,2 células de mamíferos. As células tratadas com quaisquer agentes que danificam o ADN, tais como o etoposido, pode ser utilizado como um controlo positivo. Assim, o teste do cometa é um procedimento rápido e eficaz para avaliar os danos do DNA.
Protocol
1. Cultura de Células
- Cultura de células neuronais e tratá-los conforme necessário.
- Células de colheita em tubos de 15 ml: meios de aspiração, lavar com solução salina tamponada com fosfato (PBS, cálcio e magnésio livre), adicionar tripsina, recolher em tubos de 15 ml e neutralizar a tripsina com meio contendo soro apropriadas.
- Centrifugação a 1000 xg durante 5 min.
- Aspirar mídia.
- Ressuspender as células em PBS.
- Centrifugação a 1000 xg durante 5 min.
- Aspirar mídia e Ressuspender as células em PBS fresco.
- Contar as células usando um hemocitômetro ou seu contador de células preferido.
- Amostras de células deve ser preparado imediatamente antes de iniciar o ensaio.
- Todas as amostras devem ser tratadas à luz escura ou amarelo para impedir o dano ao DNA da luz ultravioleta.
2. Ensaio Cometa
1. Preparação de slides
- Melt agarose a 1% (1 g / 100 ml em 1X Tris Base, ácido bórico, EDTA, TBE) em um forno de microondas durante 3 minutos até que todos os grânulos desaparecer.
- Dip slides em a agarose fundido e limpe um lado limpar com um Kimwipe. Permitir que a agarose de ar seco a uma película transparente. Isto pode ser feito com antecedência e as lâminas podem ser armazenadas.
2. Ensaio do Cometa Neutral
- Solução frio de lise (2,5 M de NaCl, 100 mM de EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% de sódio sarcosinato de laurilo e Triton 1% X-100, pH 10) a 4 ° C durante pelo menos 1 hora antes da utilização.
- 2.2.2. Derreta 1% baixo de derretimento ponto de de agarose a (1 g / 100ml em 1X Tris Base de Dados de, o ácido Boric, EDTA), em um forno de microondas para 3 min até que todos os grânulos de desaparecer. A agarose tem de ser arrefecida a 37 ° C num banho de água para evitar a indução artificial da cauda do cometa. Idealmente, a agarose precisa de ser arrefecida durante meia hora, antes da utilização.
- 2.2.3. Diluiu-se a suspensão de células, de modo que há 100.000 células por ml. Combina-se o suspensão de células de com o baixo de derretimento ponto de de agarose a (at 37 ° C) menosuma proporção de 1:10 (v / v), de forma breve vórtice e, imediatamente pipetar 50 uL para a corrediça Comet. Usar o lado da ponta da pipeta para espalhar a suspensão de células de maneira uniforme sobre a área da amostra. Cada grupo de tratamento deve ser pelo menos em triplicado.
- Lugar desliza para plana em geladeira por 30 min até que uma círculo aparece em a periferia de o slide.
- Prechill a solução de de lise e slides de submergiria em esta solução de para 30 min no escuro e à 4 ° C (ou em um refrigerador).
- Decantar ou aspirar a solução para lise e adicionar 1X tampão de electroforese de ponto morto (base Tris, ácido bórico, EDTA 1X TBE). Deixe lâminas neste tampão por meia hora na geladeira.
- Adicionar tampão Eletroforese previamente arrefecido 1X Neutro (TBE) em câmara de eletroforese, slides Colocar na bandeja deslizante eletroforese. Alinhe os slides para que eles sejam equidistantes eletrodos.
- Despeje 1X eletroforese neutro tampão até 0,2 centímetros acima slides. Tampão em excesso será entreFere com eletroforese.
- Definir a tensão de alimentação de 1 V por cm (medida de eléctrodo para eléctrodo) e funcionou durante 30 minutos a 4 ° C (ou o quarto frio), no escuro.
3. Ensaio Cometa alcalino
- Solução frio de lise (2,5 M de NaCl, 100 mM de EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% de sódio sarcosinato de laurilo e Triton 1% X-100, pH 10) a 4 ° C durante pelo menos 1 hora antes da utilização.
- Melt 1% baixo ponto de fusão de agarose (1 g / 100 ml em 1X Tris Base, ácido bórico, EDTA) em um forno de microondas durante 3 minutos até que todos os grânulos desaparecer. Em seguida, arrefeceu-se num 37 banho de água ° C durante pelo menos 30 min.
- Combinar as células a 1 x 105 ml / com fundido baixo ponto de fusão de agarose (a 37 ° C) numa razão de 1:10 (v / v), de forma breve vórtice e, imediatamente pipetar 50 uL para a corrediça Comet. Usar o lado da ponta da pipeta para espalhar a suspensão de células de maneira uniforme sobre a área da amostra. Cada grupo de tratamento deve ser pelo menos em triplicado.
- Lugar deslizoues plana em geladeira por 30 min até que uma círculo aparece em a periferia de o slide.
- Imergir as lâminas em solução de lise previamente arrefecido e deixar a 4 ° C durante 1 hora a durante a noite no escuro.
- Remover as lâminas a partir da solução de lise, drenar as lâminas e lavar uma vez com tampão de neutralização fria durante 5 minutos para remover o detergente residual e sais antes do passo de álcali desenrolamento.
- Colocar as lâminas numa câmara de electroforese em gel cheia com tampão de electroforese previamente arrefecido feita recentemente (300 mM de NaOH, 1 mM EDTA, pH> 13) não superior a 0,5 cm acima slides. Alinhe os slides para que eles sejam equidistantes eletrodos.
- Deixe lâminas sentar no tampão alcalino durante 30 min no escuro para permitir desenrolamento do DNA e a expressão de álcali susceptível de dano.
- Definir a tensão de alimentação de 1 V por cm (medida de eléctrodo para eléctrodo) e funcionou durante 30 minutos a 4 ° C (ou na sala de frio).
4. Fixação e StaCélulas Ining
- Escorra Tampão Eletroforese excesso
- Imergir desliza em pré-refrigerada a água destilada durante 5 min à TA.
- Imergir as lâminas em pré-arrefecida de etanol a 70% durante 5 min à TA.
- As amostras secas durante a noite. Não exponha slides para luz brilhante. As amostras podem ser armazenadas durante meses à temperatura ambiente antes de marcar nesta fase.
- Corar as lâminas por imersão em SYBR Green (1X diluído em PBS) durante 20 minutos no frigorífico.
- Retirar as lâminas e permitir que-los o secar completamente,, no escuro. A agarose vai se tornar transparente quando está completamente seca.
4. Aquisição e Análise de Imagem
- Adquirir imagens usando microscópio de fluorescência definida para o filtro verde (Zeiss AxioVision) e analisar usando Comet software Ensaio (Instrumentos perceptivos).
- Clique no botão "cabeça cometa" (do núcleo) e o software calcula os parâmetros, incluindo o momento da cauda médio e quantidade de DNA nonúcleo.
- Analisar, pelo menos, 200 células por tratamento.
- Exportar dados para o Microsoft Excel.
- Calcular significar momento da cauda para cada grupo de tratamento e dados de plotagem como apropriado.
5. Resultados representativos
Um exemplo de análise cometa ensaio em células neuronais é mostrado na Figura 2 e Figura 3. Neste caso, a irradiação das células neuronais induz danos no ADN. À medida que as células são submetidas ao campo eléctrico, o DNA migra a taxas diferentes, devido às diferenças no tamanho, que é subsequentemente analisados utilizando o software Assay Comet. Quanto mais os danos no DNA, o mais distante do DNA migra para fora do núcleo. Este diminui a intensidade de fluorescente em o núcleo a qual é subsequentemente escolhido acima por o software e os resultados da em momento mais elevado cauda. A Tabela 1 retrata uma tabela de representante a partir de análise de cometa ensaio de e A Figura 4 mostra um repretativo gráfico comparando danos ao DNA em células neuronais após radiação medida pelo ensaio cometa.
Figura 1. Gráfico Fluxo de de o ensaio de cometa. Clique aqui para ver figura maior .
Figura 2. Imagens representativas de células neuronais (A), sem e (B) com a cauda do cometa.
Figura 3. Análise ensaio do cometa usando um software de Ensaio Cometa. (A) tiros Representante de tela de imagem adquirida usando Carl microscópio Zeiss fluorescente e analisados utilizando CometSoftware de Ensaio. (B) Clicando sobre o núcleo ou a "cabeça cometa" (circulado em verde) gera um mapa fluorescente e gráfico (circulado em amarelo) e (C) tabela de dados (circulado em vermelho). Clique aqui para ver maior figura .
Figura 4. Gráfico representativas obtidas através da representação gráfica do momento da cauda médio obtido por análise de danos ao DNA em irradiados e não irradiados células neuronais utilizando o ensaio cometa neutro. Como esperado, a radiação 3Gy (x-ray) induz danos no ADN, como representado pela maior momento médio cauda nas células irradiadas neuronais. Mostrado é o momento da cauda média (+ / - erro padrão), ** P <0,01.
Tabela 1. Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
O teste do cometa tem a capacidade única de analisar células individuais. Isto é vantajoso na identificação de subpopulações de células que demonstram respostas diferenciais aos agentes citotóxicos. Algumas limitações práticas têm de ser tidas em conta. O número de células que podem ser avaliadas individualmente podem variar, dependendo do indivíduo. O tamanho da amostra tem de ser aumentada, se há uma variedade de lesões do ADN dentro de uma população. Suspensão de uma única célula viável é crítica para este ensaio uma vez que a presença predominante de células necróticas ou apoptótico irá adicionar ao erro. Os passos de lise e eletroforese se livrar de células em apoptose, fragmentos pequenos (menores que 50kb), e de DNA mitocondrial. Assim, eles não são detectadas pelo ensaio cometa 1,3-11.
Como mencionado acima, o ensaio cometa é uma forma eficiente de detectar rupturas simples e de cadeia dupla, incluindo álcali lábeis sítios e DNA-DNA/DNA-protein ligações cruzadas sobre oDNA. Aqui nós descrevemos dois protocolos distintos: o ensaio alcalino permite a detecção de quebras na cadeia simples, bem como quebras de cadeia dupla, enquanto que o ensaio cometa neutro permite apenas a detecção de rupturas de filamentos duplos. Enzima modificada ensaio cometa pode foram aplicadas para detectar os aductos oxidativas. Por exemplo, o tratamento com Endo III (endonuclease) e hOGG1 (glicosilase) reconhecem oxidado pirimidinas incluindo glicol timina e uracilo 12,13 glicol e 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoGua) 14,15, respectivamente. Formamidopyrimidine ADN-glicosilase (FPG) pode ser utilizado de forma semelhante. Para este ensaio modificado, o tratamento com as enzimas precede o passo de desenrolamento. A adição de lesão específicos endonucleases aumenta a sensibilidade do ensaio de cometa e 13.
Aqui usamos momento da cauda como o descritor de danos no DNA. Momento da cauda é calculado usando a seguinte fórmula: Percentagem de DNA na cauda multiplicado pelo length da cauda de cometa 1,3-7. O comprimento da cauda do cometa (comprimento da cauda) é a distância entre o centro do núcleo para o ponto mais distante da migração do DNA. Comprimento da cabeça é o diâmetro do núcleo. Intensidade de cabeça e intensidade da cauda são as intensidades de pixels médios na cabeça e cauda do cometa, respectivamente. A área total é a área da superfície total do cometa 1,3-7.
Embora existam outros métodos de medição de danos no ADN, tais como γ-H2AX coloração de focos e de campo pulsado de electroforese em gel, estes ensaios têm os seus inconvenientes, bem 4,6,11,16,17. Por exemplo, o stress de replicação é geralmente um confundidor na medição dos níveis de γ-H2AX 18. Uma vez que a formação de focos H2AX-γ é dependente de recrutamento de proteínas de reparação do ADN, a incapacidade de recrutar proteínas de reparação de ADN e uma estrutura de cromatina condensada possa levar a resultados falsamente baixos níveis de γ-H2AX focos bem. Da mesma forma, gel de campo pulsado electrophoresis é muito intensivo em tempo e só é benéfico para a separação de moléculas de ADN grandes 19,20. Assim, o ensaio cometa é relativamente fácil, eficiente e barato medida, directa e sensível de danos no DNA e reparação 10,11,21.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Prêmio IMPACTO do Departamento de Radiação Oncológica da Universidade de Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, da Fundação da Criança de combate o câncer, ea Gabrielle Anjo (Fundação para ESY.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
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