Summary
El ensayo cometa es una manera eficaz de detectar saltos de simple y doble hebra, incluyendo álcali-lábiles y sitios DNA-DNA/DNA-protein enlaces cruzados en el ADN en todas las células incluyendo neuronas del hipocampo. El método se aprovecha de la migración diferencial de ADN en un campo eléctrico debido a las diferencias en la cantidad de daño en el DNA.
Abstract
Un número de medicamentos se dirigen las rutas de reparación de ADN e inducir la muerte celular mediante la creación de daños en el ADN. Así, los procesos para medir directamente el daño del ADN han sido ampliamente evaluados. Los métodos tradicionales requieren mucho tiempo, los recursos costosos, y requieren células en replicación. En contraste, el ensayo de cometa, un gel de una sola célula del ensayo de electroforesis, es más rápido, no invasivo, de bajo costo medida, directa y sensible de daño y reparación del ADN. Todas las formas de daño en el ADN, así como la reparación del ADN puede ser visualizado en el nivel de células individuales utilizando esta técnica de gran alcance.
El principio que subyace a la prueba del cometa es que el ADN intacto es muy ordenado, mientras que el daño del ADN altera esta organización. Las filtraciones de ADN dañado en la matriz de agarosa y cuando se somete a un campo eléctrico, el ADN cargado negativamente migra hacia el cátodo, que está cargado positivamente. Las hebras grandes no dañadas de ADN no son capaces de migrar lejos del núcleo. Daño en el DNAcrea pequeños fragmentos de ADN, que pueden desplazarse más lejos que el ADN intacto. Comet Assay, un software de análisis de imagen, y compara las medidas de la intensidad global fluorescente del ADN en el núcleo con ADN que ha migrado fuera del núcleo. Señal fluorescente del ADN migrado es proporcional al daño del ADN. Brillante cola más larga de ADN significa un mayor daño del ADN. Algunos de los parámetros que se miden son momento de la cola, que es una medida tanto de la cantidad de ADN y la distribución de ADN en la longitud de la cola de la cola, y el porcentaje de ADN en la cola. Este ensayo permite medir la reparación del ADN, así ya que la resolución de daños en el ADN significa reparación ha tenido lugar. El límite de sensibilidad es de aproximadamente 50 roturas de cadena por célula diploide 1,2 mamíferos. Las células tratadas con agentes que dañan el ADN, tales como etopósido, se puede utilizar como un control positivo. Así, el ensayo cometa es un procedimiento rápido y eficaz para medir el daño del ADN.
Protocol
1. Cultivo celular
- Cultura células neuronales y tratarlos según sea necesario.
- Células cosecha en tubos de 15 ml: medios de aspirado, enjuague con tampón fosfato salino (PBS, calcio y magnesio libre), añadir tripsina, recoger en tubos de 15 ml y neutralizar la tripsina con apropiados medios que contienen suero.
- Girar a 1.000 xg durante 5 min.
- Aspirar medios de comunicación.
- Resuspender las células en PBS.
- Girar a 1.000 xg durante 5 min.
- Aspirar medio y las células se resuspenden en PBS fresco.
- Contar las células utilizando un hemocitómetro o su contador celular preferido.
- Las muestras de células debe prepararse inmediatamente antes de iniciar el ensayo.
- Todas las muestras deben ser manejados en la oscuridad o bajo luz amarilla para evitar daños en el ADN de la luz ultravioleta.
2. Comet Assay
1. Preparación del portaobjetos
- Derretir 1% de agarosa (1 g / 100 ml en 1X Tris Base, ácido bórico, EDTA, TBE) en un microondas durante 3 min hasta que todos los gránulos desaparecer.
- Dip diapositivas en la agarosa fundida y limpie un lado limpiar con un Kimwipe. Permitir que la agarosa se seca al aire a una película transparente. Esto se puede hacer por anticipado y diapositivas se pueden almacenar.
2. Ensayo Cometa Neutral
- Enfriar la solución de lisis (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris base, 1% de sodio lauril sarcosinato, y 1% de Triton X-100, pH 10) a 4 ° C durante al menos 1 h antes de su uso.
- 2.2.2. Derretir 1% de agarosa de bajo punto de fusión (1 g / 100 ml en 1X Tris Base, ácido bórico, EDTA) en un microondas durante 3 min hasta que todos los gránulos desaparecer. La agarosa necesita ser enfriado a 37 ° C en un baño de agua para evitar la inducción artificial de cola del cometa. Idealmente, la agarosa necesita ser enfriado durante media hora antes de su uso.
- 2.2.3. Diluir la suspensión de células de modo que hay 100.000 células por ml. Combinar la suspensión celular con el bajo punto de fusión de agarosa (a 37 ° C) enuna proporción de 1:10 (v / v), agitar brevemente, e inmediatamente pipetear 50 l sobre el portaobjetos Comet. Use el lado de la punta de la pipeta para difundir la suspensión de células uniformemente sobre el área de la muestra. Cada grupo de tratamiento debería ser al menos por triplicado.
- Place desliza plana en el refrigerador durante 30 min hasta que aparece un círculo en la periferia de la corredera.
- Prechill la solución de lisis y los portaobjetos en esta solución durante 30 min en la oscuridad a 4 ° C (o en un refrigerador).
- Vierta o aspirar la solución de lisis y añadir tampón de electroforesis 1X neutro (Tris base, ácido bórico, EDTA, 1X TBE). Agregar diapositivas en este tampón durante media hora en el refrigerador.
- Añadir preenfriada buffer 1X Electroforesis Neutral (TBE) en la cámara de electroforesis, coloque los portaobjetos en la bandeja de electroforesis de diapositivas. Alinear las diapositivas de manera que sean equidistantes de electrodos.
- Vierta electroforesis 1X neutral almacenar hasta 0,2 pulgadas por encima de las diapositivas. El exceso de buffer de entreinterferir con la electroforesis.
- Ajuste el voltaje de suministro de energía a 1 V por cm (medido electrodo a electrodo) y una duración de 30 min a 4 ° C (o el cuarto frío) en la oscuridad.
3. Ensayo Cometa Alcalino
- Enfriar la solución de lisis (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris base, 1% de sodio lauril sarcosinato, y 1% de Triton X-100, pH 10) a 4 ° C durante al menos 1 h antes de su uso.
- Derretir 1% de agarosa de bajo punto de fusión (1 g / 100 ml en 1X Tris Base, ácido bórico, EDTA) en un microondas durante 3 min hasta que todos los gránulos desaparecer. Luego enfriar en un baño de agua a 37 ° C durante al menos 30 min.
- Combinar las células a 1 x 105 / ml con fundido bajo punto de fusión de agarosa (a 37 ° C) en una proporción de 1:10 (v / v), agitar brevemente, e inmediatamente pipetear 50 l sobre el portaobjetos Comet. Use el lado de la punta de la pipeta para difundir la suspensión de células uniformemente sobre el área de la muestra. Cada grupo de tratamiento debería ser al menos por triplicado.
- Lugar deslizóes plana en el refrigerador durante 30 min hasta que aparece un círculo en la periferia de la corredera.
- Sumergir los portaobjetos en solución de lisis previamente enfriado y salen a 4 ° C durante 1 hora hasta toda la noche en la oscuridad.
- Retirar los portaobjetos de la solución de lisis, drenar los portaobjetos y se lava una vez con tampón de neutralización en frío durante 5 min para eliminar el detergente residual y las sales antes de la etapa de desenrollado alcalino-.
- Colocar los portaobjetos en una cámara de electroforesis en gel de llenado con tampón de electroforesis preenfriada recién hecho (300 mM NaOH, 1 mM EDTA,> 13 pH) que no exceda de 0,5 cm por encima de diapositivas. Alinear las diapositivas de manera que sean equidistantes de electrodos.
- Vamos diapositivas sentarse en el tampón alcalino durante 30 min en la oscuridad para permitir el desenrollado del ADN y la expresión de álcali responsable daño.
- Ajuste el voltaje de suministro de energía a 1 V por cm (medido electrodo a electrodo) y una duración de 30 min a 4 ° C (o el cuarto frío).
4. Fijación y StaLas células nando
- Escurrir el exceso de tampón de electroforesis
- Sumergir desliza en pre-refrigerada agua destilada durante 5 min a TA.
- Sumergir los portaobjetos en pre-enfriada de etanol al 70% durante 5 min a RT.
- Las muestras secas durante la noche. No exponga las transparencias a la luz brillante. Las muestras pueden almacenarse durante meses a temperatura ambiente antes de la puntuación en esta etapa.
- Mancha de diapositivas por inmersión en SYBR Green (1X diluido en PBS) durante 20 minutos en el refrigerador.
- Retirar los portaobjetos y dejar que se sequen completamente en la oscuridad. La agarosa se convertirá en transparente cuando está completamente seco.
4. Adquisición de imágenes y análisis
- Adquirir imágenes con microscopio de fluorescencia establece en el filtro verde (Zeiss AxioVision) y analizar el uso de software Comet Assay (instrumentos perceptivos).
- Haga clic en la "cabeza cometa" (el núcleo) y el software calcula los parámetros que incluye el momento de la cola media y la cantidad de ADN en lanúcleo.
- Analizar al menos 200 células por tratamiento.
- Exportar datos a Microsoft Excel.
- Calcular significa momento de la cola para cada grupo de tratamiento y los datos de trama según proceda.
5. Los resultados representativos
Un ejemplo de análisis de cometa ensayo sobre las células neuronales se muestra en la Figura 2 y la Figura 3. En este caso, la irradiación de las células neuronales induce daño en el ADN. Como las células son sometidas a un campo eléctrico, el ADN migra a velocidades diferentes debido a diferencias en el tamaño que posteriormente se analizaron mediante el programa ensayo cometa. Cuanto más el daño en el ADN, más lejos el ADN migra fuera del núcleo. Esto disminuye la intensidad de fluorescencia en el núcleo, el cual es posteriormente recogido por el software y los resultados en momento de la cola superior. Tabla 1 representa una tabla representativa de análisis ensayo cometa y la Figura 4 muestra una representacióntativo gráfico comparando el daño del ADN en las células neuronales después de la radiación, medido por el ensayo de cometa.
Figura 1. Diagrama de flujo del ensayo cometa. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 2. Imágenes representativas de células neuronales (A) sin y (B) con cola de cometa.
Figura 3. Comet análisis ensayo utilizando software Comet Assay. (A) disparos representativos de pantalla de imagen adquirida con Carl Zeiss microscopio fluorescente y se analizaron usando CometEnsayo de software. (B) Al hacer clic en el núcleo o la "cabeza del cometa" (con un círculo verde) genera un mapa fluorescente y gráfica (marcada en amarillo) y un cuadro (C) datos (círculo rojo). Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 4. Gráfico representativo obtenido por el trazado de la momento de la cola media obtenida mediante el análisis de daño del ADN en las células neuronales irradiados y no irradiados mediante ensayo cometa neutral. Como era de esperar, la radiación 3GY (rayos X) induce daño en el ADN como se ha representado por el momento media cola mayor en las células neuronales irradiados. Se muestra el momento de la cola media (+ / - error estándar), ** P <0,01.
Tabla 1. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
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Discussion
El ensayo de cometa tiene la capacidad única de análisis de células individuales. Esto es ventajoso en la identificación de las subpoblaciones de células que muestran una respuesta diferencial a los agentes citotóxicos. A pocas limitaciones prácticas tienen que ser tomadas en cuenta. El número de células que pueden ser evaluados individualmente puede variar dependiendo de la persona. El tamaño de la muestra debe ser mayor si existe una variación en el daño del ADN dentro de una población. Viable sola célula de suspensión es crítica para este ensayo ya que la presencia predominante de células necróticas o apoptóticas se sumará a error. Los pasos lisis y la electroforesis se deshace de las células apoptóticas, pequeños fragmentos de ADN (menor que 50 kb), y el ADN mitocondrial. Por lo tanto, no son detectados por el ensayo de cometa 1,3-11.
Como se mencionó anteriormente, el ensayo de cometa es una manera eficaz de detectar saltos de simple y doble hebra, incluyendo álcali-lábiles y sitios DNA-DNA/DNA-protein enlaces cruzados en laDNA. Aquí hemos descrito dos protocolos distintos: el ensayo alcalina permite la detección de roturas de cadena individuales, así como roturas de doble cadena, mientras que el ensayo cometa neutral sólo permite la detección de roturas de cadena doble. Modificado por la enzima ensayo cometa puede sido aplicado para detectar aductos oxidativo en el ADN. Por ejemplo, el tratamiento con Endo III (endonucleasa) y hOGG1 (glycosylase) reconocer oxidado pirimidinas incluyendo glicol timina y uracilo glicol 12,13 y 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoGua) 14,15 respectivamente. Formamidopirimidina ADN glicosilasa (FPG) se puede utilizar de manera similar. Para este ensayo modificado, el tratamiento con las enzimas precede a la etapa de desenrollado. La adición de la lesión endonucleasas específicas aumenta la sensibilidad del ensayo cometa y 13.
Aquí usamos momento de la cola como el descriptor de daño en el ADN. Momento de la cola se calcula utilizando la siguiente fórmula: porcentaje de ADN en la cola multiplicado por el lenGTH de la cola del cometa 1,3-7. La longitud de la cola del cometa (longitud de la cola) es la distancia desde el centro del núcleo hasta el punto más alejado de la migración del ADN. Longitud de la cabeza es el diámetro del núcleo. Intensidad de cabeza y la intensidad de la cola son las intensidades de los píxeles medias en la cabeza y la cola del cometa, respectivamente. El área total es el área superficial total de la cometa 1,3-7.
Aunque hay otros métodos para medir el daño del ADN, tales como γ-H2AX focos tinción y electroforesis de campo pulsado en gel, estos ensayos tienen sus inconvenientes, así 4,6,11,16,17. Por ejemplo, el estrés de replicación es a menudo un factor de confusión en la medición de los niveles de γ-H2AX 18. Desde la formación de γ-H2AX focos depende de reclutamiento de las proteínas de reparación del ADN, la falta de contratación de las proteínas de reparación del ADN y una estructura de la cromatina condensada puede causar falsamente bajos niveles de γ-H2AX focos también. De manera similar, gel de campo pulsado electrofisiológicooresis es muy intensiva en tiempo y sólo es beneficiosa para la separación de moléculas de ADN grandes 19,20. Por lo tanto, el ensayo de cometa es un relativamente fácil, eficiente y de bajo costo, medida directa y sensible de daño y reparación del ADN 10,11,21.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Impact Award del Departamento de Oncología de Radiación de la Universidad de Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, la Fundación de Niños con Cáncer de lucha, y el Ángel de Gabrielle Foundation (para ESY.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
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