Summary
유전자 전체에서 상피 세포를 조작하는 기술
Abstract
morphogenesis을 분기하는 많은 기관의 개발 기간 동안 발생하며, 배아 마우스 턱밑의 선 (SMG)는 morphogenesis을 가지 연구를위한 클래식 모델입니다. - 궁극적으로 구강 하나에 각각 침을 생산 및 수정 / 전송하기 위해 사용될 acini과 관의 복잡한 분지 네트워크에 상승을 제공하기 위해 상피 봉오리 덕트 형성 단계를 반복 개발 SMG,이 과정은 포함 3. 어떻게 세포와 분자 이벤트가 제대로 이해 남아 조정 아르하지만 상피 - 관련 지하 막하고 이러한 세포에 의해 생산 mesenchyme 세포, 성장 인자와 세포 외 기질을 포함하는 중간 엽 구획의 측면은, 분기 메커니즘에 중요한 사 . 분자 메커니즘의 연구는 상피 morphogenesis 진행에게 발달 메커니즘에 대한 우리의 이해를 운전 가능한 regener에 대한 통찰력을 제공합니다ative 의학 접근. 이러한 연구는 침 상피의 유전자 조작에 대한 효과적인 방법의 부족으로 인해 방해되었습니다. 현재 adenoviral 도입은 생체 5 성인 분비에 상피 세포를 타겟팅하는 가장 효과적인 방법을 나타냅니다. 그러나 배아 explants에서 조밀 mesenchyme과 상피 세포를 둘러싸고있는 지하 막는 상피 세포에 바이러스 접근을 막는. mesenchyme가 제거되면, 상피는 adenoviruses를 사용하여 transfected 수 있고, 상피 초보는 Matrigel 또는 laminin-111 6,7의 존재에 morphogenesis을 분기 재개 할 수 있습니다. Mesenchyme 무료 상피 흔적 기관의 성장은 수용성 성장 요인으로 추가 보완이 필요하고 그대로 땀샘 8 발생할 때 완전히 분기 morphogenesis을 요점을 되풀이하지 않습니다. 여기 transfected 전자의 상피 세포와 문화의 adenoviral 전달을 용이하게하는 기술을 설명관련 정보 mesenchyme있는 pithelium. 배아 SMGs, mesenchyme의 제거, 그리고 GFP 함유 아데노 바이러스와 상피의 바이러스 감염의 microdissection 따라, 우리는 상피가 저절로 그대로 SMG 선의 구조를 recapitulating하고 morphogenesis을 분기, 감염되지 않은 mesenchyme과 recombines을 보여줍니다. 유전자 변형 상피 세포 인구는 쉽게 휘황 태그 경우 adenoviral 구조가 사용되는 표준 형광 현미경 방법을 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 조직 재조합 방법은 현재 유전자 변형 동물의 생성을 필요로하지 않습니다 복잡한 3D 조직 구조 내에서 야생 형 또는 돌연변이 벡터와 상피 세포의 transfection을위한 가장 효과적이고 접근 방법입니다.
Protocol
프로토콜은 그림 1에 설명 된 네 개의 주요 단계가 포함되어 있습니다. 모든 단계는 전체 자세히 설명되어 있습니다. 아데노 바이러스 건설 바이러스 정화는 해부하는 상피 초보의 유전 형질 도입에 사용하기 위해 장기 수확을 사전에 수행해야합니다. adenoviruses과 함께 작업 할 때 모든 표준 BSL-2 안전 조치를 준수해야합니다.
1. 마우스 배아 턱밑 분비선 (SMG) 수확 및 Microdissection
- 배아 일 13시 마우스 배아의 자궁 전위와 수확 문자열 (E13, 3-5 상피 꽃 봉오리) 기관 IACUC의 승인을 다음 절차에 이어 CO 2 마취법을 사용하여 시간 제한이 초과 임신 여성 마우스 (outbred 변형 CD-1 또는 ICR)을 안락사시켜야 위원회. 질 플러그 발견의 날은 E0로 지정되어 있습니다. 갈라진 틈은 단지 시작과 하나의 주요 꽃 봉오리와 줄기가있을 때 침샘도 E12 단계에서 수확하고 배양 할 수 있습니다시작합니다. 이전 단계에 SMGs 여기에 표시된 것보다 다른 문화 조건을 필요로합니다.
- 페놀 레드 (생명 기술), 100 U / ML 페니실린과 보충, 100 μg / ML의 스트렙토 마이신 (펜 패 혈성이 부족한 DMEM / 햄의 F12 매체 (F12)의 25 ML로 가득 무균 10cm 조직 문화 요리에 배아 문자열을 전송, 생활 기술을).
- 멸균 메스 (# 11 블레이드)와 집게를 (# 5, 정밀 과학 도구, 11252-20)를 사용하여, DMEM/F12 + 펜 패 혈성의 25 ML을 포함하는 별도의 10cm 접시에 주머니에서 배아를 제거합니다.
- 단지 아래턱 아래의 각진 컷으로 배아 머리를 자르다.
- 상단 턱 아래 컷을 사용하여 전송 라이트베이스 (니콘 SMZ645 또는 동급)와 스테레오 해부 현미경 헤드의 낮은 개미를 분리합니다. 유리의 추가 작품의 상단에보다는 직접 현미경베이스의 유리 구성 요소에 조직을 배치합니다.
- DM 3 ML로 낮은 개미를 수집EM/F12 + 살균 35mm 조직 배양 접시에 펜 패 혈성.
- 혀는 슬라이스의 맨 아래에 있지만 12시시 위치쪽으로 향하고되도록 해부 현미경 무대에 턱이 슬라이스를 놓습니다.
- scissoring 모션에서 두 짓밟 포셉의 한면을 사용하여 제거하고 아래턱 슬라이스의 3분의 1 낮은 회를 폐기하십시오.
- 포셉과 scissoring 컷을 사용하여 슬라이스 90 오른쪽에 ° (오른 손잡이 경우) 등을 돌려, 중간 슬라이스로 아래턱 슬라이스의 상단 부분을 (혀를 절단하지 않고) 절단.
- 필 초과 거리에 조직과 아래 SMGs를 노출 할을 제거합니다. 혀의 기지 근처 각면에 하나가 될 것입니다.
- 혀에 의해 조직을 누르고 포셉 한 쌍의를 사용하여 혀에서 SMG을 멀리 감히 다른 집게를 사용합니다. 다른 선에 대해 반복합니다.
- 새로운 살균 35mm 조직에 DMEM/F12 + 펜 패 혈성 3 ML에 microdissected 침샘을 수집배양 접시. 참고 : 연결된 작은 sublingual 글 랜드 (1 꽃 봉오리)와 함께 큰 턱밑 분비 (3-5 상피 꽃 봉오리)이 4 단계로 건너와 단계 4.1 4.3 수행하고, 4.4에서 그대로 배양 할 수와 같은 이전에 2,8 설명했다.
2. 상피 흔적 기관 분리를 SMG
- 장소 5 (이상) 행크의 균형 소금 솔루션 200 μl (HBSS는 칼슘이 부족한를 포함하는 유리 바닥, 50mm 직경 microwell 요리 (MatTek 공사, P50G-1.5-14-F)로 침샘 + + 또는 MG + +, 생명 기술) 0.4 %를 포함 (V / V) dispase (생명 기술, 고양이. 안돼. 17105-041)와 37 15 분에 품다 ° C.
- 부화 후, 멸균 200 μl 피펫 팁 사용하여 조심스럽게 분비를 방해하지 않으면 서 dispase 솔루션을 기음. 즉시 BSA (DMEM/F12-BSA, 필터 0.22 μm와 사전 소독)는 dispase을 중화하는데 5 % (w / v를) 포함 DMEM/F12 미디어 200 μl를 추가합니다. <리> 해부 현미경에서 좋은 팁 (# 5 Dumostar 좋아, 과학 도구, 11295-20)와 포셉 한 쌍의를 사용하여 부드럽게 상피를 그대로 유지하도록 관리하고, SMG 상피 꽃받침과 구멍 주변에서 느슨해 mesenchyme을 분리 .
- 사전 젖은 멸균 200 μl 피펫의 DMEM/F12-BSA 매체와 팁 부드럽게 DMEM/F12 200 μl + 펜 패 혈성을 포함하는 새로운 50mm 직경 microwell 요리로 상피 초보를 피펫. 부드러운 가장자리와 높은 품질을 200 μl 피펫 팁을 사용합니다.
- mesenchyme 조각을 포함하는 음식에서 sublingual 분비와 분리 턱밑 글 랜드 꽃 봉오리를 포함하여 비 중간 엽 조직을 폐기합니다.
3. 상피 초보의 Adenoviral 감염
- 결과 솔루션의 titer는 1x10 8 -10 9 PFUs이되도록 microcentrifuge 관 DMEM/F12 + 펜 패 혈성에 대한 관심의 아데노 바이러스를 diluting하여 바이러스 감염 미디어 200 μl를 확인합니다.다른 바이러스에 필요한 최적의 titer는 다를 수 있습니다. 이 세슘 염화물 (CsCl) - 정화 최적의 통풍 관 효율을위한 바이러스 준비를 사용하는 것이 중요합니다.
- 다섯 상피 초보가 포함 된 음식에서 미디어를 제거합니다. 신속 항상 초보가 젖 유지, 감염 미디어 200 μl를 추가합니다. 바이러스를 처리하고 오염 pipet 팁 폐기에 필요한주의 사항을보십시오. 10 % 표백제 솔루션 바이러스 오염 된 표면을 소독.
- 같이 가겠다는에서 그들을 방지하고 그들에게 접시의 바닥에 정착 할 수 있도록 집게와 멀리 떨어져 서로 상피 초보를 이동합니다. 상온에서 1 시간에 바이러스 성 미디어 초보를 품다. 사람들이 가까운 곳에 이동하면 부화하는 동안, 초보를 구분합니다. 과도한 흔들거나 운동이 선들이 함께 덩어리 할 수 있습니다.
- 부화 후, 부드럽게 바이러스 함유 미디어를 제거하고 적절하게 폐기, 연구를 중단하지 돌봐udiments. DMEM/F12 + 펜 패 혈성 200 μl를 추가합니다. 이 세차 적어도 두 번 이상 반복하고 DMEM/F12 + 펜 패 혈성 미디어 200 μl로 교체하십시오. 이 세차 강력 상피에 부착되지 않은 바이러스를 제거하고 mesenchyme의 감염을 방지하기 위해 중요합니다.
- DMEM/F12 200 ML 2 %를 포함과 상피 초보를 배양 (V / V) 20 분에 Matrigel (BD Biosciences, 356231). 우리는 Matrigel이 짧은 부화가 초기 문화 기간 동안 기존의 갈라진 틈의 회귀를 최소화 발견,이 단계는 Matrigel에 노출이 원하는하지 않은 경우에 투여 할 수 있습니다.
재결합 SMGs 4. 예를 생체 문화
- 노치 (작은 컷)의 상단에, 사전 젖은 200 μl 피펫 팁을 사용하여 각 퇴화 기관, 한 번에 하나를 놓고 13mm, 0.1 μm 문화 미디어 200 μl (를 떠 Nuclepore 트랙 - 에칭 막 필터 (워트 먼지) 바닥이 유리로 microwell 판 5 초보 / 필터). 문화 미디어입니다 : DMEM/F12 + 펜 패 혈성은 50 μg / ML 트랜스페린과 150 μg / ML 아스코르브 산 등 이전에 2,8 설명을 포함. 트랜스페린은 생존을 촉진하는 것으로 알려져 있으며 침샘과 다른 장기의 explants 9 morphogenesis을 가지입니다. 아스코르브 산의 추가는 SMG 브랜칭을 촉진하기 위해 표시되었습니다. (10)는 이것은 신진 대사 경로 (예 : 콜라겐 섬유 형성 11시 프롤린 hydroxylation 등)의 많은 hydroxylation 반응에 cofactor 역할을하는 것으로 알려져 있으며, 다른 장기의 explants에서 fibronectin과 laminin 생산을 자극합니다 12.
- 각 상피 흔적 기관을 추가 한 후 가능한 한 필터의 상단에 많이 미디어로 제거합니다. 필터의 상단에 너무 많은 미디어가 적은 미디어 초보의 배치를 할 동안, 필터가 침몰의 원인과 훨씬 쉽게 mesenchyme 수 있습니다. 초과 미디어는 피펫 팁이나 조언의 미디어를 놓치 집게를 사용하여 하나 제거 할 수 있습니다.
- 장소 mesenchyme 조각이 서있는 파생상단 및 / 또는 각 상피 흔적 기관 주위 m 3-4 분비. 멀리 초보에서 mesenchyme의 움직임을 피하기 위해이 선들을 둘러싼되는 추가 미디어를 제거합니다. 더 많은 선들에서 파생 Mesenchyme가 도움이되지 않습니다 미만 상피 흔적 기관의 성장에 해로운 수 있습니다.
- 원하는대로, 48 -72 시간에 37 ° C에서 humidified 인큐베이터 (95% 공기 / 5퍼센트 CO 2)에 재결합 SMGs을 품다.
- brightfield 및 / 또는 형광성 0 시간 라이브 분비의 이미지 (원하는 경우), 재결합 후 2 시간하고 4X 또는 5 배 확대 목표를 사용하여 디지털 카메라를 갖추고, 역 수직, 또는 스테레오 가벼운 현미경에 이후 모든 24 시간을 습득 보기의 단일 프레임에 전체 재결합 선을 캡처합니다. 침샘의 이미지는 빛 경로 (이 완전 자동화 된 현미경에 수 없습니다)에 부품 방법을 배치 brightfield 설정하거나 적절한 단계 링을 사용하여 최적의 대비를 보여줍니다. 표준 위상 대비는 없습니다필요 t는 선 육중하고 있기 때문에 대비를 만듭니다.
- 원하는 시간 점에서 재결합 SMGs은 5 % (w / V) 자당을 (더 나은에 세포를 유지하여 내부 세포 구조를 유지하기 위해 포함 1X PBS에 2 % paraformaldehyde (PFA)로 만든 정착액 솔루션을 20 분 고정 할 수 있습니다 isosmotic 주). 정착액이 완전히 고정 후 제거하면 4% 달리 PFA, 2퍼센트 PFA는 GFP 신호의 상당한 양을 유지합니다. 선들은 4에서 어둠 속에서 1X PBS에서 일주까지에 저장할 수 있습니다 ° C 전체 마운트 immunocytochemistry 및 공 촛점 이미징이 수행 될 때까지 이전과 같이 3,6,13-15 보도했다. 이상적으로, immunocytochemistry 및 이미징은 최고 품질의 이미지를 얻기 위해 고정 후 곧 수행해야합니다. 분비는 서양 blotting 분석에 이어 SDS-PAGE에 RIPA 버퍼에 lysed 될 수 있습니다.
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Representative Results
주요 실험 단계의 흐름은 그림 1에 설명되어 있습니다. 그대로 SMG 고립 된 상피 흔적 기관 및 해당 mesenchyme의 예는 그림 2에 표시됩니다. 지정된 시간에 대한 양식 예를 생체가 그림 3에 표시됩니다 때 morphogenesis을 분기 받아야 계속 재결합 SMGs의 Brightfield 이미지. 상피 GFP를 표현하는 48 시간에 성장 재결합 분비가 그림 4에 표시됩니다. 재결합 SMGs의 공 촛점 이미지는 고정 및 이미징 immunocytochemistry 다음 문화의 72 시간 후, 그림 5에 표시됩니다. 상피 마커, E-cadherin은 주변 mesenchyme에서 GFP-표현 상피 세포 인구를 demarcates. 상피의 주변에서 지역화 지하 막 단백질, perlecan의 검색은 재결합 분비의 지하 막 중 적어도 일부 reconstitution을 보여줍니다. Figure 6. 부교감 턱밑 신경절은 neurite 가지를 받아야하고 이전에 보여준으로 재결합 문화의 분비를 신경을 분포시키다. 19
그림 1. (A) 흐름도와 (B) 도식은 주요 실험 단계를 묘사.
그림 2. Brightfield (A) 전체 배아 일 13 일 (E13) sublingual 글 랜드 상피 (SL 에피)와 mesenchyme (MES)에 의해 둘러싸인 턱밑 글 랜드 상피를 (SMG 에피) 표시 침샘의 이미지. (B) 절연 상피 흔적 기관, 그리고 (C) Mesenchyme을 분리. 스케일 바 = 100 μm.
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그림 3. 지정된 시간에 대한 예 생체 문화에서 자란 mesenchyme 조각으로 둘러싸인 상피 초보의 Brightfield 이미지 (흰색 점선으로 설명). 상피 세포가 morphogenesis을 분기 받아야하고 중간 엽 결로 문화에서 24 시간으로 일찍 분명하다. 스케일 바 = 100 μm
그림 4. Brightfield (A), 형광등 (B) 만 상피 세포 (흰색 점선에 명시된) 48 시간 용 GFP-표현 아데노 바이러스와 배양 예를 생체에 감염 된에 재결합 SMGs의 겹쳐 (C) 이미지. 스케일 바 = 100 μm.
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그림 5. (A) 핵 (DAPI, 파란색), adenoviral GFP (녹색), 상피 마커 라벨이 재결합 SMGs의 공 촛점 이미지 나 brightfield 이미지 (BF). E-cadherin (빨간색), 스케일 바 = 250 μm, 또는 (B) 핵 (DAPI, 파란색), adenoviral GFP (녹색), 상피 마커, E-cadherin (빨간색) 및 지하 막 마커, Perlecan ( 시안), 규모 바 = 50 μm. 흰색 라인 개요 상피를 점선은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 6. 부교감 턱밑 신경절은 neurite 가지를 받아야하고 재결합 문화, 스케일 바 = 250 μm의 분비를 신경을 분포시키다.
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Discussion
예 생체 상피 - 중간 엽 재조합 기술이 처음 1981 16 턱밑 침샘에 출판되었다. 이 프로토콜에서는, 우리는 재결합 선의 컨텍스트 내에서 상피 세포의 유전자 발현을 조작하는 adenoviral 감염를 사용하여 원래의 방법에 따라 확장합니다. 우리는 감염된 세포의 비율은 바이러스 발기인의 속성, 바이러스 titer 및 바이러스 순도에 따라 달라집니다 반면, 상피 세포의 비율은, 아데노 바이러스에 감염되어 있는지 보여줍니다. 우리는 효율적으로 상피 도입, 여기에 설명되지 않은의 정화를 위해 CsCl 기울기 - 정화 바이러스를 사용하는 데 필요한 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 이전에 재결합 (데이터 미도시)에 mesenchyme 세포를 감염 할 수 있었던 때문에, 중간 엽 인구의 독립적 인 유전자 조작도 가능합니다. 우리는 최근 역할을 식별하는 데이 adenoviral transfection / 조직 재조합 방법을 사용극성 단백질, PAR-1B를 들어, 침샘을 개발 상피의 지하 막의 위치의 통제 인치 키나제 - 죽은 PAR-1B의 아데노 바이러스 및 야생 형 PAR-1B의 아데노 바이러스는 상피 초보를 감염이 연구 13 사용하고 E13 mesenchymes과 재결합 된 두. 특정 분자의 기능을 심문하는 돌연변이 바이러스를 사용하는 능력은 크게이 방법의 유용성을 향상시킵니다.
중간 엽 구획에 영향을주지 않고 그대로 배아 침샘의 상피 세포 인구 내의 특정 분자를 타겟팅하는 효과적인 도구의 부족은 현재이 있습니다. 여러 연구 그대로 장기 문화의 신호 전달을 조작하는 약리 억제제를 사용했지만, 이러한 억제제는 상피와 mesenchyme 모두에 영향을 미칩니다. 직접 상피에 억제제의 효과를 평가하기 위해, 상피 초보는 Matrigel O 중 하나에 mesenchyme의 부재에서 배양해야합니다R laminin-111 젤 6,7. 작은 억제 RNAs (siRNAs)는 siRNAs은 우선적으로 대부분의 지질 사업자 13,14,17,18의 면전에서 상피 세포에 의해 촬영되어 있기 때문에 상피 유전자 발현을 조절 - 할 수있는 효과적인 방법입니다. 그러나, 둘 다 단백질 수준 또는 기능을 방해를위한 방법 중 야생 형 또는 돌연변이 유전자의 overexpression을 허용하지 않습니다. 태아의 전체 SMG 문화의 전통 (비 바이러스 성) transfection의 시도는 상피 세포의 극히 번호가 (ML, 게시되지 않은 데이터) 타겟팅 할 수 있습니다한다는 점에서 제한된 성공 충족시켜 왔습니다. 비교에서 adenoviral 전달 특별히 침 상피 세포를 transfecting위한 효과적인 방법을 나타냅니다.
부교감 신경이 최근 각질 5 긍정적 인 전구 세포 인구 19 유지하여 분기 정상적인 침샘에 중요 할 표시되었습니다. MES 이상이 조직 재조합 방법의 장점enchyme 무료 상피 흔적 기관 문화 방법은 부교감 신경이 재결합 문화 시스템에서 유지 될 수 있다는 것입니다. 기본 상피 덕트 19 인접 mesenchyme에있는 부교감 신경의 대략적인 위치에주의를 추적함으로써, 각각의 퇴화 기관가 신경절와 연결되는 끝 있도록 할 수 있습니다. 그러나 우리가 아니라, 항상이기는하지만 그대로 수정되지 않은에서와 같이 동일한까지 모든 상피 흔적 기관으로 mesenchymes의 가치가 3-4 분비를 결합하여, 각 퇴화 기관이 어느 정도 (그림 6)에 눈을 신경을 분포시키다하기에 충분한 신경과 연결되어 발견 분비.
그대로 선의 맥락에서 상피를 감염에 대한 대체 방법이 있습니다. 우리는 이전에 microinjection은 그대로 분비 20,21에 상피 세포에 아데노 바이러스를 소개하는 데 사용할 수 있다고보고했다. 그러나, microinjection은 contr하기 어렵습니다안녕, 실제로이 선들에 손상을 줄 수 있으며, 일반적으로 세포 20 만 지역화 된 하위 집합의 감염 발생합니다. Adeno-관련 바이러스 (AAV)는 그대로 SMG 장기 explants (22)의 컨텍스트 내에서 고유 한 세포 인구의 transfection에 유용 할 표시되었습니다. 혈청 형 scAAV2이 다른 재조합 AAV 벡터 23 이상 그대로 SMGs의 상피의 특정 형질 도입에 실질적으로보다 효율적으로 표시했습니다. AAVs이 널리 상업적으로 사용할 수 없습니다하거나 전문 지식이 가장 실험실에서 AAV가 존재 준비하는 것 때문에, adenoviral 전달 및 조직 재조합 프로토콜은 AAV 벡터의 사용보다는 대부분의 실험실에 더 일반적으로 액세스 할 수 있습니다 여기에 제공됩니다.
어느 정도이 조직 재조합 방법 recapitulates는 상피 - 중간 엽 상호 작용 반면, 아데노 바이러스로 상피를 감염하고 그 기본 컨텍스트 외부의 상피 성장을 할 수도 있습니다.앞서 언급 한 바와 같이, 우리는 아데노 바이러스와 함께 그대로 침 상피 초보를 감염하고 exogenously 추가 성장 요인 17,20,21과 Matrigel의 문화를 성장했다. 이 공사장 공중 발판이 현재의 형태로 15 mesenchyme의 전체 기능을 요점을 되풀이하지는 않지만 침샘 오르간 explants 또한, nanofiber의 공사장 공중 발판을 배양 할 수 있습니다. 이러한 방법의 recapitulates 기본 mesenchyme의도는, 이러한 방법은 예 생체 문화의 mesenchyme의 특정 속성을 모방 할 수 있도록하는 동안.
각 예 생체 문화 방법은 자신의 장점과 단점을 가지고 있지만 특정 과학 질문의 해결을 위해 적용됩니다. 일반적으로 손상 침샘 오르간 explants, 장기의 explants를 할만큼 morphogenesis을 분기로 재결합 분비가 받아야하지 않지만, 오직 생체가 몇 일 동안 morphogenesis을 분기에서 요점을 되풀이하다. 이 문제에 대한 해결책은 cre에 물론입니다상피 구획 내에서 대상 유전자 발현을 포함하는 유전자 변형 동물을 먹었다. 초기 SMG 상피 개발에 구체적으로 활성화하고, 유전자 변형 기술은 설명 방법보다 훨씬 더 비싼 남아 아르 알려진 발기인의 부족이 있기 때문에, 여기에 설명 된 조직 재조합 실험에서 신호 모두 상피와 중간 엽 세포를 연구하기위한 가능한 모델 시스템을 구성 초기의 조직 컨텍스트 내에서 침샘 세포를 개발.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 도움이 의견들과 원고의 중요한 독서 박사 드레 넬슨 감사드립니다. 이 작품은 올 버니에있는 대학 SUNY에 대한 NIH 보조금 DE019244, DE019197, 그리고 DE021841 ML까지, F32DE02098001 SJS까지, C06 RR015464로 운영되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham's F12 Medium without phenol red | Life Technologies | 21041-025 | |
| Penicillin and Streptomycin | Life Technologies | 15070-163 | 10X stock |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | Freeze single use aliquots at -20C |
| BSA | Sigma | A2934-100G | Fraction V, low endotoxin |
| Adeno-X-GFP | BD Biosciences | 8138-1 | Should be high titer (1x1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay. |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v) |
| 1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | Prepared from 10X stock |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14175095 | no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red |
| Transferrin | Sigma | T8158 | 25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma | A4403 | 75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C |
| Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol. | |||
| 10 cm sterile plastic dishes | Corning | 430167 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo dissecting microscope with transmitted light base | Nikon | SMZ645 | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| 35 mm tissue culture dishes | Falcon | 353001 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm diameter microwell dishes | MatTek Corporation | P50-G-1.5-14F | |
| Nuclepore Track-Etch membrane filters | Whatman | 110405 | 13 mm diameter, 0.1 mm pore size |
| Widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss, USA | Axio Observer Z1 | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm | Fine Science Tools | 11252-20 | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm | Fine Science Tools | 11295-20 | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol. | |||
References
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- Sakai, T., Onodera, T.
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- Larsen, M., et al. Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis. Developmental biology. 255, 178-191 (2003).
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