Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

שינוי ורקומבינציה גנטי של תרבויות איברי בלוטות רוק

Published: January 28, 2013 doi: 10.3791/50060
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University at Albany, SUNY
* These authors contributed equally

Summary

טכניקה גנטית כדי לתמרן בתוך כל תאי האפיתל

Abstract

מסעף המורפוגנזה מתרחש במהלך ההתפתחות של איברים רבים, ובלוטת הלסת התחתונה העכבר העוברית (SMG) היא מודל קלסי ללימוד הסתעפות המורפוגנזה. בSMG פיתוח, תהליך זה כרוך איטרטיבי צעדים של ניצן אפיתל והיווצרות דביקה, סופו של דבר לתת לעלייה לרשת מסועפת של acini מורכבת וצינורות, המשמשת לייצור ולשנות / להעביר את הרוק, בהתאמה, לחלל הפה 1 - 3. קרום אפיתל הקשורים למרתף וההיבטים של תא mesenchymal, כוללים תאי mesenchyme, גורמי גדילה והתאי, המיוצרים על ידי תאים אלה, הם קריטיים למנגנון ההסתעפות, למרות כמה האירועים התאיים ומולקולריים מתואמים נשאר הבינו היטב 4 . המחקר של המנגנונים המולקולריים נהיגת התקדמות המורפוגנזה אפיתל הבנת מנגנוני התפתחות שלנו ומספק תובנה regener האפשריגישות רפואה ative. מחקרים כאלה כבר הקשו בשל העדר השיטות יעילות למניפולציה גנטית של האפיתל הרוק. נכון לעכשיו, תמרת adenoviral מייצגת את השיטה היעילה ביותר להכוונת תאי אפיתל בבלוטות למבוגרות in vivo 5. עם זאת, בexplants העוברי, mesenchyme צפוף וקרום המרתף המקיף את תאי האפיתל מונעים גישה נגיפית לתאי האפיתל. אם mesenchyme מוסר, האפיתל ניתן transfected באמצעות adenoviruses, ויסודות אפיתל יכולים לחדש את הסתעפות המורפוגנזה בנוכחות Matrigel או laminin-111 6,7. צמיחת הגמד אפיתל mesenchyme ללא דורשת גם תוספת נוספת עם גורמי גדילה מסיסים ולא לסכם המורפוגנזה הסתעפות באופן מלא כפי שהוא מתרחש בבלוטות שלמות 8. כאן אנו מתארים טכניקה המאפשרת תמרת adenoviral של תאי האפיתל והתרבות של דואר transfectedpithelium עם mesenchyme המשויך. בעקבות microdissection של SMGs העוברי, הסרת mesenchyme והזיהומים נגיפיים של האפיתל עם אדנווירוס GFP המכיל, אנו מראים כי האפיתל משלב מחדש באופן ספונטני עם mesenchyme הנגוע, משחזר מבנה בלוטות SMG שלם ומסועף המורפוגנזה. אוכלוסיית תאי אפיתל המהונדס גנטי ניתן לפקח בקלות באמצעות שיטות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגילות, אם תייג-fluorescently מבני adenoviral משמשים. שיטת רקומבינציה הרקמות המתוארות כאן היא כיום השיטה היעילה והנגישה ביותר לtransfection של תאי האפיתל עם וקטור פראי סוג או מוטציה בתוך מבנה רקמת 3D מורכב שאינו דורש דור של בעלי חיים מהונדסים.

Protocol

הפרוטוקול מכיל ארבעה שלבים עיקריים, כמתואר באיור 1. כל הצעדים מתוארים בפירוט מלא. בניית adenovirus וטיהור נגיפית צריכות להיות מופעלים מראש של קצירת האיברים לשימוש בהתמרה הגנטית של יסודות אפיתל גזור. כל אמצעי בטיחות BSL-2 הסטנדרטי צריך להיות אחרי כשעובד עם adenoviruses.

1. בלוטת קצירת עכבר עוברי לסת תחתונה (SMG) וmicrodissection

  1. להרדים עכברי מתוזמן בהריון נשי (מתח outbred CD-1 או ICR) באמצעות 2 CO הרדמה, ואחרי עקירת צוואר רחם ומחרוזות קציר של עוברי עכברים ביום עוברי 13 (E13, 3-5 ניצני אפיתל) הליכים שאשרו IACUC המוסדי ועדה. היום של גילוי תקע נרתיק מיועד כE0. בלוטות רוק יכולות גם להיות שנקטפו ותרבית בE12 השלב שבו יש ניצן אחד עיקרי וגבעול עם בתרי רק מתחילליזום. SMGs לפני שלב זה דורש תנאי תרבות שונים מאלה שצוינו כאן.
  2. העברת חוטי עובר ל 10 מנות סטריליים סנטימטר רקמות תרבות מלאה עם 25 מ"ל של מדיום DMEM / החם של F12 (F12) החסרים אדום פנול (חיים טכנולוגיים) והשלים עם 100 U / המ"ל פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין (עט סטרפטוקוקוס, חי טכנולוגיות).
  3. באמצעות אזמל סטרילי (# 11 להבים) ומלקחיים (# 5, כלי מדע פיין, 11252-20), להסיר את העוברים מהצ'קים לתוך צלחת נפרדת סנטימטר המכיל 10 מ"ל של 25 DMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס.
  4. לנתק את ראש העובר עם חתך אלכסוני ממש מתחת ללסת התחתונה.
  5. לבודד את הצבתות הנמוכות מהראשים תחת מיקרוסקופ לנתח סטריאו עם אור בסיס משודר (ניקון SMZ645 או שווה ערך) באמצעות חתך מתחת ללסת העליונה. הנח את הרקמות על גבי חתיכה נוספת של זכוכית ולא ישירות על מרכיב כוס בסיס מיקרוסקופ.
  6. לאסוף את הצבתות הנמוכות ל3 מ"ל של DMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס בצלחת סטרילית 35 מ"מ רקמת תרבות.
  7. מניח פרוס לסת תחתונה על במת מיקרוסקופ לנתח כך שהלשון היא בתחתית של הפרוסה אבל הוא מצביע לעבר כיוון השעה 12:00.
  8. שימוש בצד אחד של שני מלקחיים מוצלבים בתנועת מספריים, להסיר ולסלק rd הנמוך 1/3 מפרוסת הלסת התחתונה.
  9. הפעל ° 90 הפרוסה לימין (אם ימני), ובאמצעות קיצוץ מספריים עם המלקחיים, לחתוך את החלק העליון של פרוסת הלסת התחתונה (בלי לחתוך את הלשון) באמצע הדרך לפרוסה.
  10. קולף את הרקמה העודפת ולהסיר אותו משם, כדי לחשוף את SMGs מתחת. יהיה אחד בכל צד ליד בסיס הלשון.
  11. שימוש בזוג אחד של מלקחיים להחזיק את הרקמה על ידי הלשון, להשתמש במלקחיים האחרים להקניט את SMG מהלשון. חזור לבלוטה האחרת.
  12. לאסוף את בלוטות רוק microdissected ל3 מ"ל של DMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס לתוך רקמת מ"מ חדשה סטרילית 35מנת התרבות. הערה: את בלוטות הלסת התחתונות הגדולות יותר (3-5 ניצני אפיתל) יחד עם בלוטת sublingual הקטנה המחוברת (ניצן 1) יכולות להיות מתורבתות בשלמות על ידי דילוג לשלב 4 וביצוע צעדים 4.1, 4.3, ו -4.4, כפי שתואר לעיל 2,8.

2. SMG הפרדת הגמד אפיתל

  1. מקום 5 (או יותר) בלוטות רוק לתוך קרקעית מזכוכית, 50 מ"מ קוטר microwell מנה (מאטק תאגיד, P50G-1.5-14-F) ובו 200 μl של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS חסר Ca + + או Mg + +, חיים טכנולוגיים) המכיל 0.4% (v / v) dispase (חיים טכנולוגיים, חתול. לא. 17105-041) ודגירה במשך 15 דקות ב 37 ° C.
  2. לאחר הדגירה, באמצעות קצה פיפטה סטרילי 200 μl, לשאוב בזהירות את פתרון dispase מבלי להפריע לבלוטות. מייד להוסיף 200 μl של DMEM/F12 מדיה המכילה 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, לעקר מראש עם 0.22-מיקרומטר מסנן) כדי לנטרל את dispase.
    3. <li> תחת מיקרוסקופ לנתח, בעזרת זוג מלקחיים עם טיפים יפים (# 5 Dumostar, כלי מדע פיין, 11295-20), בעדינות להפריד mesenchyme המשוחרר מכל את הבלוטות וצינוריות אפיתל SMG, דואג להשאיר את האפיתל שלם .
  3. טרום רטוב טיפ סטרילי 200 μl פיפטה עם DMEM/F12-BSA תקשורת ועדינות פיפטה את יסודות אפיתל לתוך צלחת חדשה בקוטר 50 מ"מימ המכילה 200 microwell μl של DMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס. השתמש בקצה איכות גבוהה 200 μl פיפטה עם קצה חלק.
  4. במנה שמכילה את חלקי mesenchyme, להשליך כל רקמה שאינה mesenchymal כוללת את בלוטות sublingual וכל ניצני בלוטת לסת תחתונות מנותקים.

3. זיהום adenoviral של יסודות ראשונים אפיתל

  1. לעשות 200 μl של תקשורת זיהום ויראלי על ידי דילול אדנווירוס עניין בDMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס בצינור microcentrifuge כך שכייל של הפתרון המתקבל הוא 1x10 8 9 PFUs -10.כייל אופטימלי הנדרש לאיתור וירוסים שונים עשוי להשתנות. חשוב להשתמש כלוריד צסיום (CsCl)-מטוהר הכנות יראליים לשימוש יעיל בספיגה אופטימלית.
  2. הסר את המדיה מהצלחת המכילה את החמישה יסודות אפיתל. להוסיף במהירות 200 μl של תקשורת הזיהום, שמירה על היסודות רטובים בכל העת. לנקוט באמצעי זהירות הנדרש בעת טיפול בנגיף והשלכה של טיפי pipet מזוהמים. לחטא את כל משטחים מזוהמים בוירוס, 10% בתמיסת כלור.
  3. העבר את יסודות אפיתל רחוק אחד מהשני עם מלקחיים כדי למנוע מהם להידבק זה לזה ולאפשר להם להתיישב לתחתית הצלחת. דגירת יסודות בתקשורת הנגיפית לשעה 1 בטמפרטורת חדר. במהלך הדגירה, להפריד את היסודות, אם הם יעברו קרובים זה לזה. נדנדה או תנועה מוגזמת תאפשר את בלוטות גוש ביחד.
  4. לאחר הדגרה, בעדינות להסיר את המדיה נגיפית המכיל ולהשליך כראוי, נזהר שלא לשבש את rudiments. הוסף 200 μl של DMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס. חזור על לשטוף את זה לפחות פעמים נוספות ולהחליף עם 200 μl של DMEM/F12 + תקשורת העט סטרפטוקוקוס. השטיפות האלה הן קריטיות כדי להסיר כל וירוס שאינו קשור מאוד לאפיתל ולמנוע הדבקה של mesenchyme.
  5. דגירת יסודות אפיתל עם 200 מ"ל של DMEM/F12 מכיל 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356231) למשך 20 דקות. אנו מוצאים כי דגירה קצרה זה בMatrigel ממזערת את הרגרסיה של בתרי קיים בתקופת התרבות הראשונית, אבל צעד זה ניתן לוותר אם החשיפה לMatrigel אינה רצויה.

4. תרבות vivo לשעבר של SMGs recombined

  1. הנח כל גמד, אחד בכל פעם, באמצעות קצה פיפטה מראש רטוב 200 μl, על גבי (חתך קטן) מחורצים 13 מ"מ, 0.1 מיקרומטר Nuclepore קרום מסנן מסלול-Etch (Whatman) מרחף מעל 200 μl של מדיה התרבות ( 5 יסודות / סינון) בצלחת microwell בעלת קרקעית זכוכית. תקשורת התרבותהוא: DMEM/F12 + עט סטרפטוקוקוס המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל וחומצה transferrin 150 מיקרוגרם / מ"ל אסקורבית, כפי שתואר קודם לכן 2,8. Transferrin ידוע כדי לעורר הישרדות והסתעפות המורפוגנזה של בלוטות רוק וexplants איברים האחרים 9. תוספת של חומצה אסקורבית הוכחה לעורר SMG הסתעפות 10. זה ידוע לפעול כcofactor בתגובות hydroxylation רבות של מסלולים מטבוליים (כגון hydroxylation פרולין במהלך היווצרות סיבי קולגן 11) וגם ממריץ ייצור פיברונקטין וlaminin בexplants איברים האחרים 12.
  2. הסר כתקשורתיים רבה על גבי המסנן ככל האפשר לאחר ההוספה כל גמד אפיתל. יותר מדי תקשורת על גבי המסנן עלולה לגרום למסנן לשקוע, בעוד פחות המדיה הופכת מיקום של היסודות וmesenchyme הרבה יותר קל. תקשורת העודפת ניתן להסיר גם עם קצה פיפטה או באמצעות מלקחיים לאחיזה בתקשורת בין הקצוות.
  3. חתיכות mesenchyme מקום נגזרו הלוך ושובמ 3-4 בלוטות על גבי ו / או סביב כל גמד אפיתל. הוצא את כל אמצעי נוסף המקיף את הבלוטות כדי למנוע תנועה של mesenchyme הרחק מהיסודות. Mesenchyme נגזר מבלוטות יותר אינו מועיל אך פחות יכול להיות מזיק לצמיחת הגמד אפיתל.
  4. דגירת SMGs מורכב בחממת humidified (אוויר / 5 CO 2% 95%) על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 -72 שעות, בהתאם לצורך.
  5. Brightfield לרכוש ו / או תמונות ניאון של בלוטות חיות ב0 שעות (אם רוצה), 2 שעות לאחר רקומבינציה וכל 24 שעות לאחר מכן במיקרוסקופ אור הפוכה, כלפי מעלה, או סטריאו מצויד במצלמה דיגיטלית באמצעות הגדלת מטרת 4X או 5X ל ללכוד את הבלוטה מורכב כולו במסגרת אחת מנוף. תמונות של בלוטות הרוק להראות את הניגוד הטוב ביותר תוך שימוש בהגדרת brightfield או טבעת השלב המתאימה להציב דרך חלק לתוך נתיב האור (דבר שאינו אפשרי במיקרוסקופים מלאים אוטומטיים). לעומת שלב סטנדרטי היא לאלא הכרחי מאז הבלוטה היא עבה ויוצר ניגוד.
  6. בנקודתי זמן וברצוי, SMGs מורכב יכולה להיות קבוע במשך 20 דקות עם פתרון מקבע עשויות paraformaldehyde 2% (PFA) ב1X PBS המכיל 5% (w / v) סוכרוז (טוב יותר לשמור על המבנה תאי הפנימי על ידי שמירה על התאים ב מדינת מליחות). שלא כמו 4% PFA, 2% PFA ישמור כמות משמעותית של אות ה-GFP אם מקבעים נמחק לחלוטין לאחר קיבוע. בלוטות ניתן לאחסן עד השבוע 1 ב 1X PBS בחושך ב 4 ° C עד immunocytochemistry הר השלם והדמית confocal מבוצע, כפי שדווח בעבר 3,6,13-15. באופן אידיאלי, יש לבצע הדמית immunocytochemistry וזמן קצר לאחר קיבוע לקבל את התמונות באיכות הטובה ביותר. בלוטות יכולות להיות גם lysed במאגר Ripa ל- PAGE SDS אחרי ניתוח סופג מערבי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הזרימה של צעדי הניסוי המרכזיים מתוארת באיור 1. דוגמה של SMG שלם, גמד אפיתל מבודד, וmesenchyme המקביל שלה מוצגת באיור 2. תמונות של brightfield SMGs מורכב, שממשיך לעבור הסתעפות המורפוגנזה כאשר vivo לשעבר תרבותי לזמנים שצוינו, המוצגים באיור 3. בלוטות recombined גדלו במשך 48 שעות להביע GFP אפיתל מוצגות באיור 4. תמונות confocal של SMGs מורכב קבועות וצלמו לאחר 72 שעות בתרבות ואחרי immunocytochemistry, מוצגים באיור 5. סמן אפיתל, E-cadherin, תוחם את אוכלוסיית תאי אפיתל GFP מבטא מmesenchyme שמסביב. זיהוי של חלבוני קרום המרתף, perlecan, מקומיים בפריפריה של האפיתל מדגים לפחות כינון מחדש חלקי של קרום המרתף בבלוטות מורכב. F igure 6. לסת תחתונים גרעינים הפאראסימפתטית לעבור תולדת neurite ומעצבבים את הבלוטות בתרבויות רקומבינציה כפי שהוכיחו בעבר 19.

איור 1
איור 1. () תרשים זרימה ו( B) סכמטי המתאר את שלבי הניסוי העיקריים.

איור 2
איור 2. Brightfield תמונות של () יום שלם עוברי 13 (E13) בלוטות רוק מראים אפיתל sublingual בלוטה (SL Epi) ואפיתל בלוטת הלסת התחתון (SMG Epi) המוקף mesenchyme (MES). (ב) גמד אפיתל מבודד, ו( C) פרוד mesenchyme. ברי קנה מידה = 100 מיקרומטר.

בעמודים = "תמיד"> איור 3
איור 3. תמונות brightfield של יסודות אפיתל (שמתואר על ידי קווים מקווקווים לבנים) מוקפות בחתיכות mesenchyme גדלות בתרבית vivo לשעבר לזמנים שצוינו. תאי האפיתל לעבור הסתעפות המורפוגנזה ועיבוי mesenchymal ניכר כבר 24 שעות בתרבות. ברי קנה מידה = 100 מיקרומטר

איור 4
איור 4. Brightfield (), ניאון (B) ותמונות מעולפות (ג) לSMGs מורכב בי רק את תאי אפיתל (התווה בקווים מקווקווים לבנים) היו נגועים adenovirus GFP להביע-vivo לשעבר ותרבותי עבור 48 שעות. ברי קנה מידה = 100 מיקרומטר.

highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50060/50060fig5.jpg "/>
איור 5. תמונות confocal או תמונות brightfield (BF) של SMGs מורכב כותרתו עם () גרעינים (DAPI, כחול), adenoviral GFP (ירוק), סמן אפיתל. E-cadherin (אדום), סרגלי קנה מידה = 250 מיקרומטר, או (ב) גרעינים (DAPI, כחול), adenoviral GFP (ירוק), סמן אפיתל, E-cadherin (אדום), וסמן קרום המרתף, Perlecan ( ציאן) בארים, בקנה מידה = 50 מיקרומטר. מקווקו אפיתל מתווית קווים לבן. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 6
האיור 6. גרעיני לסת תחתונים הפאראסימפתטית לעבור תולדת neurite ומעצבבים את הבלוטות בתרבויות רקומבינציה, בארים בקנה מידה = 250 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

טכניקת רקומבינציה אפיתל-mesenchymal vivo לשעבר פורסמה לראשונה לבלוטות רוק לסת תחתונות בשנת 1981 16. בפרוטוקול זה, אנו עומדים בהרחבה על השיטה המקורית, באמצעות זיהום adenoviral כדי לתפעל ביטוי גני התא אפיתל בהקשר של בלוטה התחברה מחדש. אנו מראים כי אחוז של תאי האפיתל נגוע באדנווירוס, ואילו אחוז מתאים נגועים תלוי במאפיינים של אמרגן ויראלי, כייל נגיף, וטוהר נגיפי. התבררנו לנו שיש צורך להשתמש בוירוסי CsCl שיפוע מטוהר-לתמרת אפיתל יעילה, הטיהור שאינו מתוארת כאן. מאז גם הצלחנו להדביק את תאי mesenchyme לפני רקומבינציה (מידע לא מוצג), מניפולציה גנטית עצמאית של אוכלוסיית mesenchymal היא גם אפשרית. לאחרונה השתמשנו בשיטה זו adenoviral transfection / רקמות רקומבינציה לזהות תפקידלקוטביות החלבון, PAR-1b, בשליטה במיקום של קרום מרתף ידי האפיתל בפיתוח בלוטות רוק. אדנווירוס קינאז המת PAR-1b ואדנווירוס פראי מסוג PAR-1b היו שניהם השתמשו במחקר זה 13 להדביק יסודות אפיתל והתחבר מחדש עם E13 mesenchymes. היכולת להשתמש בוירוסים מוטנטים לחקור את הפונקציות של מולקולות ספציפיות משפרת באופן משמעותי את התועלת של שיטה זו.

אין כרגע מחסור בכלים יעילים כדי למקד מולקולות ספציפיות בתוך אוכלוסיית תאי אפיתל בבלוטות רוק עובריות שלמות מבלי להשפיע על תא mesenchymal. למרות שמחקרים רבים השתמשו במעכבים פרמקולוגיים לתפעל העברת אותות בתרבויות איברים שלמות, מעכבים אלו משפיעים הוא האפיתל וmesenchyme. ישירות כדי להעריך השפעות של מעכבים על אפיתל, יסודות אפיתל חייבים להיות מתורבתים בהעדר mesenchyme בשתי Matrigel or-111 laminin ג'לי 6,7. RNAs המעכב הקטן (siRNAs) הוא שיטה יעילה ללמטה לווסת ביטוי הגנים אפיתל מאז siRNAs נתפס על ידי מעדיף תאי האפיתל בנוכחות רוב ספקי שומנים 13,14,17,18. עם זאת, אף אחת מהשיטות הללו להתערבות ברמות חלבון או פונקציה מאפשר ביטוי יתר של גן פראי סוג או מוטציה. ניסיונות transfection מסורתי (שאינו נגיפי) של תרבויות SMG השלמות העובריות נפגשו עם הצלחה מוגבלת שברק מספר קטן של תאי האפיתל יכול להיות ממוקד (ML, נתונים שלא פורסמו). לשם השוואה, תמרת adenoviral מייצגת שיטה יעילה לתאי האפיתל transfecting רוק באופן ספציפי.

עצבים הפאראסימפתטית לאחרונה הוכחו להיות קריטי לבלוטות רוק רגילות הסתעפות על ידי שמירה על אוכלוסיית קרטין 5-חיובי מוליד תא 19. יתרונה של שיטה זו על רקמת רקומבינציה mesשיטת תרבות enchyme ללא אפיתל גמד היא שגנגליון הפאראסימפתטית יכול להישמר במערכת תרבות רקומבינציה. על ידי שמירה על מסלול מדוקדק של המיקום המשוער של גנגליון הפאראסימפתטית, הנמצא בסמוך לmesenchyme צינור אפיתל העיקרי 19, זה אפשרי על מנת להבטיח שכל גמד סופו להיות קשור בגנגליון. עם זאת, אנו מוצאים כי על ידי שילוב של בלוטות בשווי של mesenchymes עם כל גמד אפיתל 3-4, כל גמד קשור לגנגליון מספיק כדי מעצבב את הבלוטות במידה מסוימת (איור 6), אם כי לא תמיד זהה בנוסח האחיד ללא פגע בלוטות.

ישנן שיטות חלופיות להדבקת האפיתל בהקשר של הבלוטה התקינה. אנחנו דיווחנו בעבר כי microinjection ניתן להשתמש כדי להציג את אדנווירוס לתאי אפיתל בבלוטות שלמות 20,21. עם זאת, microinjection קשה control, עלול לגרום ניזק פיזי לבלוטות, ובדרך כלל גורם לדלקת של שרק קבוצה מקומית של תאים 20. וירוסי adeno הקשורים (AAV) הוכחו להיות שימושי עבור transfection של אוכלוסיות תאים שונות בהקשר של explants האיברים SMG השלם 22. סרוטיפ scAAV2 הוצג להיות יעיל יותר באופן משמעותי בתמרה ספציפית של האפיתל של SMGs השלם מעל וקטורי AAV רקומביננטי אחרים 23. מאז AAVs אינם זמין באופן מסחרי נרחב, וגם לא את המומחיות כדי להכין AAV קיים ברוב המעבדות, תמרת adenoviral ופרוטוקול רקומבינציה רקמות הניתנות כאן הם כללי יותר נגיש למרבית המעבדות מהיא השימוש בוקטורי AAV.

בעוד משחזר שיטת רקומבינציה רקמה זו אינטראקציות אפיתל-mesenchymal במידה מסוימת, אפשר גם להדביק אפיתל עם אדנווירוס ולאחר מכן תגדל אפיתל מחוץ להקשר המקורי שלו.כפי שהוזכר קודם לכן, אנו נגועים יסודות אפיתל רוק שלמים עם אדנווירוס ולאחר מכן גדלנו בתרבויות Matrigel עם גורמי גדילה הוסיפו exogenously 17,20,21. explants איברי בלוטת הרוק גם יכול להיות מתורבת על פיגומי nanofiber, למרות הפיגומים האלה לא יחזרו לתפקוד המלא של mesenchyme בצורה הנוכחית שלהם 15. אמנם אף אחת מהשיטות הללו משחזר mesenchyme הילידים, שיטות כאלה מאפשרות חיקוי של מאפיינים ספציפיים של mesenchyme בתרבות vivo לשעבר.

לכל שיטת תרבות vivo לשעבר יש יתרונות וחסרונות משלה, אך ישים להתמודדות עם שאלות מדעיות ספציפיות. בעוד הבלוטות מורכב אינן עוברות באותה מידת הסתעפות המורפוגנזה כלעשות explants השלם בלוטת רוק איברים, explants איברים, באופן כללי, רק לסכם in vivo הסתעפות המורפוגנזה לכמה ימים. פתרון לבעיה זו הוא כמובן לcreאכל חיות מהונדסות המכילות ביטוי גן ממוקד בתוך התא האפיתל. מאחר ויש מחסור ביזמים ידועים אשר מופעלים באופן ספציפי בפיתוח אפיתל SMG מוקדם, וטכנולוגיה מהונדסת נותרת משמעותי יקרה יותר מאשר בשיטות המתוארות, ניסויי רקומבינציה רקמות המתוארות כאן מהווים מערכת מודל בר קיימא ללמוד גם תאי אפיתל וmesenchymal איתות תחילת פיתוח תאי בלוטת רוק בהקשר הרקמות שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לד"ר דידרה נלסון על הערות מועילות ולקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי מענקי NIH DE019244, DE019197, וDE021841 למ"ל, F32DE02098001 לי"ש, וC06 RR015464 לאוניברסיטת אולבני, SUNY.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/Ham's F12 Medium without phenol red Life Technologies 21041-025
Penicillin and Streptomycin Life Technologies 15070-163 10X stock
Dispase Life Technologies 17105-041 Freeze single use aliquots at -20C
BSA Sigma A2934-100G Fraction V, low endotoxin
Adeno-X-GFP BD Biosciences 8138-1 Should be high titer (1x1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay.
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v)
1X Phosphate-buffered saline (PBS) Life Technologies 70011-044 Prepared from 10X stock
Hank's Balanced Salt Solution Life Technologies 14175095 no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red
Transferrin Sigma T8158 25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C
L- Ascorbic acid (Vitamin C) Sigma A4403 75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C
Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol.
10 cm sterile plastic dishes Corning 430167 Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo dissecting microscope with transmitted light base Nikon SMZ645 Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
35 mm tissue culture dishes Falcon 353001 Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50 mm diameter microwell dishes MatTek Corporation P50-G-1.5-14F
Nuclepore Track-Etch membrane filters Whatman 110405 13 mm diameter, 0.1 mm pore size
Widefield fluorescence microscope Carl Zeiss, USA Axio Observer Z1 Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal microscope Leica Microsystems TCS SP5 Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR Charles River Labs Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0).
Scalpel blade #11 Fine Science Tools 10011-00
Scalpel handle #3 Fine Science Tools 10003-12
Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm Fine Science Tools 11252-20 Ideal for harvesting glands from embryos
Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm Fine Science Tools 11295-20 Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tucker, A. S. Salivary gland development. Seminars in cell & developmental biology. 18, 237-244 (2007).
  2. Sakai, T., Onodera, T. Embryonic organ culture. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19 (2008).
  3. Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. Salivary gland branching morphogenesis. Differentiation. 74, 349-364 (2006).
  4. Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).
  5. Zheng, C., et al. Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland. J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).
  6. Larsen, M., et al. Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis. Developmental biology. 255, 178-191 (2003).
  7. Hoffman, M. P., et al. Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms. Development. 129, 5767-5778 (2002).
  8. Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development. Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).
  9. Partanen, A. M., Thesleff, I. Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture. Differentiation. 34, 25-31 (1987).
  10. Naka, T., et al. Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate. In Vivo. 19, 883-888 (2005).
  11. Bornstein, P., Traub, W. The chemistry and biology of collagen. The Proteins. Neurath, H., Hill, R. L. 4, 3rd, Academic Press. 412-632 (1979).
  12. Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture. Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).
  13. Daley, W. P., et al. ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity. Development. 139, 411-422 (2012).
  14. Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis. Developmental biology. 336, 169-182 (2009).
  15. Sequeira, S. J., et al. The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds. Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).
  16. Nogawa, H., Mizuno, T. Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development. Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).
  17. Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423, 876-881 (2003).
  18. Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).
  19. Knox, S. M., et al. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science. 329, 1645-1647 (2010).
  20. Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis. J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).
  21. Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells. Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).
  22. Zheng, C., Baum, B. J. Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands. Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).
  23. Hsu, J. C., et al. Viral gene transfer to developing mouse salivary glands. J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).

Tags

גנטיקה גיליון 71 ביולוגיה מולקולרית ביולוגיה תאית ביולוגיה התפתחותית וירולוגיה רפואה adenovirus יסודות עובריים אפיתל מטריקס mesenchyme תרבות איברים בלוטת לסת תחתונה, תרבית תאים הנדסת רקמות עובר עכבר מודל חיה
שינוי ורקומבינציה גנטי של תרבויות איברי בלוטות רוק
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sequeira, S. J., Gervais, E. M.,… More

Sequeira, S. J., Gervais, E. M., Ray, S., Larsen, M. Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures. J. Vis. Exp. (71), e50060, doi:10.3791/50060 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter