Summary
Le test des comètes est un moyen efficace de détection de ruptures simple et double brin, y compris alcali-labiles sites et DNA-DNA/DNA-protein liens croisés sur l'ADN dans toutes les cellules, y compris les neurones hippocampiques. La méthode tire parti de la migration différentielle de l'ADN dans un champ électrique dû à des différences de quantité de dommages de l'ADN.
Abstract
Un certain nombre de médicaments ciblent les voies de réparation de l'ADN et induire des cellules tuer en créant des lésions de l'ADN. Ainsi, des procédés pour mesurer directement lésions de l'ADN ont été largement évalués. Les méthodes traditionnelles sont longs, coûteux, et nécessitent beaucoup de ressources de réplication des cellules. En revanche, le test des comètes, un essai de cellule unique électrophorèse sur gel, est plus rapide, non invasif, peu coûteux, mesure directe et sensible de dommages à l'ADN et la réparation. Toutes les formes de dommages à l'ADN ainsi que réparation de l'ADN peut être visualisé au niveau de la cellule unique à l'aide de cette technique puissante.
Le principe qui sous-tend le test des comètes est que l'ADN intact est très ordonnée alors dommages à l'ADN perturbe cette organisation. Les suintements d'ADN endommagés dans la matrice d'agarose et lorsqu'il est soumis à un champ électrique, l'ADN chargé négativement migre vers la cathode qui est chargée positivement. Les brins d'ADN endommagés grands ne sont pas en mesure de migrer loin du noyau. Dommages à l'ADNcrée des fragments d'ADN plus petits qui voyagent plus loin que l'ADN intact. Comet Assay, un logiciel d'analyse d'images, mesures et compare l'intensité globale fluorescent de l'ADN dans le noyau avec l'ADN qui a migré hors du noyau. Signal fluorescent de l'ADN migré est proportionnelle à endommager l'ADN. ADN queue plus claire signifie lésions de l'ADN accrue. Certains des paramètres qui sont mesurés sont actuellement queue qui est à la fois une mesure de la quantité d'ADN et de la distribution de l'ADN dans la queue de longueur de queue, et le pourcentage d'ADN dans la queue. Ce test permet de mesurer réparation de l'ADN ainsi car la résolution des lésions de l'ADN signifie la réparation a eu lieu. La limite de sensibilité est d'environ 50 cassures par 1,2 cellule diploïde mammalien. Les cellules traitées avec des agents endommageant l'ADN, tels que l'étoposide, peut être utilisé en tant que contrôle positif. Ainsi, le test des comètes est une procédure rapide et efficace pour mesurer dommages à l'ADN.
Protocol
1. Culture cellulaire
- Cellules neuronales Culture et les traitent selon les besoins.
- Récolte des cellules dans des tubes de 15 ml: médias aspirés, rincer avec du tampon phosphate salin (PBS, de calcium et de magnésium libre), ajouter la trypsine, la collecte en tubes de 15 ml et neutraliser la trypsine avec appropriées milieux contenant du sérum.
- Centrifuger à 1000 xg pendant 5 min.
- Aspirer les médias.
- Remettre en suspension les cellules dans du PBS.
- Centrifuger à 1000 xg pendant 5 min.
- Aspirer les médias et remettre les cellules en PBS frais.
- Compter les cellules à l'aide d'un hématimètre ou votre compteur de cellules préféré.
- Des échantillons de cellules doit être préparée immédiatement avant de commencer le dosage.
- Tous les échantillons doivent être manipulés à la lumière noire ou jaune pour éviter d'endommager l'ADN de la lumière ultraviolette.
2. Comet Assay
1. Préparation de la lame
- Faire fondre 1% (1 g / 100 ml 1X Tris Base, acide borique, de l'EDTA, la tuberculose agaroseE) dans un four micro-ondes pendant 3 min jusqu'à ce que tous les granules disparaissent.
- Tremper les lames dans l'agarose fondu et essuyez un côté nettoyer avec un Kimwipe. Laisser l'agarose sécher à l'air d'un film transparent. Cela peut être fait à l'avance et les glissières peuvent être stockés.
2. Comet Assay neutre
- Une solution de lyse froid (2,5 M NaCl, 100 mM d'EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% de sodium lauryl sarcosinate, et 1% de Triton X-100, pH 10), à 4 ° C pendant au moins 1 heure avant utilisation.
- 2.2.2. Faire fondre 1% d'agarose à bas point de fusion (1 g / 100 ml dans 1X Tris Base, de l'acide borique, de l'EDTA) dans un micro-ondes pendant 3 minutes jusqu'à ce que tous les granules disparaissent. L'agarose a besoin d'être refroidi à 37 ° C dans un bain d'eau pour éviter l'induction artificielle de la queue de la comète. Idéalement, l'agarose doit être refroidie pendant une demi-heure avant utilisation.
- 2.2.3. Diluer la suspension de cellules de sorte qu'il ya 100.000 cellules par ml. Mélanger la suspension cellulaire avec le faible point de fusion d'agarose (à 37 ° C)un ratio de 1:10 (v / v), homogénéiser brièvement au vortex, et immédiatement pipette 50 ul sur la diapositive Comet. Utiliser le côté de la pointe de pipette pour répandre la suspension de cellules uniformément sur toute la surface de l'échantillon. Chaque groupe de traitement doit être au moins en triple exemplaire.
- Lieu glisse à plat au réfrigérateur pendant 30 min jusqu'à ce que le cercle apparaît dans la périphérie de la lame.
- Prérefroidissement la solution de lyse et les diapositives plonger dans cette solution pendant 30 min à l'obscurité à 4 ° C (ou au réfrigérateur).
- Décanter ou aspirer la solution de lyse et ajouter 1X tampon d'électrophorèse neutre (Tris base, l'acide borique, de l'EDTA, 1X TBE). Laisser les lames dans cette mémoire tampon pendant une demi-heure au réfrigérateur.
- Ajouter prérefroidi tampon 1X électrophorèse neutre (TBE) dans la chambre d'électrophorèse, placer les lames dans plateau coulissant électrophorèse. Aligner lames afin qu'elles soient équidistantes à partir d'électrodes.
- Verser 1X tampon d'électrophorèse neutre jusqu'à 0,2 cm au-dessus des diapositives. Excès de tampon sera interFère par électrophorèse.
- Régler la tension d'alimentation de 1 V par cm (mesurée électrode à l'autre) et tourner pendant 30 min à 4 ° C (ou la chambre froide) dans l'obscurité.
3. Comet Assay alcalin
- Une solution de lyse froid (2,5 M NaCl, 100 mM d'EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% de sodium lauryl sarcosinate, et 1% de Triton X-100, pH 10), à 4 ° C pendant au moins 1 heure avant utilisation.
- Faire fondre 1% d'agarose à faible point de fusion (1 g / 100 ml 1X Tris Base, de l'acide borique, de l'EDTA) dans un micro-ondes pendant 3 minutes jusqu'à ce que tous les granules disparaissent. Puis refroidir dans un bain à 37 ° C pendant au moins 30 min.
- Combiner des cellules à 1 x 105 / ml avec fondu à faible point de fusion d'agarose (à 37 ° C) dans un rapport de 1:10 (v / v), homogénéiser brièvement au vortex, et immédiatement pipette 50 ul sur la diapositive Comet. Utiliser le côté de la pointe de pipette pour répandre la suspension de cellules uniformément sur toute la surface de l'échantillon. Chaque groupe de traitement doit être au moins en triple exemplaire.
- Lieu glissées plat au réfrigérateur pendant 30 min jusqu'à ce que le cercle apparaît dans la périphérie de la lame.
- Immerger les lames dans une solution de lyse refroidies et laisser à 4 ° C pendant 1 heure ou toute la nuit dans l'obscurité.
- Sortir les lames de la solution de lyse, les lames de vidange et de rinçage une fois avec du tampon de neutralisation froid pendant 5 minutes pour éliminer le détergent résiduel et les sels avant l'étape de déroulement en milieu alcalin.
- Placer les lames dans une chambre remplie d'électrophorèse sur gel d'électrophorèse tampon prérefroidi fraîchement préparé (300 mM NaOH, 1 mM EDTA,> 13 pH) ne doit pas dépasser 0,5 cm au-dessus des diapositives. Aligner lames afin qu'elles soient équidistantes à partir d'électrodes.
- Laissez diapositives s'asseoir dans le tampon alcalin pendant 30 min dans l'obscurité pour permettre déroulement de l'ADN et l'expression de l'alcali-responsable des dégâts.
- Régler la tension d'alimentation de 1 V par cm (mesurée électrode à l'autre) et tourner pendant 30 min à 4 ° C (ou la chambre froide).
4. Fixation et StaLes cellules sable de l'examen
- Égoutter l'excès de tampon d'électrophorèse
- Plonger les lames dans prérefroidi de l'eau distillée pendant 5 min à température ambiante.
- Immerger les lames dans prérefroidi l'éthanol à 70% pendant 5 min à température ambiante.
- Des échantillons secs pendant la nuit. Ne pas exposer à la lumière des diapositives. Échantillons peuvent être conservés pendant des mois à la température ambiante avant de marquer à ce stade.
- Colorer les lames en les immergeant dans SYBR Green (dilué dans du PBS 1X) pendant 20 min au réfrigérateur.
- Retirer les lames et laissez-les sécher complètement dans le noir. L'agarose devient transparent lorsqu'il est complètement sec.
4. Acquisition et analyse d'images
- Acquérir des images à l'aide microscope à fluorescence réglé sur le filtre vert (Zeiss AxioVision) et d'analyser l'aide du logiciel Comet Assay (Perceptive Instruments).
- Cliquez sur "tête de comète" (le noyau) et le logiciel calcule les paramètres, y compris le moment et le montant moyen de la queue de l'ADN dans lenoyau.
- Analyser au moins 200 cellules par traitement.
- Exporter des données vers Microsoft Excel.
- Calculer la moyenne instant queue pour chaque groupe de traitement et les données des placettes, le cas échéant.
5. Les résultats représentatifs
Un exemple d'analyse test des comètes sur des cellules neuronales est illustré à la figure 2 et la figure 3. Dans ce cas, l'irradiation des cellules neuronales induit dommages à l'ADN. Que les cellules sont soumises au champ électrique, l'ADN migre à des vitesses différentes en raison des différences de taille, qui est ensuite analysées en utilisant le logiciel essai de comète. Plus le dommage à l'ADN, l'ADN migre plus loin la hors du noyau. Cela diminue l'intensité de fluorescence dans le noyau qui est ensuite capté par le logiciel et les résultats dans le moment plus de queue. Tableau 1 présente un tableau représentant de l'analyse et de test des comètes figure 4 montre une représentationgraphe comparant sentant dommages à l'ADN dans les cellules neuronales après une radiothérapie, telle que mesurée par le test des comètes.
Figure 1. Schéma du test des comètes. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Images représentatifs de cellules neuronales (A) et sans (B) avec queue de comète.
Figure 3. Analyse test des comètes en utilisant le logiciel Comet Assay. (A) des captures d'écran représentatifs de l'image acquise avec Carl Zeiss microscope à fluorescence et analysées à l'aide CometLogiciel de test. (B) En cliquant sur le noyau ou la «tête de comète" (entouré en vert) génère une carte graphique fluorescent et (entouré en jaune) et une table (C) de données (entouré en rouge). Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 4. Graphe représentant obtenue en reportant le moment queue moyenne obtenue par l'analyse de dommages à l'ADN dans irradiés et non irradiés en utilisant des cellules neuronales test des comètes neutre. Comme prévu, le rayonnement 3Gy (rayons X) induit dommages à l'ADN tel que représenté par le moment queue moyenne plus élevée dans les cellules irradiées neuronales. Montré est le moment queue moyenne (+ / - erreur standard), ** P <0,01.
Tableau 1. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le test des comètes a la capacité unique d'analyse de cellules individuelles. Ceci est avantageux pour l'identification des sous-populations de cellules qui démontrent une réponse différentielle aux agents cytotoxiques. A quelques limitations pratiques doivent être prises en compte. Le nombre de cellules qui peuvent être évalués individuellement peuvent varier selon les individus. La taille de l'échantillon doit être augmenté s'il ya variation des dommages à l'ADN dans une population. Viable suspension à cellule unique est critique pour ce dosage depuis présence majoritaire de cellules nécrotiques ou apoptotiques vont ajouter à l'erreur. Les étapes de lyse et l'électrophorèse se débarrasse des cellules apoptotiques, des fragments d'ADN de petite taille (inférieure à 50 kb), et l'ADN mitochondrial. Ainsi, ils ne sont pas détectés par le test des comètes 1,3-11.
Comme mentionné ci-dessus, le test des comètes est un moyen efficace de détection de ruptures simple et double brin, y compris alcali-labiles sites et DNA-DNA/DNA-protein liens croisés sur leADN. Ici, nous avons défini deux protocoles distincts: le dosage alcalin permet la détection des cassures simple brin ainsi que des ruptures double brin, alors que le test des comètes neutre ne permet que la détection des cassures double brin. Enzyme modifiée test des comètes peuvent été appliquée pour détecter les adduits à l'ADN par oxydation. Par exemple, le traitement par Endo III (endonucléase) et hOGG1 (glycosylase) reconnaissent oxydé pyrimidines y compris glycol de thymine et uracile glycol 12,13 et 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoGua) 14,15 respectivement. Formamidopyrimidine ADN-glycosylase (FPG) peut être utilisé de manière similaire. Pour ce dosage modifié, le traitement par les enzymes précède l'étape de déroulement. L'ajout d'une lésion spécifiques des endonucléases augmente la sensibilité du test des comètes et 13.
Ici, nous utilisons actuellement queue comme le descripteur de dommages à l'ADN. Queue instant est calculé selon la formule suivante: pourcentage d'ADN dans la queue multiplié par la length de la queue de la comète 1,3-7. La longueur de la queue de comète (longueur de la queue) est la distance entre le centre du noyau à la plus éloignée du point de migration de l'ADN. Longueur de la tête est le diamètre du noyau. Intensité de la tête et la queue sont d'intensité intensités des pixels moyennes dans la tête et la queue de la comète, respectivement. La superficie totale est la surface totale de la comète 1,3-7.
Bien qu'il existe d'autres méthodes de mesure de dommages à l'ADN tel que γ-H2AX coloration foyers et l'électrophorèse en champ pulsé, ces tests ont leurs inconvénients ainsi 4,6,11,16,17. Par exemple, le stress de réplication est souvent un facteur de confusion dans la mesure de γ-H2AX les niveaux 18. Depuis la formation de γ-H2AX foyers est dépendante du recrutement de protéines de réparation d'ADN, incapacité à recruter les protéines de réparation d'ADN et une structure de la chromatine condensée peut conduire à tort à faible γ-H2AX niveaux foyers ainsi. De même, en champ pulsé electrophoresis est très fastidieux et n'est bénéfique que pour la séparation de grosses molécules d'ADN 19,20. Ainsi, le test des comètes est relativement facile, efficace et peu coûteux, mesure directe et sensible de dommages à l'ADN et la réparation 10,11,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le prix IMPACT du Département de radio-oncologie de l'Université d'Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, la Fondation du cancer de l'enfance de combat, et l'Ange Gabrielle Fondation (à ESY.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L. Impact of the comet assay in radiobiology. Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al. [gamma]H2AX and cancer. Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).
- Finney, M. Pulsed Field Gel Electrophoresis. Current protocols in molecular biology. , (2000).
- Electrophoresis, F. I., et al. Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
