Количественная клубочковой проницаемости Флуоресцентные макромолекул Используя 2-фотонной микроскопии в Мюнхене крыс Wistar

Summary

Техника использования высокого разрешения intavital 2-фотонной микроскопии непосредственно визуализировать и количественно gloemrular поверхность фильтрации в клубочках. Этот метод позволяет прямое определение характеристик проницаемости макромолекул в нормальных и болезненные состояния.

Abstract

Почки заболеваниях, сопровождающихся потерей мочи необходимы большие макромолекулы, такие как сывороточный альбумин, долгое время считалось, вызваны изменениями в проницаемости барьера состоит из подоциты, сосудистых эндотелиальных клеток и базальной мембраны, работающих в унисон. Данные из нашей лаборатории с использованием прижизненной 2-фотонной микроскопии показало барьер более проницаемым клубочковой фильтрации (GFB), чем считалось ранее в физиологических условиях, с поиска фильтруются альбумина, происходящих в раннем подмножество клеток, называемых клетками проксимальных канальцев (PTC) ^{1,2, 3.}

Предыдущие методы, используемые для изучения почечной фильтрации и создание характеристику фильтрации барьера, связанного микропункции просвета этих первых трубчатых сегментов с отбором проб флюида содержание и анализ ^4. Эти исследования определяется концентрация альбумина в просвете жидкостью практически не существует; соответствующие теснона то, что обычно обнаруживаются в моче. Тем не менее, характеристики полимеров декстрана с определенными размерами по этой методике показали те, размеры которого аналогичны для сывороточного альбумина имели более высокие уровни в просвете канальцев и мочи; предлагая повышенную проницаемость ^5.

Здесь, представляет собой подробное описание техники, используемой непосредственно визуализировать и количественно клубочковой проницаемости люминесцентные альбумина в естественных условиях. Этот метод позволяет обнаруживать фильтрованной альбумина через фильтрационный барьер в пространство Боумена (начальное камеры мочевого фильтрации), а также позволяет количественно альбумина реабсорбции проксимальных канальцев и визуализации последующего альбумин трансцитоза ^6. Отсутствие флуоресцентный белок по позже трубчатых сегментов пути в мочевой пузырь подчеркивает эффективность поиска пути в ранее проксимальных сегментах канальцев. Кроме того, когда эта методика была применена для определения проницаемостидекстранов имеющие такого же размера, альбумина практически одинаковые значения проницаемости были зарегистрированы ^2. Эти наблюдения непосредственно поддерживают необходимость расширения в центре внимания многих протеинурической почечных заболеваний включены изменения в проксимальных канальцах клетки мелиорации.

Protocol

1. Сопряжение Крысы сывороточный альбумин сульфо-родамина 101 сульфонилхлорид (Texas Red)

1. Растворяют 100 мг крысы сывороточного альбумина (RSA) в 6,667 мл 100 мМ бикарбонат натрия рН 9,0; конечной концентрации 15 мг / мл в 50 мл коническую трубку.
2. Место решения в лед / вода стакан и охлаждают до от 0 до 4 ° С.
3. Добавить 200 мкл высокое качество безводном диметилформамиде (ДМФ) до 10 мг флакон Texas Red сульфонилхлорид (ЦДЗТ); вихрь на среде в течение 15 сек.
4. Vortex решений RSA на средних и добавить растворенный ЦДЗТ.
5. Обруч 50 мл конические в фольгу (Parafilm может быть использована для обеспечения герметичного уплотнения образуется), место горизонтально в ведро льда с / лед и место только на коромысло для перемешивания раствор медленно (во избежание образования пузырьков), позволяет продолжать реакцию при температуре от 0 до 4 ° С в течение 1 часа.
6. Сделать 5 л 0,9% солевой раствор, и влажный 50 кДа молекулярный вес отрезать камеру, которая может быть либо) диализной мембраны с клипами, б) диalysis трубопроводов, что в числах с плавающей точкой-анализатора, или в) слайд-анализатора-кассеты (все подходит для удаления неконъюгированное ЦДЗТ).
7. Место реакционной смеси в камере диализа и место в 5 л контейнер W / 0,9% солевой раствор, диализ в течение ночи при 4 ° С с использованием легкого перемешивания мешалку.
8. не изменим 5 л диализного раствора утром и в конце дня, пока ночь результаты инкубации практически нет изменения цвета (Обычно на это уходит ~ 48 часов, по крайней мере 4 биржи). Кроме того, с MWCO 50 кДа так близко к МВТ RSA, 66kDa, возможно, никогда не получения прозрачного раствора, это будет зависеть от распределения размера пор мембраны; 60 ч и 5 обменов более чем достаточно времени.
9. Измерение объема и разделите начальный вес 100 мг по объему, чтобы дать приблизительное концентрации TR-RSA; обычно варьируются от концентрации 10-13 мг / мл. Окончательный красителя: альбумина соотношение должно быть ~ 4:01, 1 флуорофором за 15,000 Дальтон белка МВт. Хранить при температуре 4 ° С; никогда не замерзают TR-RSA решение, так как в результате фрагментации, которые могут возникнуть изменит значения проницаемости.

2. Подготовка Перевернутый микроскоп для работы с изображениями / Микроскоп Настройки

1. Место ~ 4-7 части автоклава лента (примерно ¾ "длиной) идеально уложены друг на друга в 50 мм чашки с диаметром 40 мм покровным дно (покровное нижней тарелки). Они должны быть размещены ближе к одному из краев так, чтобы края ленты будут вступать в контакт с краем кривизны почек, но не блокируют цель пути света (фиг.1А и 1В); больше крыс потребует большего пространства между лентой и край тарелки.
2. Место 2 Repti-Therm колодки рядом со сценой рядом с 50 мм блюдо (рис. 1А). Наведите куртки потепления воды одеяло на сцене.
3. Повысьте эффективность при сборе изображений по обеспечению цель башни имеет 10x Воздух OR 20x (воздух или погружения в воду) объективные и более мощный цель погружения в воду собирать изображения для количественного определения.
4. Во время съемки наиболее эффективный способ добавить воды к цели является, чтобы повернуть их в сторону и добавить воды, используя 1 мл шприц с длинной части PE-200 трубки, которая может достичь вершины целей.
5. Установите интенсивность возбуждения лазерным 10watt до ~ 15-20%, используя фильтры нейтральной плотности на программное обеспечение. Арсенида галлия, фосфида без descanned фотоприемников установлены в 750, чтобы собирать зеленые выбросов, и 625 для сбора красно выбросов. Синий излучение (например, окрашивающим ядра, Hoechst 33342) собраны с использованием стандартного nondescanned мультищелочной детектор с установкой между 750-800.
6. Для обеспечения правильного сбора низкой интенсивности выбросов в пространстве Боумена, убедитесь, что нижний пределы детекторы устанавливаются так, чтобы не исключать эти ценности. Визуальный предупредительные маркеры укажет, если чувствительностьзаданное значение слишком мало, и эти значения даются интенсивности нулевого значения.
7. Загрузите 1 мл шприц с ~ 5-8 мг флуоресцентного раствор альбумина разбавляют 0,9% стерильного физиологического раствора, чтобы поднять общий объем до 1 куб.

3. Разоблачение почек у крыс Вистар Мюнхена прижизненной 2-Фотон изображений

1. Начнем с предварительно анестезированных крыс использованием пентабарбитола (50 мг / мл, 120 μl/100 г веса тела), инактином (130 мг / мл, 120 μ/100 г веса тела) или изофлуораном (5% индукции, 1,5 до 2,5% техническое обслуживание), доступ пребывающего венозной линии (как яремную или бедренную венозную), а левый фланг побрился от чуть ниже грудной клетки чуть выше левого бедра.
2. Поместите плоскую крысы на правый бок так, чтобы левая, бритая стороной вверх; убедиться, что это на стол, с его вытянутой позе, а не присел, с передними лапами, касаясь друг друга и задних лап соприкасаются друг с другом (рис. 2А). Очень осторожно ощупывать чувствовать почки чтобы определить, где он, естественно, лежит в забрюшинного пространства и нарисовать прямую линию, параллельную тела (от грудной клетки до бедра), используя Шулера (рис. 2А).
3. Возьмите кожу с парой зубчатых щипцов, и ущипнуть кожу вдоль нарисованной линии с помощью пары кровоостанавливающие раздавить ткани и предотвращения кровотечения. Сокращение вдоль разреза с помощью пары хирургических ножниц. Дробление внешней кожи и мышечные слои до резки позволит резко сократить и, как правило устранить кровотечение.
4. Повторите эту процедуру для наружного слоя мышцы, который является тонким.
5. Для разрез во внутренний слой мышц, который будет подвергать брюшины, повторно пальпации почки оценить величину. Зажмите линия разреза меньше, чем почек; обеспечение разрез только по почке. Лучше всего, чтобы сделать этот разрез слишком малы и сделать его больше, если необходимо. Если это сделано слишком большой, наложение швов не требуется.Этот последний разрез является критическим, слишком далеко в любом направлении повлияет стабильность на сцене и вызывают либо артефакты движения от дыхания (лучшем случае), либо растянуть почечной ножки и неблагоприятно снижение почечной перфузии (наихудший сценарий).
6. Найдите почек (как показано на рисунке 2В) и сцепления окружающего жира с помощью щипцов, работает в направлении нижнего полюса почки в перебирая руками моды.
7. Как только нижний полюс почки достигнута, осторожно потяните почку через разрез в то время как очень нежно сжимая ниже почки экстериоризоваться. Если разрез слишком мал, раздавить мышечного слоя и сократить, чтобы расширить его, повторить процедуру экстериоризоваться почки.

4. Размещение крыс Вистар Мюнхена в рабочую область для работы с изображениями

1. Поместите почек к краю покровного стекла блюдо с почками слегка наклоненный в сторону спинного (задняя сторона) у крыс так брюшной стороне почкой яы что делает контакт с блюдом покровного нижней (рис. 1А). Добавить нагретый, стерильный 09.% Солевого раствора к блюду.
2. Посмотрите в 10x или 20x объективных и для обнаружения движения. Если при обнаружении движения, рулон крысы Слегка так грудной клетки находится дальше от тарелки нижнего покровного, убедитесь, что почки как можно ближе к краю блюда, не растягивая почечной ножки (рис. 1В).

5. Получение изображений для количественной почечной проницаемости Альбумин

1. Расчет клубочковой проницаемостью (Glomeruluar Коэффициент просеивания; GSC) любой макромолекулы потребует принятия ссылкой фоне изображения отдельных клубочков до инфузия флуоресцентной молекулой. Если Ваш Микроскоп оснащен моторизованным этапе способна маркировки места, найти и центром отдельных клубочков использованием меньшей мощности объективным и отметить каждом месте. Двойного прохода флуоресцеина / Родамин эпифлуоресцентной ФильТер идеально подходит для этой процедуры либо хотя эмиссионный фильтр будет работать (фазового контраста или других не-флуоресценции источники освещения не будет работать). Клубочках будут выглядеть как пустые кольцевых структур окружении проксимальных канальцев, имеющий характеристическую желто-оранжевого autoflourescence при просмотре через двойной фильтр нижних частот.
2. Если ваш микроскоп не имеет моторизованный этапе сканирования почки в растр с низким объективной силы и сделать элементарную карту, где отдельные клубочки расположены, опираясь на природные достопримечательности, такие как крупные поверхностные кровеносные сосуды расположены над почечной капсулы или жира патчей.
3. Включите башни к высшей цели власти погружением в воду и принимать 3D наборов данных каждого клубочка убедившись капиллярных петель и пространстве Боумена четко видны. Использование палитры псевдоцвете (нечто иное, чем ч / б) поможет визуализировать этих структур.
4. Фокусировка в на поверхностные кровеносные сосуды медленно влить в тОн люминесцентные альбумина убедившись времени дается, чтобы позволить для системного распределения. Для молекул с низкой GSC важно, чтобы максимизировать интенсивность значения в плазме, но не доводить до уровней, которые будут насыщать фотоприемников в микроскоп. Это повышает выявляемость фильтруется молекул. Примечание: там, как правило 5-7 сек промежуток между временем люминесцентные альбумина вводят в раз он появляется на экране (приобретение полных кадров в ~ 1 кадр / сек).
5. Подождите приблизительно 10 минут, чтобы позволить любому потенциальному низкомолекулярные фрагменты весом, чтобы очистить прежде, чем приобрести 3D объемов на 1 мкм периодичностью, которая будет использоваться при расчете альбумина GSC. Как правило, процедить Симонсена Мюнхена крыс Вистар имеет гораздо меньше клубочки поверхности, поэтому все, что могут быть визуализированы в образ будут включены и количественно. Штамм Frömter имеет гораздо большее число, поэтому мы ограничиваем число количественно до ~ 10.
6. В конце исследования крыс умерщвляли с помощью передозировки anesthetмикросхемы, используемые в исследовании. Двойной pneumothoracotamy выполняется для обеспечения эвтаназии.

6. Расчет GSC для люминесцентных Альбумин из 3D Объемы

1. Использование Metamorph ПО для обработки изображений загрузки 3D наборов данных для каждого клубочка, как фона, так и настройте принято после инфузии флуоресцентного альбумина.
2. В том, содержащий флуоресцентный альбумина найти поверхностные капиллярные петли с достаточным количеством места пустого пространства между его определить поля и краем капсулы Боумена.
3. На заднем плане объема найдите же фокальной плоскости, которая должна содержать все визуальные сигналы из альбумин содержащих изображения. Выберите Ваш регион в капиллярной петле интерес и обратите внимание на среднее значение интенсивности. Затем выберите регион в пространстве Боумена и обратите внимание на среднее значение интенсивности. Они будут использоваться в качестве фоновых значений.
4. Для количественного, выберите подобное региона в пространстве Боумена в альбумин Containing изображения. Делайте это в течение по крайней мере двух других регионах взять среднее значение средней интенсивности в пространстве Боумена.
5. Выберите капиллярные петли с самыми яркими плазмы интенсивность и нарисовать область вокруг него. Следующая помощью пороговой функции, выделить яркие значения в циркулирующей плазмы, избегая темных полос, которые циркулируют РБК. Обратите внимание на средних значений интенсивности выбранного места плазмы. Важно предпочтительно выбирать ярких областях плазмы, поскольку факторы в крови будет служить лишь вызвать и недооценке плазменные уровни флуоресценции.
6. Использование электронных таблиц Microsoft Excel введите значения для расчета GSC где:

Representative Results

На рисунке 3 показан пример изображения, снятого с поверхности клубочка из Мюнхена крысы линии Вистар Frömter и шаги, предпринятые для определения проницаемости флуоресцентных альбумина. GSC значение для альбумина 0,0111 полученные для этого отдельные клубочки падения в диапазоне видели в этом штамме Мюнхена крыс линии Вистар, когда в условиях ФРС ^3. Стабильность видели в этих изображениях связано с тщательного планирования и исполнения поручений изображенные на рисунках 1 и 2. Как уже говорилось ранее, размещение разреза используются в экстериоризации почек является наиболее важным шагом в производстве устойчивых изображений бесплатно артефактов движения.

Рисунок 1. Подробную схему размещения ориентациикрыс на столик микроскопа до визуализации. Осторожно положите стороны почек крыс вниз (как показано на) над Repti Therm-грелки с почкой, лежащего в покровных блюдо. Раскатать почки наружу (*), так что брюшная сторона касалась покровного дно и происходит контакт с автоклава ленты (AT). Чтобы свести к минимуму дыхания индуцированного движения, рулон крысы вперед (**) так, чтобы грудная клетка из области непосредственно над покровным блюдо. Заполните блюдо с 0,9% стерильного физиологического раствора и крышка с водяной рубашкой. Используйте термометр для контроля ректальной температуры и поверните Repi-Therm колодки и выключать по мере необходимости. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

: SRC = "/ files/ftp_upload/50052/50052figure2highres.jpg" />
Рисунок 2. . Экстериоризацию почки в Мюнхене крысы линии Вистар перед размещением на столике микроскопа наркозом крысу помещают с левой до размера; области между грудной клеткой и верхней части бедра побрился (показаны серым цветом, А). Как только последовательные разрезы сделаны, чтобы прорваться через кожу, то внешняя внутреннего слоя мышц как показано линией перемещения почки в. Почек с соответствующим пери-почечная жира должно быть видно (B). С помощью пинцета, жир зажат в передаче рук моды, пока нижний наиболее полюсом не будет достигнута (BE). Осторожно сожмите площадь под почкой, потянув на жир экстериоризоваться. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

052/50052figure3.jpg "Alt =" Рисунок 3 "FO: Content-ширина =" 5.5in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50052/50052figure3highres.jpg "/>
Рисунок 3. Одноместный самолет изображения взяты из 3D показывающие объемы клубочек у крыс Вистар Мюнхена. Панели & B шоу фоновых изображений, один захвачен в ~ 12 мин после вливания Texas Red Крыса сывороточного альбумина (TR-RSA) в черно-белой. Обратите внимание на отсутствие заметного интенсивность капиллярных петель (CL) или пространство Боумена (BowSp) в фоновом изображении (A). Панель С показана область взяты из панели в псевдоцвете лучше представить себе, низкой интенсивности фоновых уровней ткани. Здесь небольшой области обращается в капиллярной петли (дольше область) и в пространстве Боумена оценить уже существующие флуоресцентный уровней интенсивности, которые необходимо вычесть из значений, полученных после инфузии флуоресцентный белок. Панели D и Е принимаютN от панели В и показано на псевдо. Три небольших регионах, представляющих интерес обращается в пространстве Боумена используются для расчета средней интенсивности флуоресцентного альбумина, который, перемещаемых через фильтрационный барьер (D). Средние значения интенсивности для отдельных регионах были зарегистрированы в выделенной области в рамках "Показать края Статистика" диалоговое окно (панель D '). Для расчета интенсивности циркулирующей плазмы значения в капиллярных петель (CL, в панели E) большой регион будет отображаться поверх яркой капиллярной петли и яркое значения вдоль выделенного использовании пороговой функции (показано оранжевым пикселов). Только значения интенсивности пикселей выделяется оранжевым цветом будет сообщать независимо от формы или размера окружающего региона. Панель Е 'показывает сырые средние значения интенсивности альбумина в капиллярных петель, отметьте проверил "Использовать порог для измерения интенсивности" окно, которое являетсяпроверено. Панель F показана последовательность значений образуют слева направо, начиная с фоновых значений для капиллярных петель и пространство Боумена, которая вычитается из необработанных значений, полученных в изображениях. После скорректированного значения получены, пространство интенсивность Боумена значение делится на капиллярной значение интенсивности петли, получая клубочковой просеивание Коэффициент которое представляет собой отношение проницаемости; impermeant молекулы имеют значение ноль (0), в то время как те, которые свободно фильтруется имеют значение одного (1). Bar = 20 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 4. Поглощение фильтруется люминесцентные альбумина происходит преимущественно Ян начале сегмента проксимальных канальцев, S1. Панель А показывает поперечное сечение клубочков и S1 сегменте принятых ~ 20 мин после инфузии начальной Texas Red RSA болюса. Открытие пространстве Боумена и заядлый поглощения альбумина (красный) шоу в сегменте S1. Панель В показывает мелкой 20 мкм 3D проекции одного и того же набора данных. Панель С показывает 3D проекции использованием меньшей мощности 20x цели примерно 60 мин после инфузии. Обратите внимание на то же клубочка видно из панелей и В, показанные на C (*) и более высокие уровни альбумина извлечение рассматривать в этом сегменте по сравнению с другими сегментами проксимального канальца. Bar = 20 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Discussion

Шаги отраженных здесь представляют, что мы чувствуем, что те, которые будут производить последовательные и точные значения проницаемости, потому что они обойти ловушки следующие:

1. Рассеяния: использование красного флуорофорам излучающих обеспечить более эффективный сбор света с длиной волны больше фотонов в меньшей степени подвержены разброс. Использование зеленого или синего флуорофорам излучающих представит больший разброс в РКГ из-за усиления колебаний в значениях интенсивности от капиллярных петель и пространстве Боумена ^3.
2. Глубина изображения: хотя в глубине 3D наборов данных обычно собираются (часто 30-45 мкм в общей глубиной), верхняя 10-15 микрон представляют собой наиболее соответствующий координационный глубин для определения значений GSC. Снова с большей глубине происходит снижение чувствительности и увеличение вариабельности из-за разброса фотонов. Более важно, однако, является скученность капиллярных петель, которое происходит Deeper в клубочек. Здесь капиллярных петель выталкиваются вверх близко к краю капсулы Боумена окружающее пространство Боумена. Это увеличивает вероятность случайного выбора области непосредственно над одним из многочисленных подоциты, которые окружают капиллярных петель. Это приведет к недооценке GSC, потому что правда, большей интенсивности отфильтрованного альбумина не будет сообщено. Примечание Панель B и D на рисунке 3 и большое количество пространства присутствует между краем капиллярных петель и краем пространстве Боумена ^3.
3. Выборка: Выбор нескольких регионов в пространстве Боумена обеспечивает наилучшее приближение обнаружения фильтруется уровня альбумина. Важно также, чтобы избежать таких областях, как 11 и 12:00 положение над капиллярных петель. Фокусировка через 3D объем показывает набор капиллярных петель пойманы почти поперек чуть ниже фокальной плоскости. В этой области было дать завышенных GSC значение напереоценив отфильтрованный альбумин. С другой стороны, важно, чтобы выбрать яркая часть плазмы в капиллярных петель лучше определить истинный уровни циркулирующего флуоресцентный белок. Здесь недооценки этих уровней также увеличит GSC путем уменьшения значения в знаменателе уравнения.

Проверка этого метода происходит путем визуализации свободно фильтруется соединение с GSC одного (1). Здесь, концерны, которые постоянно недооцениваем уровень альбумина плазмы, в связи с оптического ограничения ответственности за переоценив альбумина проницаемость, обнуляются ^3. Кроме того, определив GSC значение для 70kDa декстрана, который практически идентичен продукту, полученному путем измерения мочевой клиренс / плазменный уровней и микропункции доказать прижизненной 2-фотонной микроскопии в состоянии корректно определения проницаемости люминесцентные макромолекул ^2. Наконец, способность быстро визуализировать йэлектронной клубочков и трубчатых сегментов вдоль пути фильтрата с высокой степенью разрешения, 2-фотонной микроскопии стоит уникальными возможностями для количественной оценки важности барьер клубочковой фильтрации и PT в определении protienuria и альбуминурия.

Протоколов, описанных здесь, основаны на использовании 2-Фотон система с перевернутой этап, который имеет преимущества в простоте хирургических процедур, связанных крысы и размещение на сцене. Для получения информации об использовании 2-Фотон системы с вертикальным этапе обратиться к главе, Dunn и соавт. ⁷ в Current Protocols в цитометрии (2007).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07