Summary
Comet assay alkali labil siteleri ve hipokampal nöronlar da dahil olmak üzere tüm hücrelerde DNA üzerinde DNA-DNA/DNA-protein çapraz bağlantılar dahil tek ve çift zincir kırıkları, tespit etmenin en etkin yoludur. Yöntem DNA hasar miktarının farklılıklara bağlı olarak, bir elektrik alanı içinde DNA diferansiyel göç yararlanır.
Abstract
Ilaçların bir dizi DNA onarım yolakları hedef ve hücre DNA hasarı oluşturarak öldürmeye teşvik. Böylece, doğrudan DNA hasarı ölçmek için süreçlerin kapsamlı değerlendirilmiştir. Geleneksel yöntemler zaman alıcı, pahalı, kaynak yoğun ve kopyalayan hücrelerin gerektirir. Buna karşılık, kuyruklu testi, tek hücre jel elektroforezi testi, DNA hasarı ve onarımı daha hızlı, non-invaziv, ucuz, direkt ve duyarlı bir ölçüsüdür. DNA hasarı yanı sıra DNA tamir bütün formları bu güçlü tekniği kullanarak tek hücre düzeyinde görüntülenebilir.
Comet assay yatan prensip DNA hasarı bu organizasyon bozan ise intakt DNA çok sipariş olmasıdır. Hasarlı DNA'nın agaroz matriks içine girer ve bir elektrik alanına maruz kaldığında, negatif yüklü DNA pozitif yüklüdür katoda doğru göç eder. Büyük hasarsız DNA ipliklerini çok çekirdek göç etmek mümkün değildir. DNA hasaruzak bozulmamış DNA daha seyahatlerinizde küçük DNA parçaları oluşturur. Comet Assay, bir görüntü analiz yazılımı, tedbirler ve çekirdeğin dışına göç etmiş DNA ile DNA'dan genel floresan yoğunluğu karşılaştırır. Göç DNA'dan Floresan sinyal DNA hasarı ile doğru orantılıdır. Uzun parlak DNA kuyruk artmış DNA hasarı anlamına gelir. Ölçülen parametreler bazıları kuyruk DNA'sının miktarı ve kuyruk, kuyruk uzunluğundaki DNA dağıtımı ve DNA yüzdesi her ikisi de bir ölçüsüdür kuyruk an vardır. Bu testte DNA hasarının çözünürlüğü tamir yerini almıştır anlamına beri yanı DNA onarım ölçmek için sağlar. Duyarlılık sınırı diploid memeli hücre 1,2 başına yaklaşık 50 iplikli kırılır. Örneğin etoposid gibi herhangi bir DNA hasarına neden olan ajan ile muamele Hücreler, bir pozitif kontrol olarak da kullanılabilir. Böylece comet assay DNA hasarı ölçmek için hızlı ve etkili bir yöntemdir.
Protocol
1. Hücre Kültürü
- Kültür nöronal hücrelerin ve onları gerektiği gibi davranın.
- 15 ml'lik tüp içine hasat hücreleri: aspiratı ortam, fosfat ile durulama (PBS, kalsiyum ve magnezyum serbest) tamponlu tuzlu su, 15 ml tüp içinde toplamak ve uygun bir serum ihtiva eden ortam ile nötralize tripsin, tripsin ekleyin.
- 5 dakika boyunca 1000 xg Spin.
- Medya aspire.
- PBS içinde hücreler yeniden süspanse edin.
- 5 dakika boyunca 1000 xg Spin.
- Taze PBS içinde medya ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire.
- Bir hemasitometre veya tercih ettiğiniz hücre sayıcı kullanarak hücreleri saymak.
- Hücre numuneleri deney başlamadan hemen önce hazırlanmalıdır.
- Tüm numuneler, morötesi ışık DNA hasarı önlemek için ya da koyu sarı ışık altında ele alınmalıdır.
2. Comet Assay
1. Slayt Hazırlama
- % 1 agaroz (1X Tris Base, Borik asit, EDTA, TB ve 1 g / 100 ml eritinE) 3 dakika süreyle mikrodalga tüm granül kayboluncaya kadar.
- Dip erimiş agaroz içine slaytlar ve bir tarafı silin bir Kimwipe ile temizleyin. Şeffaf bir film kuruması için agaroz izin verin. Bu muhafaza edilebilir ve önceden kızak içinde yapılabilir.
2. Nötr Comet Assay
- Kullanımdan önce en az 1 saat boyunca 4 ° C sıcaklıkta erimesi Chill çözeltisi (2.5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris baz,% 1 sodyum lauril sarkosinat, ve% 1 Triton X-100, pH 10).
- 2.2.2. Tüm granül kayboluncaya kadar bir mikrodalga% 1 düşük erime noktası agaroz (1X Tris Bankası'ndaki 1 g / 100ml, Borik asit, EDTA) 3 dakika eritin. Agaroz kuyruklu kuyruk yapay indüksiyon önlemek için ° C'de bir su banyosu içinde 37 kadar soğutuldu gerekmektedir. İdeal olarak, agaroz kullanımdan önce yarım saat için soğutulması gerekmektedir.
- 2.2.3. , Ml başına 100,000 hücre olup, böylece hücre süspansiyonu ile seyreltilir. Düşük erime noktası agaroz (37 ° C) ile hücre süspansiyonu Kombine1:10 (v / v), girdap kısaca, oranı ve hemen Comet slayt üzerine 50 ul pipetle. Örnek alan üzerinde eşit hücre süspansiyonu yaymak için pipet ucu tarafını kullanın. Her tedavi grubu en az üç kopya halinde olmalıdır.
- Bir daire slayt periferinde görünene kadar Sıra 30 dakika boyunca buzdolabında düz kayar.
- Prechill 4 karanlıkta 30 dakika için bu çözelti içinde lizis çözelti daldırın ve slaytlar ° C'de (ya da bir soğutma cihazı olarak).
- Kapalı dökün veya lizis çözüm aspirat ve 1X nötr elektroforez tamponu (Tris baz, Borik asit, EDTA, 1X TBE) ekleyin. Buzdolabında yarım saat bu tampona slaytlar bırakın.
- Elektroforez odasında önceden soğutulmuş 1X Nötr Elektroforez Tamponu (TBE), elektroforez slayt tepsisine yerleştirin slayt ekleyin. Onlar elektrotlar eşit uzaklıkta olacak şekilde slaytlar hizalayın.
- 1X nötr elektroforez slaytlar üzerinde 0,2 inç kadar tampon dökün. Aşırı tampon arası olacakelektroforezi ile Fere.
- Cm başına 1 V (elektrot elektrot ölçülür) güç kaynağı gerilimini ayarlayın ve karanlıkta 4 ° C (veya soğuk oda) 30 dakika boyunca çalıştırın.
3. Alkali Comet Assay
- Kullanımdan önce en az 1 saat boyunca 4 ° C sıcaklıkta erimesi Chill çözeltisi (2.5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris baz,% 1 sodyum lauril sarkosinat, ve% 1 Triton X-100, pH 10).
- Tüm granül kayboluncaya kadar 3 dakika boyunca mikrodalga içinde% 1 düşük erime noktası agaroz (1X Tris Bankası'ndaki 1 g / 100 ml, Borik asit, EDTA) eritin. Sonra en az 30 dakika süreyle 37 ° C su banyosunda soğutulur.
- 1:10 (v / v), girdap kısaca, bir oranında erimiş düşük bir erime noktasına sahip agaroz 1 x 105 / ml arasındadır (37 ° C) hücreleri ile birleştirin ve hemen Comet slayt üzerine 50 ul pipetle. Örnek alan üzerinde eşit hücre süspansiyonu yaymak için pipet ucu tarafını kullanın. Her tedavi grubu en az üç kopya halinde olmalıdır.
- Sıra kaydırdıes düz 30 dakika buzdolabında bir daire slayt periferinde görünene kadar.
- Lizis çözelti içinde önceden soğutulmuş ve 4 ° C'de bırakmak karanlıkta gece boyunca, 1 saat için Immerse kayar.
- Lizis çözüm slaytları çıkarın, slaytlar boşaltın ve alkali gevşemek adım öncesinde kalan deterjan ve tuzları kaldırmak için 5 dakika süreyle soğuk nötralizasyon tamponu ile bir kez yıkayın.
- Bir jel elektroforez odasında Sıra slaytlar slaytları yukarıda 0.5 cm geçmeyecek şekilde önceden soğutulmuş taze yapılmış elektroforez tamponu (300 mM NaOH, 1 mM EDTA,> 13 pH) ile doldurulur. Onlar elektrotlar eşit uzaklıkta olacak şekilde slaytlar hizalayın.
- Slaytlar DNA ve alkali sorumlu hasar ifade çözülmesi için izin vermek için karanlıkta 30 dakika süreyle alkalin tampon bekletin.
- Cm başına 1 V (elektrot elektrot ölçülen) güç kaynağı gerilimi ayarlayın ve 4 az 30 dakika çalıştırın ° C (veya soğuk oda).
4. Tespit ve Staining Hücreler
- Aşırı Elektroforez Tampon boşaltın
- Daldırın oda sıcaklığında 5 dakika boyunca önceden soğutulmuş damıtılmış su içinde kayar.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca önceden soğutulmuş% 70 etanol içinde Immerse kayar.
- Gecede Kuru örnekleri. Parlak ışık slaytlar maruz bırakmayın. Numuneler bu aşamada puanlama için oda sıcaklığında ay boyunca muhafaza edilebilir.
- Buzdolabında 20 dakika SYBR Green (PBS içinde seyreltilmesi 1X) daldırarak slaytlar Leke.
- Slaytları çıkarın ve onları karanlıkta tamamen kurumasını bekleyin. Tamamen kuru agaroz şeffaf hale gelecektir.
4. Görüntü Toplama ve Analizi
- Yeşil filtre (Zeiss AxioVision) ve Comet Assay yazılım (Algısal Instruments) kullanılarak analiz ayarlanır floresan mikroskop kullanılarak görüntü elde edin.
- "Kuyruklu kafa" (çekirdeği) üzerine tıklayın ve yazılımı içinde ortalama kuyruk momenti ve DNA miktarı dahil parametreleri hesaplarçekirdek.
- Tedavi başına en az 200 hücre analiz edin.
- Microsoft Excel'e veri verme.
- Her tedavi grubu ve uygun arsa verileri için kuyruk momenti ortalama hesaplayın.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Nöron hücreleri üzerinde kuyruklu tahlil analizinin bir örneği Şekil 2 ve Şekil 3 'de gösterilmiştir. Bu durumda, nöronal hücrelerin ışınlama DNA hasarına neden olmaktadır. Hücreler elektrik alanına maruz gibi, DNA daha sonra Comet Test yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir boyut farklılıklara bağlı olarak farklı hızlarda geçirir. Daha fazla DNA hasarı, uzak DNA çekirdek dışında geçirir. Bu sonradan yüksek kuyruk anda yazılım ve sonuçları tarafından alınır çekirdeğinde floresan yoğunluğu azalır. Tablo 1 comet assay analizi ve Şekil 4 bir temsilci tablo gösteriyor bir temsilcisi gösterirniteliksel grafiği comet assay ile ölçülen radyasyon sonrasında nöronal hücrelerde DNA tahribatına karşılaştırarak.
Şekil 1. Kuyruklu testin Akış şeması. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Nöron hücrelerinin Örnek görüntü (A) olmaksızın ve (B) kuyrukluyıldız kuyruk ile.
Comet Assay yazılımı kullanarak Şekil 3. Comet assay analizi. (A) görüntü Temsilcisi ekran görüntüleri Carl Zeiss floresan mikroskop kullanılarak kazanılmış ve Comet kullanılarak analizTest yazılımı. (B) nukleus ya da "kuyruklu kafa" (yeşil daire) tıkladığınızda bir floresan harita ve grafik (sarı daire içinde) ve (C) veri tablosu (kırmızı daire) oluşturur. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. Nötr comet assay kullanarak ışınlanmış ve ışınlanmamış nöronal hücrelerde DNA tahribatına çözümlenmesiyle elde edilen ortalama kuyruk momenti komplo ile elde Temsilcisi grafiği. Beklendiği gibi ışınlanmış nöronal hücrelerde yüksek ortalama kuyruk momenti tarafından gösterildiği gibi, 3 Gy radyasyon (x-ray), DNA hasarı indükler. , ** P <0.01 - ortalama kuyruk momenti (Standart hata + /) olduğu gösterilir.
Tablo 1. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Comet assay bireysel hücrelerin analiz eşsiz kapasitesine sahiptir. Bu sitotoksik ajanlara diferansiyel tepki göstermek hücrelerinin alt popülasyonlarının belirlenmesi avantajlıdır. Birkaç pratik sınırlamaları dikkate alınmalıdır. Ayrı ayrı değerlendirilebilir hücrelerin sayısı her bir bağlı olarak değişebilir. Bir popülasyon içindeki DNA hasarı varyans varsa örneklem büyüklüğü artırılmalıdır. Nekrotik ya apoptotik hücrelerin baskın varlığı hata katacak yana Yaşayabilir tek hücre süspansiyonu Bu tahlil için kritik öneme sahiptir. Lizis ve elektroforez adımları apoptotik hücreler, küçük DNA parçacıkları (50kb daha küçük) ve mitokondriyal DNA kurtulur. Böylece, comet assay 1,3-11 tarafından algılanmaz.
Yukarıda da belirtildiği gibi, comet assay alkali labil siteleri ve ilgili DNA-DNA/DNA-protein çapraz bağlantılar dahil tek ve çift zincir kırıkları, tespit etmenin en etkin yoludurDNA. Nötr comet assay çift iplikli sonları sadece algılama sağlayan ise, alkali tahlil tek iplikçik tatili yanı sıra çift iplikli sonları algılama sağlar: Burada iki ayrı protokol ana hatlarıyla. Enzim modifiye comet assay oksidatif DNA adducts tespit uygulandı yapabilirsiniz. Örneğin, Endo III (endonükleaz) ve hOGG1 (glikozilaz) ile muamele glikol timin ve urasil glikol 12,13 ve 8-okso-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoGua) 14,15 içeren pirimidin okside tanımak. Formamidopyrimidine DNA-glikozilaz (APG) benzer bir şekilde kullanılabilir. Bu değiştirilmiş test için, enzim ile muamele adımı öncesinde çözülmesi. Lezyona spesifik enzimlerinin ilave kuyruklu test de 13 duyarlılığını arttırır.
Burada DNA hasarının tanımlayıcısı olarak kuyruk momenti kullanın. Kuyruk an aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır: kuyruk DNA yüzdesi len çarpılırkuyrukluyıldız kuyruk 1,3-7 arasında gth. Kuyrukluyıldızın kuyruğu (kuyruk uzunluğu) uzunluğu DNA göç uzak noktaya çekirdeğin merkezinden mesafedir. Baş uzunluğu çekirdeğin çapı. Kafa yoğunluğu ve kuyruk yoğunluğu kuyruklu yıldızın baş ve kuyruk ortalama piksel yoğunluğu, sırasıyla. Toplam alan kuyruklu 1,3-7 toplam yüzey alanıdır.
Böyle γ-H2AX odakları boyama ve pulsed-field jel elektroforez gibi DNA hasarlarının ölçme diğer yöntemler olmasına rağmen, bu ölçümlerin yanı 4,6,11,16,17 kendi dezavantajları var. Örneğin, sık sık replikasyon stres γ-H2AX seviyeleri 18 ölçü içinde bir karıştırıcı faktör olduğunu. Γ-H2AX odaklar oluşumu DNA tamir proteinleri işe bağlı olduğu için, DNA tamir proteinleri ile bir kondanse kromatin yapısı toplamak için başarısızlık de yanlış düşük γ-H2AX odaklar seviyelerine sebep olabilir. Benzer şekilde, pulsed-field jel electrophoresis çok zaman yoğundur ve büyük DNA moleküllerinin 19,20 ayrılması için sadece faydalıdır. Böylece, comet assay DNA hasarı ve onarımı 10,11,21 nispeten kolay, verimli ve ucuz, doğrudan ve duyarlı bir ölçüsüdür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Radyasyon Onkolojisi, Alabama-Birmingham Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi'nde, Dövüş Çocuk Kanser Vakfı ve Gabrielle'in Angel Vakfı (ESY için.) Bölümü IMPACT Ödülü ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L.
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al.
- Finney, M.
- Electrophoresis, F. I., et al. Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
