Summary
Kometen analysen är ett effektivt sätt att upptäcka enkel-och dubbel-strängbrott, inklusive alkali-labila platser och DNA-DNA/DNA-protein tvärbindningar på DNA i alla celler, inklusive hippocampus neuroner. Metoden utnyttjar den differentiella migreringen av DNA i ett elektriskt fält på grund av skillnader i mängden av DNA-skada.
Abstract
Ett antal läkemedel rikta vägar DNA-reparation och framkalla celldöd genom att skapa DNA-skada. Sålunda har processer för att direkt mäta DNA-skador i stor utsträckning utvärderats. Traditionella metoder är tidskrävande, dyra, resurskrävande och kräver replikerande celler. I motsats, är komet analysen, en enda cell gelelektrofores-analys, en snabbare, icke-invasiv, billig, direkt och känslig mätning av DNA-skador och reparation. Alla former av DNA-skador samt DNA-reparation kan visualiseras på en enda cell nivå med denna kraftfulla teknik.
Den grundläggande principen för komet-analysen är att intakt DNA är mycket beställs medan DNA-skador stör denna organisation. De skadade DNA tränger in i agarosmatrisen och när de utsätts för ett elektriskt fält, vandrar den negativt laddat DNA mot katoden som är positivt laddad. De stora oskadade DNA-strängar kan inte migrera långt från kärnan. DNA-skadaskapar mindre DNA-fragment som reser längre än intakt DNA. Komet analys, en bildanalys programvara, mäter och jämför den totala fluorescensintensiteten av DNA i kärnan med DNA som har migrerat ut ur kärnan. Fluorescerande signal från den migrerade DNA är proportionell mot DNA-skada. Längre ljusare DNA svans betyder ökad DNA-skador. Några av de parametrar som mäts är svans ögonblick som är ett mått på både mängden DNA och fördelning av DNA i svansen, svansen längd och procentandelen av DNA i svansen. Denna analys gör det möjligt att mäta DNA-reparation samt eftersom upplösning av DNA-skada innebär reparation har skett. Gränsen för känslighet är ca 50 strängbrott per diploida däggdjursceller 1,2. Celler behandlade med alla DNA-skadande medel, såsom etoposid, kan användas som en positiv kontroll. Således komet-analysen är en snabb och effektiv procedur för att mäta DNA-skador.
Protocol
1. Cellodling
- Kultur neuronala celler och behandla dem efter behov.
- Harvest celler i 15 ml rör: aspirat media, skölj med fosfatbuffrad saltlösning (PBS, kalcium och magnesium gratis), lägg trypsin, samlas i 15 ml rör och neutralisera trypsin med lämpliga serum innehållande media.
- Snurra vid 1.000 x g under 5 min.
- Aspirera mediet.
- Resuspendera celler i PBS.
- Snurra vid 1.000 x g under 5 min.
- Aspirera media och återsuspendera celler i färskt PBS.
- Räkna celler med hjälp av en hemacytometer eller din önskade cellräknare.
- Cellprover skall beredas omedelbart innan analysen.
- Alla prover skall hanteras i mörker eller gult ljus för att förhindra DNA-skador från ultraviolett ljus.
2. Comet assay
1. Preparatet
- Smält 1% agaros (1 g / 100 ml i 1X Tris Base, borsyra, EDTA, TBE) i en mikrovågsugn under 3 minuter tills alla granulat försvinner.
- Dip glider in den smälta agarosen och torka en sida rengöra med en Kimwipe. Låt agaros lufttorka till en transparent film. Detta kan göras i förväg och diabilder kan lagras.
2. Neutral comet assay
- Chill lyslösning (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, pH 10, 10 mM Tris-bas, 1% natriumlaurylsarkosinat, och 1% Triton X-100, pH 10) vid 4 ° C under minst 1 timme före användning.
- 2.2.2. Smält 1% agaros med låg smältpunkt (1 g / 100 ml i 1X Tris Base, Borsyra, EDTA) i en mikrovågsugn under 3 minuter tills alla granulat försvinner. Agarosen måste kylas till 37 ° C i ett vattenbad för att undvika artificiell induktion av komet svans. Idealt behöver agaros som skall kylas under en halv timme före användning.
- 2.2.3. Späd cellsuspensionen så att det finns 100.000 celler per ml. Kombinera cellsuspensionen med agaros med låg smältpunkt (vid 37 ° C) vidett förhållande av 1:10 (volym / volym), skaka snabbt och pipettera omedelbart 50 pl på Comet Slide. Använd sidan av pipettspetsen att sprida cellsuspensionen jämnt över provets yta. Varje behandlingsgrupp bör vara åtminstone i triplikat.
- Placera objektglasen platt i kylskåp under 30 minuter tills en cirkel visas i periferin av sliden.
- Prechill lyslösningen och glider submerge i denna lösning under 30 minuter i mörker vid 4 ° C (eller i kylskåp).
- Häll av eller aspirera lys lösning och tillsätt 1X neutral elektroforesbuffert (Tris-bas, borsyra, EDTA, 1X TBE). Låt bilderna i denna buffert för en halvtimme i kylskåp.
- Lägg förkyld 1X Neutral elektroforesbuffert (TBE) i elektrofores kammare, placera objektglasen i elektrofores bild facket. Justera bilder så att de är på lika avstånd från elektroderna.
- Häll 1X neutral elektroforesbuffert upp till 0,2 inches ovanför bilderna. Överskott buffert kommer blandFere med elektrofores.
- Ställ matningsspänning till 1 V per cm (mätt elektrod till elektrod) och kördes under 30 min vid 4 ° C (eller kylrummet) i mörker.
3. Alkalisk Comet analys
- Chill lyslösning (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, pH 10, 10 mM Tris-bas, 1% natriumlaurylsarkosinat, och 1% Triton X-100, pH 10) vid 4 ° C under minst 1 timme före användning.
- Smält 1% agaros med låg smältpunkt (1 g / 100 ml i 1X Tris Base, Borsyra, EDTA) i en mikrovågsugn under 3 minuter tills alla granulat försvinner. Kyl sedan i en 37 ° C vattenbad under minst 30 minuter.
- Kombinera celler vid 1 x 105 / ml med smält agaros med låg smältpunkt (vid 37 ° C) vid ett förhållande av 1:10 (volym / volym), skaka snabbt och omedelbart pipettera 50 pl på Comet Slide. Använd sidan av pipettspetsen att sprida cellsuspensionen jämnt över provets yta. Varje behandlingsgrupp bör vara åtminstone i triplikat.
- Plats gledes lägenhet i kylskåp i 30 minuter tills en cirkel visas i periferin av bilden.
- Sänk ned objektglasen i förkyld lys lösning och lämna vid 4 ° C under 1 timme till över natten i mörker.
- Ta bort bilder från lys lösningen rinna bilderna och skölj en gång med kall neutraliseringsbuffert i 5 minuter för att avlägsna rester av rengöringsmedel och salter före alkali-avlindning steg.
- Placera objektglasen i en gelelektrofores kammare fylld med förkyld nyligen gjorda elektroforesbuffert (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH> 13) inte överstiga 0,5 cm ovanför bilderna. Justera bilder så att de är på lika avstånd från elektroderna.
- Låt objektglasen sitta i alkaliska buffert under 30 minuter i mörker för att möjliggöra avlindning av DNA och uttryck av alkali-ansvarig skador.
- Ställ matningsspänning till 1 V per cm (mätt elektrod till elektrod) och kördes under 30 min vid 4 ° C (eller kylrummet).
4. Fastställande och Staansvara för prövningen celler
- Dränera överskott elektroforesbuffert
- Doppa glider i pre-kylt destillerat vatten under 5 min vid RT.
- Doppa objektglasen i förväg kyld 70% etanol under 5 min vid RT.
- Torra prover natten. Utsätt inte glider för starkt ljus. Prov kan lagras i månader vid rumstemperatur före scoring i detta skede.
- Stain objektglasen genom nedsänkning i SYBR Green (1X utspädd i PBS) under 20 minuter i kylskåp.
- Ta bilder och låt dem torka i mörker. Agaros blir genomskinlig när helt torr.
4. Bild och analys
- Acquire bilder med fluorescerande mikroskop inställt på gröna filtret (Zeiss AxioVision) och analysera med Comet Assay programvara (klarsynta Instruments).
- Klicka på "komet huvud" (kärnan) och programmet beräknar parametrar inklusive medelvärdet svansen ögonblick och mängden av DNA ikärna.
- Analysera minst 200 celler per behandling.
- Exportera data till Microsoft Excel.
- Beräkna betyda svans ögonblick för varje behandlingsgrupp och data tomt som är lämpligt.
5. Representativa resultat
Ett exempel på comet assay analys neuronala celler visas i figur 2 och figur 3. I detta fall inducerar bestrålning av de neuronala cellerna DNA-skada. Eftersom cellerna utsätts för det elektriska fältet, migrerar DNA vid olika hastigheter beroende på skillnader i storlek som därefter analyseras med hjälp av programvaran comet assay. Ju mer DNA-skador, desto längre DNA vandrar ut ur kärnan. Detta minskar den fluorescerande intensiteten i kärnan som därefter plockas upp av mjukvaran och resulterar i högre svans ögonblick. Tabell 1 visar en representativ tabell från comet assay analys och Figur 4 visar ett representativttiva diagram som jämför DNA-skada i neuronala celler efter strålning såsom uppmätt med komet analysen.
Figur 1. Flödesschema av kometen analysen. Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Representativa bilder av neuronala celler (A) utan och (B) med kometsvans.
Figur 3. Comet assay analys med hjälp av programvara comet assay. (A) Representativa skärmdumpar av bilden som förvärvats med hjälp Carl Zeiss fluorescensmikroskop och analyseras med CometAnalysprogramvara. (B) Genom att klicka på kärnan eller "komet huvudet" (inringat i grönt) genererar en fluorescerande karta och diagram (inringat i gult) och en (C) datatabell (inringad i rött). Klicka här för att se större bild .
Figur 4. Representant diagram som erhålls genom att rita den genomsnittliga svansen ögonblick som erhålls genom att analysera DNA-skador i bestrålade och icke-bestrålade nervceller med neutral comet assay. Som väntat, inducerar 3Gy strålning (röntgen) DNA-skada, såsom visas av det högre genomsnittliga svansen ögonblick i de bestrålade neuronala celler. Visas är den genomsnittliga svansen ögonblick (+ / - standardfel), ** P <0,01.
Tabell 1. Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kometen analysen har den unika förmågan att analysera enskilda celler. Detta är fördelaktigt vid identifiering av underpopulationer av celler som visar differentiell respons på cytotoxiska medel. Några praktiska begränsningar måste beaktas. Antalet celler som kan utvärderas individuellt kan variera beroende på individen. Urvalsstorleken måste ökas om det finns variationer i DNA-skador inom en population. Viabel encelliga fjädring är avgörande för denna analys, eftersom dominerande förekomst av nekrotiska eller apoptotiska celler kommer att lägga till fel. Lys och elektrofores steg gör sig av apoptotiska celler, små DNA-fragment (mindre än 50 kb) och mitokondrie-DNA. Således är de inte upptäcks av comet assay 1,3-11.
Som nämnts ovan är comet assay ett effektivt sätt att upptäcka enkel-och dubbel-strängbrott, inklusive alkali-labila platser och DNA-DNA/DNA-protein tvärbindningar påDNA. Här vi har beskrivit två distinkta protokoll: den alkaliska analysen tillåter detektion av enstaka strängbrott samt dubbla raster strängbrott, medan den neutrala komet analysen tillåter endast detektering av dubbla strängbrott. Enzym-modifierat comet assay kan tillämpas för att upptäcka oxidativa DNA-addukter. Till exempel, känner igen behandling med Endo III (endonukleas) och hOGG1 (glykosylas) oxiderade pyrimidiner inklusive tymin glykol och uracil glykol 12,13 och 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoGua) 14,15 respektive. Formamidopyrimidin DNA-glykosylas (FPG) kan användas på liknande sätt. För denna modifierade analys föregår behandling med enzymerna avlindningen steget. Tillsatsen av lesion-specifika endonukleaser ökar känsligheten av komet analysen samt 13.
Här använder vi svans ögonblick som deskriptor för DNA-skador. Svans ögonblick beräknas med hjälp av följande formel: andel DNA i svansen multiplicerat med length av kometsvans 1,3-7. Längden av kometsvans (svans längd) är avståndet från centrum av kärnan till den yttersta punkten av migration av DNA. Huvudets längd är diametern hos kärnan. Chef intensitet och svans intensitet är de genomsnittliga pixelintensiteter i huvud och svans av kometen, respektive. Total yta är den totala ytan av kometen 1,3-7.
Även om det finns andra metoder för mätning av DNA-skada, såsom γ-H2AX foci färgning och pulsad fält gelelektrofores, dessa analyser har sina nackdelar också 4,6,11,16,17. Till exempel, är replikering stress ofta en confounder vid mätning av γ-H2AX nivåerna 18. Eftersom bildandet av γ-H2AX fokus är beroende rekrytering av proteiner DNA-reparation, kan inte rekrytera proteiner DNA-reparation och en kondenserad kromatin struktur leda till felaktigt låga γ-H2AX foki nivåer. Likaså pulsad fält-gel electrophoresis är mycket tidskrävande och är bara bra för separation av stora DNA-molekyler 19,20. Således är comet assay en relativt enkel, effektiv och billig, direkt och känsligt mått på DNA-skador och reparation 10,11,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av IMPACT Award från institutionen för Radiation Oncology, University of Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, Fighting Barncancerfonden och Gabrielles Angel Foundation (till Esy.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L.
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al.
- Finney, M.
- Electrophoresis, F. I., et al. Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
