Summary
Комет является эффективным способом выявления одно-и двунитевых разрывов, в том числе щелочно-лабильных сайтов и DNA-DNA/DNA-protein поперечных связей в ДНК во всех клетках, включая нейроны гиппокампа. Метод использует дифференциальные миграции ДНК в электрическом поле из-за различий в количестве повреждения ДНК.
Abstract
Ряд препаратов нацелены на пути репарации ДНК и вызывают гибели клеток путем создания повреждения ДНК. Таким образом, процессы непосредственно измерить повреждения ДНК были тщательно оценены. Традиционные методы занимают много времени, дорого, ресурсоемкие и требуют репликации клеток. В отличие от комет, одна ячейка гель-электрофореза анализа, более быстрый, неинвазивный, недорогой, прямые и чувствительным показателем повреждения и репарации ДНК. Все формы повреждения ДНК, а также репарации ДНК могут быть визуализированы на одном уровне ячейки с помощью этой мощной техникой.
Принцип, лежащий в основе комет является то, что нетронутыми ДНК высоко упорядоченной, тогда как повреждение ДНК, нарушает эту организацию. Поврежденной ДНК проникает в агарозном матрицы и при воздействии электрического поля, отрицательно заряженная ДНК мигрирует к катоду, который заряжен положительно. Большая неповрежденной нити ДНК не способны мигрировать далеко от ядра. Повреждение ДНКсоздает меньшие фрагменты ДНК, которые едут дальше, чем нетронутыми ДНК. Комет, программное обеспечение для анализа изображений, меры и сравнивает общую интенсивность флуоресценции ДНК в ядро с ДНК, которые мигрировали из ядра. Флуоресцентный сигнал от перенесенных ДНК пропорционально повреждения ДНК. Более яркий хвост ДНК означает, увеличилось повреждение ДНК. Некоторые из параметров, которые измеряются хвост момент, который является мерой как количество ДНК и распределение ДНК в хвост, длина хвоста и процент ДНК в хвосте. Этот тест позволяет измерять репарации ДНК, а так как разрешение повреждения ДНК означает ремонта произошло. Предел чувствительности составляет около 50 разрывы нитей в диплоидных млекопитающих 1,2 клетки. Клетки, обработанные с любой ДНК-повреждающих агентов, таких как этопозид, могут быть использованы в качестве положительного контроля. Таким образом, метод ДНК-комет является быстрой и эффективной процедурой для оценки повреждения ДНК.
Protocol
1. Культура клеток
- Культуры нервных клеток и относиться к ним по мере необходимости.
- Урожай клеток в 15 мл трубки: аспирата СМИ, промыть фосфатным буферным раствором (PBS, кальция и магния бесплатно), добавить трипсина, собирают в 15 мл трубки и нейтрализации трипсина с соответствующей сыворотки, содержащей средства массовой информации.
- Побочные в 1000 х г в течение 5 мин.
- Аспирируйте СМИ.
- Ресуспендируют клеток в PBS.
- Побочные в 1000 х г в течение 5 мин.
- Аспирируйте средств массовой информации и ресуспендирования клеток в свежей PBS.
- Граф клеток с использованием гемацитометре или ваш счетчик клеток.
- Сотовые образцы следует готовить непосредственно перед началом анализа.
- Все образцы должны быть обработаны в темноте или желтый свет, чтобы предотвратить повреждение ДНК от ультрафиолетового излучения.
2. Комет
1. Презентация подготовка
- Растопить 1% агарозном (1 г / 100 мл 1X Tris Base, борная кислота, ЭДТА, туберкулезомE) в микроволновой печи в течение 3 минут, пока все гранулы исчезают.
- Dip слайды в расплавленную агарозу и протрите стороны чистить Kimwipe. Разрешить агарозы в воздушно-сухом в прозрачную пленку. Это можно сделать заранее и слайды могут быть сохранены.
2. Нейтральные анализа Comet
- Холод лизиса решение (2,5 М NaCl, 100 мМ ЭДТА рН 10, 10 мМ Трис базы, 1% раствор натрия лаурилсульфат саркозинат, и 1% Triton X-100, рН 10) при 4 ° С в течение не менее 1 часа перед использованием.
- 2.2.2. Растопить 1% низкой температурой плавления агарозы (1 г / 100 мл в 1X Tris Base, борная кислота, ЭДТА) в микроволновой печи в течение 3 минут, пока все гранулы исчезают. Агарозном должна быть охлаждена до 37 ° С на водяной бане, чтобы избежать искусственной индукции хвост кометы. В идеале, агарозы нуждается в охлаждении за полчаса перед использованием.
- 2.2.3. Развести суспензии клеток, так что есть 100000 клеток на мл. Комбинат клеточной суспензии с низкой температурой плавления агарозы (при 37 ° C) всоотношении 1:10 (V / V), вихрь кратко, и сразу 50 мкл на Comet слайдов. Используйте сторону кончика пипетки для распространения клеточной суспензии равномерно по всей площади образца. Каждой группе должно быть по крайней мере в трех экземплярах.
- Место скользит квартиру в холодильник на 30 мин, пока круг появляется на периферии слайд.
- Prechill решение лизиса и погрузить слайды в этом растворе в течение 30 мин в темноте при 4 ° C (или в холодильнике).
- Вылейте или аспирации лизиса решение и добавить 1X нейтральным буфером электрофореза (Трис базы, борная кислота, ЭДТА, 1X TBE). Оставьте слайды в этот буфер на полчаса в холодильник.
- Добавить prechilled 1X нейтральный буфер для электрофореза (КЭ) в электрофорезом камера, место слайдов в электрофореза подносов. Выровнять слайды, так что они находятся на одинаковом расстоянии от электродов.
- Залить нейтральным электрофореза 1X буфере до 0,2 дюймов выше слайдов. Превышение буфера междуФер с электрофорезом.
- Установить напряжение питания до 1 В на см (измеряется электрода к электроду) и запустить в течение 30 мин при 4 ° С (или холодные помещения), в темное время суток.
3. Щелочная анализа Comet
- Холод лизиса решение (2,5 М NaCl, 100 мМ ЭДТА рН 10, 10 мМ Трис базы, 1% раствор натрия лаурилсульфат саркозинат, и 1% Triton X-100, рН 10) при 4 ° С в течение не менее 1 часа перед использованием.
- Растопить 1% низкой температурой плавления агарозы (1 г / 100 мл 1X Tris Base, борная кислота, ЭДТА) в микроволновой печи в течение 3 минут, пока все гранулы исчезают. Затем остудите в 37 ° С водяной бане в течение 30 мин.
- Объединение клеток на 1 х 105 / мл с расплавленным низкой температурой плавления агарозы (при 37 ° C) в соотношении 1:10 (V / V), вихрь кратко, и сразу 50 мкл на Comet слайдов. Используйте сторону кончика пипетки для распространения клеточной суспензии равномерно по всей площади образца. Каждой группе должно быть по крайней мере в трех экземплярах.
- Место скользнулэс-квартире в холодильник на 30 мин, пока круг появляется на периферии слайд.
- Погрузитесь слайды в prechilled решение лизиса и оставить при 4 ° С в течение 1 часа на ночь в темноте.
- Удалить слайды из лизиса решение, слить и промыть слайды раз с холодным буфером нейтрализации в течение 5 мин для удаления остатков моющих средств и соли до щелочно-раскручивания шаг.
- Место слайдов в камере гель-электрофореза заполнены prechilled недавно сделал электрофореза буфера (300 мМ NaOH, 1 мМ ЭДТА, рН> 13) не превышает 0,5 см выше слайдов. Выровнять слайды, так что они находятся на одинаковом расстоянии от электродов.
- Пусть слайды сидеть в щелочном буфере в течение 30 мин в темноте, чтобы позволить раскручивание ДНК и экспрессии щелочной ответственности ущерб.
- Установить напряжение питания до 1 В на см (измеряется электрода к электроду) и запустить в течение 30 мин при 4 ° С (или холодном помещении).
4. Крепление и StaКлетки ining
- Слейте избыток буфер для электрофореза
- Погрузитесь скользит в предварительно охлажденный дистиллированной воде в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Погрузитесь слайды в предварительно охлажденный 70% этанола в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Сухие образцы в течение ночи. Не подвергайте слайды к яркому свету. Пробы могут храниться в течение нескольких месяцев при комнатной температуре до забив на данном этапе.
- Пятно слайдов путем погружения в Sybr зеленый (1X разводят в PBS) в течение 20 мин в холодильник.
- Удалить слайдов и дать им полностью высохнуть в темноте. Агарозном станет прозрачным, когда полностью высохнет.
4. Приобретение и анализа изображений
- Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа устанавливается на зеленый фильтр (Zeiss AxioVision) и анализ использования комет программного обеспечения (Perceptive Instruments).
- Нажмите на кнопку "головы кометы" (ядро) и программное обеспечение вычисляет параметры, включая средние момент хвост и количество ДНК вядре.
- Анализ по меньшей мере 200 клеток в лечении.
- Экспорт данных в Microsoft Excel.
- Рассчитать означает хвост момент для каждой группы лечения и участок данных по мере необходимости.
5. Представитель Результаты
Пример комет анализа нервных клеток показано на рисунках 2 и 3. В этом случае облучение нервных клеток вызывает повреждение ДНК. Поскольку клетки подвергаются электрического поля, ДНК мигрирует с разной скоростью из-за различий в размере, который затем анализировали с помощью программного обеспечения комет. Чем больше повреждений ДНК, тем дальше ДНК перемещается из ядра. Это приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции в ядре, которое затем подобрал программного обеспечения и приводит к более высоким хвостом момент. Таблица 1 изображает представителя стол от кометы анализа и анализа Рисунок 4 показывает представленийвитель график, сравнивающий повреждение ДНК в нервных клетках после излучения измеряется комет.
Рисунок 1. Технологическая схема комет. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 2. Представитель изображения нервных клеток (А) и без него (B) с хвоста кометы.
Рисунок 3. Комет анализа с использованием программного обеспечения комет. (A) представитель скриншоты изображений полученных с помощью Carl Zeiss флуоресцентного микроскопа и проанализированы с помощью CometАнализ программного обеспечения. (B) нажать на ядро или "головы кометы" (отмечены зеленым) генерирует флуоресцентный карта и график (обведено желтым) и (C) данные таблицы (обведено красным). Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 4. Представитель граф, полученный, откладывая среднюю момент хвост получены на основе анализа повреждений ДНК в облученных и необлученных нервных клеток с использованием нейтральных анализа кометы. Как и ожидалось, 3Gy излучения (рентгеновского) вызывает повреждение ДНК, как изображено выше среднего момента хвост в облученных нервных клеток. Показана средняя момент хвост (+ / - стандартная ошибка), ** P <0,01.
Таблица 1. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Комет имеет уникальную способность анализировать отдельные клетки. Это выгодно в идентификации субпопуляций клеток, которые демонстрируют дифференциального ответ на цитотоксических агентов. Несколько практических ограничений должны быть приняты во внимание. Количество ячеек, которые могут быть оценены индивидуально может варьироваться в зависимости от человека. Размер выборки должен быть увеличен, если есть разница в повреждении ДНК внутри популяции. Жизнеспособные одной клеточной суспензии является критическим для этого анализа, так как преобладает наличие некротических или апоптоза клеток добавят к ошибке. Лизис и электрофорез шагов избавляется от апоптоза клеток, небольших фрагментов ДНК (меньше 50 килобайт), и митохондриальной ДНК. Таким образом, они не будут обнаружены с помощью анализа кометы 1,3-11.
Как упоминалось выше, метод ДНК-комет является эффективным способом выявления одно-и двунитевых разрывов, в том числе щелочно-лабильных сайтов и DNA-DNA/DNA-protein поперечных связей наДНК. Здесь мы выделили два различных протоколов: щелочные анализ позволяет обнаруживать одиночные разрывы нитей, а также двойные разрывы ДНК, в то время как нейтральные анализа кометы позволяет только обнаружение двойных разрывов ДНК. Фермент модифицированных ДНК-комет может применяется для выявления окислительного аддуктов ДНК. Например, лечение Endo III (эндонуклеазы) и hOGG1 (гликозилаза) признать окисленных пиримидинов в том числе тимин и урацил гликоля гликоля 12,13 и 8-оксо-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoGua) 14,15 соответственно. Формамидопиримидин ДНК-гликозилаза (FPG) могут быть использованы аналогичным образом. Для этого модифицированного анализа, обработки ферментами предшествует раскручивания шаг. Кроме того поражения-специфические эндонуклеазы повышает чувствительность ДНК-комет, а 13.
Здесь мы используем хвост момента, как дескриптор повреждения ДНК. Хвост момент рассчитывается по следующей формуле: процент ДНК в хвосте умноженной на LenGTH кометы хвост 1,3-7. Длина хвоста кометы (длина хвоста) это расстояние от центра ядра до самой дальней точки миграции ДНК. Руководитель длина диаметра ядра. Интенсивность головы и хвоста интенсивности средней интенсивности пикселя в голове и хвосте кометы, соответственно. Общая площадь Общая площадь поверхности кометы 1,3-7.
Хотя есть и другие методы измерения повреждений ДНК, такие как γ-H2AX очагов окрашивания и импульсных поле гель-электрофореза, эти методы имеют свои недостатки, а 4,6,11,16,17. Например, репликация стресса часто является перемешиванием при измерении γ-H2AX уровнях 18. С формированием γ-H2AX очагов зависит от набора белков репарации ДНК, неспособность набрать репарации ДНК белков и конденсированной структуры хроматина может привести к ложно низкие γ-H2AX очагов уровнях. Кроме того, импульсное поле гель-electrophoresis очень много времени и это только полезно для разделения больших молекул ДНК 19,20. Таким образом, метод ДНК-комет является относительно простым, эффективным и недорогим, прямые и чувствительным показателем повреждения и репарации ДНК 10,11,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана IMPACT премию от департамента радиационной онкологии Университета Алабамы в Бирмингеме Всесторонний Онкологический центр, Фонд рака Борьба с детской, и Габриель Ангел Foundation (до ESY.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L.
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al.
- Finney, M.
- Electrophoresis, F. I., et al. Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
