Summary
وهناك تقنية لمعالجة وراثيا داخل الخلايا الظهارية كله
Abstract
المتفرعة التشكل يحدث خلال تطوير العديد من الأجهزة، وتحت الفك السفلي الماوس الجنينية الغدة (SMG) هو النموذج الكلاسيكي لدراسة التشكل المتفرعة. في SMG النامية، وهذه العملية تنطوي على خطوات متكررة من برعم الظهارية وتشكيل لاصق، لإعطاء نهاية المطاف إلى نشوء شبكة متفرعة معقدة من القنوات وعنيبات، التي تعمل على إنتاج وتعديل / نقل اللعاب، على التوالي، في تجويف الفم 1 - 3. الغشاء القاعدي الظهارية المرتبطة وجوانب المقصورة الوسيطة، بما في ذلك خلايا اللحمة المتوسطة، وعوامل النمو المصفوفة خارج الخلية، التي تنتجها هذه الخلايا، حاسمة بالنسبة لآلية المتفرعة، على الرغم من كيفية تنسيق الأحداث الخلوية والجزيئية تبقى غير مفهومة 4 . دراسة الآليات الجزيئية القيادة السلف التشكل الظهارية فهمنا لآليات التنموية ورؤية ثاقبة regener ممكننهج الطب اطر النسبية. وتعطلت مثل هذه الدراسات نظرا لعدم وجود طرق فعالة للتلاعب الجيني للظهارة اللعابية. حاليا، يمثل تنبيغ الغدانية الأسلوب الأكثر فعالية لاستهداف الخلايا الظهارية في الغدد في الجسم الحي الكبار 5. ومع ذلك، في إإكسبلنتس الجنينية، اللحمة المتوسطة كثيفة والغشاء القاعدي الخلايا الظهارية المحيطة يعوق الوصول الفيروسية للخلايا الظهارية. إذا تمت إزالة اللحمة المتوسطة، يمكن تقاس باستخدام الظهارة الفيروسات الغدية، واساسيات الظهارية يمكن استئناف المتفرعة التشكل في وجود أو Matrigel laminin 111 6،7. اللحمة المتوسطة خالية النمو رديم الظهارية يتطلب أيضا مكملات إضافية مع عوامل النمو للذوبان ولا ألخص بشكل كامل التشكل المتفرعة كما يحدث في الغدد سليمة 8. نحن هنا وصف الأسلوب الذي يسهل تنبيغ الغدانية من الخلايا الظهارية وثقافة بالنقل هpithelium مع اللحمة المتوسطة المرتبطة بها. بعد تسليخ مجهري للSMGs الجنينية، إزالة اللحمة المتوسطة، والعدوى الفيروسية من ظهارة مع اتش GFP التي تحتوي على، وتبين لنا أن يعيد توحيد ظهارة تلقائيا، مع اللحمة المتوسطة غير مصاب، تلخص سليمة هيكل غدي SMG والمتفرعة التشكل. ويمكن للسكان المعدلة وراثيا الخلايا الظهارية رصدها بسهولة باستخدام معيار أساليب مضان المجهري، إذا fluorescently-الموسومة تستخدم بنيات الغدانية. طريقة إعادة التركيب الأنسجة الموصوفة هنا هو حاليا الأسلوب الأكثر فعالية ويمكن الوصول إليها عن ترنسفكأيشن من الخلايا الظهارية مع ناقل البرية من نوع أو متحولة ضمن بناء الأنسجة 3D المعقدة التي لا تتطلب جيل من الحيوانات المعدلة وراثيا.
Protocol
ويتضمن البروتوكول أربع خطوات رئيسية، كما هو مبين في الشكل 1. يتم وصف كل الخطوات بالتفصيل الكامل. يجب أن يتم تنفيذ البناء وتنقية الفيروسية اتش في وقت سابق للحصاد الجهاز للاستخدام في تنبيغ الوراثية من اساسيات تشريح الظهارية. يجب اتباع جميع احتياطات السلامة القياسية BSL-2 عند التعامل مع الفيروسات الغدية.
1. الغدة تحت الفك الماوس الجنينية (SMG) حصاد وتسليخ مجهري
- الموت ببطء التوقيت-إناث الفئران الحوامل (سلالة الأباعد CD-1 أو ICR) باستخدام CO 2 الخدر، تليها خلع عنق الرحم وخيوط حصاد أجنة الفئران الجنينية في يوم 13 (E13، 3-5 براعم الظهارية) الإجراءات التالية التي وافقت عليها IACUC المؤسسية اللجنة. تم تعيينه يوم اكتشاف المكونات المهبلية كما E0. ويمكن أيضا أن تحصد الغدد اللعابية ومثقف في مرحلة E12 عندما يكون هناك برعم واحد الابتدائية وساق مع الشقوق بدأت للتولبدء. SMGs قبل هذه المرحلة تتطلب ظروف مختلفة عن تلك الثقافة وأشارت هنا.
- نقل السلاسل الجنين في معقمة 10 أطباق سم زراعة الأنسجة مليئة 25 مل من متوسطة F12 DMEM / هام ل(F12) تفتقر الحمراء الفينول (لايف تكنولوجيز) وتستكمل مع 100 U / البنسلين مل، و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين (القلم بكتيريا، الحياة تكنولوجيز).
- باستخدام مشرط معقم (# 11 ريش) وملقط (# 5، أدوات العلوم الجميلة، 11252-20)، إزالة الأجنة من الحويصلات في طبق منفصل 10 سم تحتوي على 25 مل من DMEM/F12 + القلم بكتيريا.
- قطع رؤوس الجنين مع قطع الزاوية أسفل الفك السفلي.
- عزل أقل mandibles من رؤساء تحت المجهر ستيريو مع وجود قاعدة تشريح الضوء المرسل (نيكون SMZ645 أو ما يعادلها) باستخدام قطع تحت الفك العلوي. وضع الأنسجة على رأس قطعة اضافية من الزجاج وليس مباشرة على الزجاج المكون لقاعدة المجهر.
- جمع أقل mandibles إلى 3 مل من DMEM/F12 + القلم بكتيريا في طبق العقيمة 35 ملم زراعة الأنسجة.
- وضع شريحة الفك السفلي على المسرح المجهر تشريح بحيث اللسان على الجزء السفلي من شريحة ولكن يشير نحو موقف الساعة 12:00.
- استخدام جانب واحد من اثنين من ملقط عبرت في حركة سكيسورينغ، وإزالة وتجاهل الثالثة أقل 1/3 من شريحة الفك السفلي.
- تحويل شريحة 90 درجة إلى اليمين (اليد اليمنى إذا) و، وذلك باستخدام قطع سكيسورينغ مع ملقط، وقطع الجزء العلوي من شريحة الفك السفلي (بدون قطع اللسان) في منتصف الطريق إلى شريحة.
- قشر الأنسجة الزائدة بعيدا وإزالته لفضح SMGs تحتها. وسوف يكون هناك واحد على كل جانب بالقرب من قاعدة اللسان.
- باستخدام زوج واحد من الملقط باستمرار إلى الأنسجة عن طريق اللسان، استخدم ملقط أخرى لندف SMG بعيدا عن اللسان. تكرار للغدة أخرى.
- جمع الغدد اللعابية في microdissected 3 مل من DMEM/F12 + القلم بكتيريا جديدة في الأنسجة المعقمة 35 ملمثقافة الطبق. ملاحظة: يمكن زرعها أكبر الغدد تحت الفك السفلي (3-5 براعم الظهارية) جنبا إلى جنب مع الغدة تحت اللسان إتصال أصغر (1 برعم) على حالها من خلال تخطي إلى الخطوة 4 وتنفيذ الخطوات 4.1، 4.3، و 4.4، كما هو موضح سابقا 2،8.
2. SMG طلائي فصل رديم
- المكان 5 (أو أكثر) الغدد اللعابية في زجاجة ذات قاع، 50 مم القطر microwell طبق (ماتيك شركة، P50G-1.5-14-F) تحتوي على 200 ميكرولتر من محلول هانك الملح المتوازن (HBSS تفتقر كا + + أو Mg + +، تقنيات الحياة) التي تحتوي على 0.4٪ (V / V) dispase (تقنيات الحياة، القط. رقم 17105-041) واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 ° C.
- بعد الحضانة، وذلك باستخدام ماصة معقمة 200 ميكرولتر تلميح، نضح بعناية الحل من دون إزعاج dispase الغدد. إضافة 200 ميكرولتر من الفور DMEM/F12 وسائل الإعلام التي تحتوي على 5٪ (W / V) BSA (DMEM/F12-BSA، قبل تعقيمها 0،22 ميكرون مع فلتر) لتحييد dispase. <لى> تحت المجهر تشريح، وذلك باستخدام زوج من ملقط مع نصائح غرامة (# 5 Dumostar، أدوات العلوم الجميلة، 11295-20)، فصل بلطف اللحمة المتوسطة خففت من جميع أنحاء براعم SMG الظهارية والقنوات، مع الحرص على ترك سليمة ظهارة .
- قبل الرطب وعقيمة 200 ميكرولتر ماصة الحافة مع وسائل الإعلام وDMEM/F12-BSA ماصة بلطف من اساسيات الظهارية في طبق جديد 50 مم القطر microwell تحتوي على 200 ميكرولتر من DMEM/F12 + القلم بكتيريا. استخدام عالية الجودة تلميح ماصة ميكرولتر 200 مع حافة ناعمة.
- في الصحن الذي يحتوي على قطع اللحمة المتوسطة، ونبذ أي نوع من الأنسجة غير الوسيطة بما في ذلك الغدد تحت اللسان وأي فصل براعم الغدة تحت الفك.
3. الغدانية العدوى من الأساسيات طلائي
- جعل وسائل الإعلام 200 ميكرولتر من عدوى فيروسية إضعاف اتش الاهتمام DMEM/F12 + بكتيريا من ركلة جزاء في أنبوب microcentrifuge بحيث عيار من الحل الناتج هو 1x10 8 -10 9 PFUs. القد عيار الأمثل المطلوب لفيروسات مختلفة تختلف. من المهم أن استخدام كلوريد السيزيوم (CSCL)-تنقية الاستعدادات لكفاءة امتصاص الفيروسية الأمثل.
- إزالة وسائل الإعلام من الطبق يحتوي على اساسيات 5 الظهارية. بسرعة إضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام العدوى، والحفاظ على اساسيات الرطب في جميع الأوقات. اتخاذ الاحتياطات اللازمة عند التعامل مع الفيروس والتخلص من نصائح الماصة الملوثة. تطهير الأسطح أي ملوثة بالفيروس مع حل التبييض 10٪.
- نقل اساسيات الظهارية بعيدا عن بعضها البعض مع ملقط لمنعهم من الالتصاق معا، والسماح لهم لتسوية في الجزء السفلي من اللوحة. احتضان اساسيات في وسائل الإعلام الفيروسية ل1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. خلال الحضانة، فصل اساسيات، إذا انتقلوا قريبة من بعضها البعض. سوف هزاز المفرط أو حركة يسمح للغدد لتتجمع معا.
- بعد الحضانة، وإزالة بلطف وسائل الإعلام التي تحتوي على فيروسات والتخلص بشكل مناسب، مع الحرص على عدم تعطيل Rudiments. أضف 200 ميكرولتر من DMEM/F12 + القلم بكتيريا. تكرار غسل هذا على الأقل مرتين أخريين واستبدال مع 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام DMEM/F12 القلم بكتيريا +. هذه يغسل حاسمة لإزالة أي فيروس التي لم يتم بقوة لتولي الظهارة ومنع العدوى من اللحمة المتوسطة.
- احتضان اساسيات الظهارية مع 200 مل من DMEM/F12 تحتوي على 2٪ (V / V) Matrigel (BD العلوم البيولوجية، 356231) لمدة 20 دقيقة. نجد أن هذه الحضانة قصيرة في Matrigel يقلل من الانحدار من الشقوق الموجودة الثقافة خلال الفترة الأولية، ولكن يمكن الاستغناء هذه الخطوة مع المطلوب إذا لم يتم التعرض لMatrigel.
4. فيفو السابقين من الثقافة SMGs معاد
- وضع كل رديم، في وقت واحد، وذلك باستخدام ما قبل الرطب تلميح ماصة ميكرولتر 200، على رأس (قطع صغيرة) حقق 13 مم، 0.1 ميكرومتر Nuclepore المسار، إحفر غشاء (WHATMAN) تطفو أكثر من 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافة ( 5 اساسيات / فلتر) في لوحة microwell الزجاجي. ثقافة وسائل الإعلامهو: DMEM/F12 + القلم بكتيريا يحتوي على 50 ميكروغرام / مل و 150 ترانسفيرين حمض الاسكوربيك ميكروغرام / لتر، كما هو موضح سابقا 2،8. ومن المعروف ترانسفيرين لتحفيز البقاء والمتفرعة من التشكل الغدد اللعابية والجهاز إإكسبلنتس أخرى 9. وقد تبين من حامض الاسكوربيك بالإضافة إلى تحفيز SMG المتفرعة 10 ومن المعروف أن يكون بمثابة العامل المساعد في التفاعلات الهيدروكسيل العديد من المسارات الأيضية (مثل الهيدروكسيل البرولين خلال تشكيل الكولاجين الألياف 11) وتحفز أيضا إنتاج فبرونيكتين وlaminin في إإكسبلنتس جهاز آخر 12.
- إزالة الكثير من وسائل الإعلام على رأس مرشح ممكن بعد إضافة كل رديم الظهارية. قد الكثير من وسائل الإعلام على رأس تصفية تسبب تصفية لإغراق، في حين أن أقل وسائل الاعلام يجعل وضع اساسيات واللحمة المتوسطة أسهل بكثير. يمكن إزالة الزائدة وسائل الإعلام سواء مع طرف ماصة أو باستخدام ملقط لقبضة وسائل الإعلام بين النصائح.
- قطع اللحمة المتوسطة المكان جيئة وذهابا المستمدة03:57 م الغدد على رأس و / أو حول كل رديم الظهارية. إزالة أي وسائط الإضافية التي تقوم بتطويق الغدد لتجنب حركة اللحمة المتوسطة بعيدا عن اساسيات. اللحمة المتوسطة المستمدة من أكثر الغدد ليست مفيدة ولكن أقل يمكن أن يكون ضارا لنمو رديم الظهارية.
- احتضان SMGs معاد في حاضنة مرطب (95٪ الهواء / 5٪ CO 2) في C ° 37 لمدة 48 -72 ساعة، كما هو مطلوب.
- الحصول على brightfield و / أو الصور الفلورسنت الغدد الحية في ساعة 0 (الرغبة)، 2 ساعة بعد إعادة التركيب وبعد ذلك على مدار 24 ساعة كل على ضوء المجهر المقلوب، وتستقيم، أو ستيريو مزودة كاميرا رقمية باستخدام التكبير 4X الهدف أو 5X ل التقاط الغدة بأكملها معاد في إطار واحد وجهة نظر. صور من الغدة اللعابية عرض أفضل النقيض باستخدام الإعداد brightfield أو الحلبة المرحلة المناسبة وضعت الطريقة في جزء مسار الضوء (وهو أمر غير ممكن على كامل الآلي المجاهر). معيار المقابل المرحلة ليسر اللازمة منذ الغدة سميكا ويخلق التباين.
- في نقطة زمنية المطلوب، يمكن أن تكون ثابتة SMGs معاد لمدة 20 دقيقة مع الحل مثبت مصنوع من بارافورمالدهيد 2٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 5٪ (W / V) السكروز (للحفاظ على بنية الخلية الداخلية أفضل عن طريق الحفاظ على الخلايا في دولة متسق الضغط التناضحي). على عكس PFA 4٪ سوف، PFA 2٪ الحفاظ على كمية كبيرة من الإشارة GFP إذا تمت إزالة تماما بعد التثبيت مثبت. ويمكن تخزين الغدد لمدة تصل إلى 1 أسبوع في برنامج تلفزيوني 1X في الظلام في 4 درجات مئوية حتى يتم تنفيذ كامل جبل كيمياء سيتولوجية مناعية والتصوير مبائر، كما ورد سابقا 3،6،13-15. من الناحية المثالية، ينبغي أن يتم تنفيذ كيمياء سيتولوجية مناعية والتصوير قريبا بعد التثبيت للحصول على صور ذات نوعية أفضل. ويمكن أيضا أن الغدد lysed في العازلة RIPA لSDS-PAGE تليها الغربية النشاف تحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد تدفق الخطوات التجريبية الرئيسية في الشكل 1. وتظهر مثال لSMG سليمة، وهي معزولة رديم الظهارية، واللحمة المتوسطة المناظر له في الشكل 2. صور من Brightfield SMGs معاد، التي لا تزال تخضع المتفرعة التشكل عندما تظهر مثقف فيفو السابقين لصحيفة المشار إليها، في الشكل 3. تظهر الغدد معاد نمت لمدة 48 ساعة معربا عن GFP الظهارية في الشكل 4. صور من متحد البؤر SMGs معاد ثابت وتصوير بعد 72 ساعة في الثقافة تليها كيمياء سيتولوجية مناعية، وتظهر في الشكل 5. علامة الظهارية، E-كادهيرين، ترسم، معربا عن GFP السكان الخلايا الظهارية من اللحمة المتوسطة المحيطة بها. الكشف عن بروتين الغشاء الطابق السفلي، perlecan، مترجمة على هامش الظهارة يوضح على الأقل إعادة جزئية من الغشاء القاعدي في الغدد معاد. F igure 6. العقد تحت الفك السفلي السمبتاوي الخضوع ثمرة محوار ويعصب الغدد في الثقافات كما هو موضح سابقا إعادة التركيب 19
الشكل 1 (A) ومخطط انسيابي (B) التي تصور تخطيطي الخطوات الرئيسية التجريبية.
الشكل 2. Brightfield صورا ل(A) يوم كامل الجنينية 13 (E13) تظهر الغدد اللعابية تحت اللسان ظهارة الغدة (SL برنامج التحصين الموسع)، وظهارة الغدة تحت الفك السفلي (SMG برنامج التحصين الموسع) تحيط بها اللحمة المتوسطة (MES). (B) رديم الظهارية معزولة، و(C) مطلق اللحمة المتوسطة. على نطاق والحانات = 100 ميكرومتر.
في صفحة = "دائما"> 
الشكل 3. الصور Brightfield من اساسيات الظهارية (التي حددها الأبيض الخطوط المتقطعة) تحيط بها قطع اللحمة المتوسطة التي تزرع في الجسم الحي السابقين الثقافة للمرة المشار إليه. الخلايا الظهارية الخضوع المتفرعة التشكل والتكثيف الوسيطة هو واضح في أقرب وقت 24 ساعة في الثقافة. على نطاق والحانات = 100 ميكرومتر
الشكل 4. Brightfield (A)، فلوري (B) ومتراكبة (C) صور SMGs معاد الذي أصيب فقط الخلايا الظهارية (المبينة في خطوط بيضاء متقطع) مع GFP، معربا عن مثقف واتش فيفو السابقين لمدة 48 ساعة. على نطاق والحانات = 100 ميكرومتر.
highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50060/50060fig5.jpg "/>
الشكل 5. الصور أو الصور brightfield متحد البؤر (BF) من SMGs معاد المسمى مع (A) نوى (دابي والأزرق)، الغدانية GFP (الخضراء) علامة، والظهارية. E-كادهيرين (الأحمر)، على نطاق والحانات = 250 ميكرون، أو، (B) نوى (دابي والأزرق)، الغدانية GFP (الخضراء)، وعلامة الظهارية، E-كادهيرين (الحمراء)، وعلامة الغشاء القاعدي، Perlecan ( سماوي)، على نطاق والحانات = 50 ميكرومتر. متقطع الأبيض ظهارة مخطط خطوط. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 6. العقد تحت الفك السفلي نظير ودي الخضوع ثمرة محوار ويعصب الغدد في الثقافات إعادة التركيب، على نطاق والحانات = 250 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نشرت لأول مرة خارج الجسم تقنية إعادة التركيب الظهارية الوسيطة-الغدد اللعابية تحت الفك السفلي لعام 1981 16. في هذا البروتوكول، ونحن على توسيع الأسلوب الأصلي، وذلك باستخدام عدوى الفيروسة الغدانية للتلاعب الظهارية التعبير الجيني الخلية في سياق غدة معاد. علينا أن نظهر أن يصاب نسبة مئوية من الخلايا الظهارية مع اتش، في حين أن نسبة الخلايا التي يصاب يعتمد على خصائص المروج الفيروسية، عيار الفيروسية، ونقاء الفيروسية. لقد وجدنا انه من الضروري استخدام التدرج CSCL-تنقية الفيروسات لتنبيغ الظهارية فعال، وتنقية الذي لا الموصوفة هنا. منذ كنا أيضا قادرة على إصابة خلايا اللحمة المتوسطة وقبل إعادة التركيب (البيانات لا تظهر)، والتلاعب الجيني مستقلة من السكان الوسيطة هو ممكن أيضا. كنا مؤخرا هذا الأسلوب إعادة التركيب الغدانية ترنسفكأيشن / الأنسجة لتحديد دورلقطبية البروتين، 1B-PAR، في السيطرة على وضع الغشاء القاعدي من قبل ظهارة في تطوير الغدد اللعابية. وكلاهما يستخدم كيناز الميت PAR-1B اتش والبرية من نوع اتش PAR-1B في هذه الدراسة 13 إلى تصيب اساسيات الظهارية ومعاد مع E13 mesenchymes. القدرة على استخدام فيروسات متحولة للتحقيق وظائف محددة من جزيئات يعزز كثيرا من فائدة هذه الطريقة.
لا يوجد حاليا نقص في أدوات فعالة لاستهداف جزيئات محددة داخل الخلايا الظهارية السكان في الغدد اللعابية سليمة الجنينية دون التأثير على حجرة الوسيطة. على الرغم من أن دراسات متعددة قد استخدمت مثبطات الدوائية لمعالجة نقل الإشارة في الثقافات الجهاز سليمة، وهذه تؤثر على كل من مثبطات الظهارة واللحمة المتوسطة. لتقييم آثار مباشرة على مثبطات ظهارة، يجب مثقف اساسيات الظهارية في غياب اللحمة المتوسطة في Matrigel يا إماR-111 laminin المواد الهلامية 6،7. الرناوات المثبطة الصغيرة (siRNAs) هي وسيلة فعالة لأسفل تنظيم التعبير الجيني منذ الظهارية تؤخذ تفضيلي siRNAs من قبل الخلايا الظهارية في وجود حاملات الدهون الأكثر 13،14،17،18. ومع ذلك، لم يكن أي من هذه الأساليب للتدخل مع مستويات البروتين أو وظيفة تسمح overexpression من الجين البرية من نوع أو متحولة. وقد التقى محاولات ترنسفكأيشن التقليدية (غير الفيروسية) من الثقافات الجنينية SMG كله مع نجاح محدود في التي استهدفت عددا صغيرا فقط من الخلايا الظهارية أن يمكن (ML، بيانات غير منشورة). في المقارنة، تنبيغ الغدانية يمثل وسيلة فعالة لوجه التحديد بنقل العدوى إلى الخلايا الظهارية اللعابية.
وقد تم مؤخرا الأعصاب الحركية أظهرت أن تكون حاسمة بالنسبة الغدد اللعابية الطبيعي المتفرعة من خلال المحافظة على الكيراتين الخلية السلف 5-الإيجابية السكان 19. ومن مزايا هذا الأسلوب الأنسجة إعادة التركيب على مدى زارة التربية والعلمenchyme خالية الثقافة رديم الظهارية الطريقة التي يمكن المحافظة على العقدة السمبتاوي نظام إعادة التركيب في الثقافة. من خلال تعقب دقيق للموقع التقريبي للالعقدة السمبتاوي، والذي يقع في اللحمة المتوسطة المجاورة لاصق على الظهارية الأولية 19، فمن الممكن لضمان أن كل رديم ينتهي به الأمر يرتبط العقدة. ومع ذلك، نجد أن من خلال الجمع بين الغدد 3-4 بقيمة mesenchymes مع كل رديم الظهارية، ويرتبط كل رديم مع العقدة كافية لعصب البراعم إلى حد ما (الشكل 6)، وإن لم يكن دائما إلى نفس في غير معدل سليمة الغدد.
هناك طرق بديلة للإصابة الظهارة في سياق الغدة سليمة. ذكرنا سابقا أنه يمكن استخدام حقن مكروي أن أعرض اتش في الخلايا الظهارية في الغدد سليمة 20،21. ومع ذلك، من الصعب حقن مكروي مقاولاترأ، قد تلحق الضرر جسديا الغدد، ويؤدي عادة إلى إصابة مجموعة فرعية فقط من الخلايا المحلية 20. وقد ثبت الغدة المرتبطة الفيروسات (AAV) لتكون مفيدة لترنسفكأيشن من السكان خلية متميزة في سياق سليمة إإكسبلنتس الجهاز SMG 22. وقد أظهرت scAAV2 المصلي أن يكون إلى حد كبير أكثر كفاءة في تنبيغ المحددة للظهارة من SMGs سليمة ناقلات AAV اكثر من غيرها من المؤتلف 23. منذ AAVs ليست متاحة تجاريا على نطاق واسع، ولا الخبرة لإعداد AAV موجودة في معظم المختبرات، قدمت تنبيغ الغدانية والأنسجة بروتوكول إعادة التركيب هنا هو للوصول بشكل أفضل عموما من معظم المختبرات هو استخدام ناقلات AAV.
في حين أن هذا الأسلوب يلخص الأنسجة الظهارية، إعادة التركيب الوسيطة التفاعلات إلى حد ما، فمن الممكن أيضا أن تصيب البشرة مع اتش ومن ثم تنمو الظهارة خارج سياقها الأصلي.كما ذكر سابقا، فإننا المصابين سليمة اساسيات الظهارية اللعابية مع اتش ثم نمت الثقافات في Matrigel مع عوامل النمو خارجيا أضاف 17،20،21. ويمكن أيضا اللعابية إإكسبلنتس الجهاز الغدة يكون مثقف على السقالات nanofiber، رغم أن هذه السقالات لا ألخص وظيفة كاملة من اللحمة المتوسطة في شكلها الحالي 15. في حين لم يكن أي من هذه الأساليب يلخص اللحمة المتوسطة الأصلية، مثل هذه الأساليب تسمح لتقليد الخصائص المحددة للاللحمة المتوسطة في الثقافة فيفو السابقين.
كل ثقافة فيفو السابقين الأسلوب مزاياه وعيوبه ولكن ينطبق على معالجة المسائل علمية محددة. في حين أن الغدد معاد لا يخضع كما المتفرعة الكثير التشكل كما يفعل جهاز الغدد اللعابية سليمة إإكسبلنتس، إإكسبلنتس الجهاز، بشكل عام، ألخص فقط في الجسم الحي المتفرعة التشكل لبضعة أيام. A حل لهذه المشكلة هو بالطبع لجنة المساواة العرقيةيأكلون الحيوانات المعدلة وراثيا تحتوي على التعبير الجيني المستهدفة داخل المقصورة الظهارية. لأنه ليس هناك نقص في المروجين المعروفة التي يتم تنشيطها بشكل خاص في البلدان النامية في وقت مبكر ظهارة SMG، والتكنولوجيا المعدلة وراثيا لا يزال إلى حد كبير أكثر تكلفة من الأساليب المذكورة، وإعادة التركيب الأنسجة التجارب الموصوفة هنا تشكل نظام نموذجي لدراسة قابلة للحياة على حد سواء الخلايا الظهارية والوسيطة في إشارة النامية في وقت مبكر خلايا الغدد اللعابية داخل سياق أنسجتهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور نيلسون ديردري للتعليقات مفيدة وللقراءة نقدية للمخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DE019244، DE019197، وDE021841 لML، F32DE02098001 إلى SJS، وRR015464 C06 إلى الجامعة في ألباني، جامعة ولاية نيويورك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham's F12 Medium without phenol red | Life Technologies | 21041-025 | |
| Penicillin and Streptomycin | Life Technologies | 15070-163 | 10X stock |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | Freeze single use aliquots at -20C |
| BSA | Sigma | A2934-100G | Fraction V, low endotoxin |
| Adeno-X-GFP | BD Biosciences | 8138-1 | Should be high titer (1x1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay. |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v) |
| 1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | Prepared from 10X stock |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14175095 | no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red |
| Transferrin | Sigma | T8158 | 25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma | A4403 | 75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C |
| Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol. | |||
| 10 cm sterile plastic dishes | Corning | 430167 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo dissecting microscope with transmitted light base | Nikon | SMZ645 | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| 35 mm tissue culture dishes | Falcon | 353001 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm diameter microwell dishes | MatTek Corporation | P50-G-1.5-14F | |
| Nuclepore Track-Etch membrane filters | Whatman | 110405 | 13 mm diameter, 0.1 mm pore size |
| Widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss, USA | Axio Observer Z1 | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm | Fine Science Tools | 11252-20 | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm | Fine Science Tools | 11295-20 | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol. | |||
References
- Tucker, A. S. Salivary gland development. Seminars in cell & developmental biology. 18, 237-244 (2007).
- Sakai, T., Onodera, T. Embryonic organ culture. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19 (2008).
- Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. Salivary gland branching morphogenesis. Differentiation. 74, 349-364 (2006).
- Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).
- Zheng, C., et al. Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland. J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).
- Larsen, M., et al. Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis. Developmental biology. 255, 178-191 (2003).
- Hoffman, M. P., et al. Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms. Development. 129, 5767-5778 (2002).
- Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development. Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).
- Partanen, A. M., Thesleff, I. Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture. Differentiation. 34, 25-31 (1987).
- Naka, T., et al. Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate. In Vivo. 19, 883-888 (2005).
- Bornstein, P., Traub, W. The chemistry and biology of collagen. The Proteins. Neurath, H., Hill, R. L. 4, 3rd, Academic Press. 412-632 (1979).
- Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture. Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).
- Daley, W. P., et al. ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity. Development. 139, 411-422 (2012).
- Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis. Developmental biology. 336, 169-182 (2009).
- Sequeira, S. J., et al. The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds. Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).
- Nogawa, H., Mizuno, T. Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development. Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423, 876-881 (2003).
- Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science. 329, 1645-1647 (2010).
- Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis. J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).
- Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells. Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).
- Zheng, C., Baum, B. J. Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands. Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).
- Hsu, J. C., et al. Viral gene transfer to developing mouse salivary glands. J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).
