Summary
En teknikk for å genetisk manipulere epitelceller i hele
Abstract
Forgrening morphogenesis oppstår under utviklingen av mange organer, og embryonale mus submandibular kjertel (SMG) er en klassisk modell for studiet av forgrening morphogenesis. I utviklingsland SMG, innebærer denne prosessen iterative trinn epitelisk knopp og kanalsystem formasjon, til slutt gir opphav til et komplekst forgrenet nettverk av acini og kanaler, som tjener til å produsere og modifisere / transportere spytt, henholdsvis inn i munnhulen 1 - 3. Epiteliale-assosiert basalmembran og aspekter ved mesenchymale kupeen, inkludert mesenchyme cellene, vekstfaktorer og den ekstracellulære matrix, produsert av disse celler, er avgjørende for den forgrenede mekanismen, selv hvor de cellulære og molekylære hendelser koordineres forblir dårlig forstått 4 . Studiet av de molekylære mekanismene kjører epiteliale morphogenesis fremskritt vår forståelse av utviklingsmessige mekanismer og gir innsikt i mulige regenerativAtive medisin tilnærminger. Slike studier har blitt hemmet på grunn av mangel på effektive metoder for genetisk manipulasjon av salivary epitel. For tiden representerer adenoviral transduksjon den mest effektive metoden for målretting epitelceller i voksen kjertler in vivo 5. Imidlertid i embryonale eksplanter, hemmer tett mesenchyme og basalmembran omgir epitelceller viral tilgang til epitelceller. Dersom mesenchyme er fjernet, kan epitelet bli transfektert med adenovirus, og epiteliale rudimenter kan gjenoppta branching morphogenesis i nærvær av Matrigel eller laminin-111 6,7. Mesenchyme-free epitelial rudiment vekst krever også ekstra tilskudd med oppløselige vekstfaktorer og ikke fullt rekapitulere forgrening morphogenesis som det skjer i intakte kjertler 8. Her beskriver vi en teknikk som letter adenovirale transduksjon av epitelceller og kultur av transfekterte epithelium med tilhørende mesenchyme. Etter mikrodisseksjon av embryonale maskingeværer, fjerning av mesenchyme, og viral infeksjon i epitelet med en GFP-holdig adenovirus, viser vi at epitelet spontant recombines med infisert mesenchyme, rekapitulere intakt SMG glandular struktur og forgrening morphogenesis. Den genmodifiserte epitelcelleopprinnelse befolkningen kan lett overvåkes ved hjelp av standard fluorescens mikroskopi metoder, hvis fluorescently-merket adenovirale konstruerer brukes. Vevet rekombinasjon metoden beskrevet her er for tiden den mest effektive og tilgjengelige metode for transfeksjon av epitelceller med en vill-type eller mutert vektor i en kompleks 3D vev konstruere som ikke krever generering av transgene dyr.
Protocol
Protokollen inneholder fire hovedtrinn, som avbildet i figur 1.. Alle trinn er beskrevet i detalj. Adenovirus konstruksjon og viral rensing bør utføres i forkant av organrøveri for bruk i den genetiske transduksjon av dissekert epiteliale rudimenter. Alle standard BSL-2 sikkerhetsregler bør følges når man jobber med adenoviruses.
1. Mus Embryonic submandibular kjertel (SMG) Høsting og mikrodisseksjon
- Avlive tidsstyrt gravide hunnmus (outbred stamme CD-en eller ICR) ved hjelp av CO 2 narkose, etterfulgt av cervical forvridning og høste strenger av mus embryoer på embryonale dag 13 (E13, 3-5 epiteliale knopper) følgende prosedyrer godkjent av institusjonelle IACUC komiteen. Dagen for vaginal plugg funnet er utpekt som E0. Spyttkjertlene kan også høstes og kultiveres på E12 scenen når det er et enkelt primær knopp og stilk med kløfter bare starteå starte. Maskingeværer før dette stadiet krever ulike kultur vilkår enn dem som er nevnt her.
- Overfør embryo strenger i sterile 10 cm vevskultur retter fylt med 25 ml av DMEM / Ham 's F12 medium (F12) mangler fenolrødt (Life Technologies) og supplert med 100 U / ml penicillin, og 100 ug / ml streptomycin (penn-strep, Life Technologies).
- Ved hjelp av en steril skalpell (# 11 blader) og tang (# 5, Fine Science Verktøy, 11252-20), fjerne embryoene fra sacs i en egen 10 cm tallerken med 25 ml DMEM/F12 + penn-strep.
- Sever embryoet hoder med en vinklet snitt rett under underkjeven.
- Isoler de nedre mandibles fra hodene under et stereo disseksjonsmikroskop med et utsendt lys base (Nikon SMZ645 eller tilsvarende) med en kutt under den øvre kjeve. Plasser vev oppå en ekstra stykke glass i stedet for direkte på glasset komponenten av mikroskop base.
- Samle de lavere mandibles i 3 ml DMEM/F12 + penn-strep i et sterilt 35 mm vevskultur parabolen.
- Plasser en kjeven stykke på disseksjonsmikroskop scenen slik at tungen er på bunnen av stykket, men peker mot 12:00 posisjon klokken.
- Bruke den ene siden av to korslagte tang i en klipping bevegelse, og ta bort den nederste 1/3 rd av kjeven stykket.
- Vri skive 90 ° til høyre (hvis høyrehendt) og, ved hjelp av en klipping snitt med pinsett, kutt den øverste delen av kjeven stykke (uten å kutte tungen) halvveis inn i stykket.
- Skrell overflødig vev bort og fjerne den for å avsløre maskingeværer under. Det vil være en på hver side i nærheten av bunnen av tungen.
- Ved å bruke en pinsett til å holde ned vev av tungen, bruker de andre pinsett for å erte SMG bort fra tungen. Gjenta for den andre kjertelen.
- Samle microdissected spyttkjertler i 3 ml DMEM/F12 + penn-strep inn i en ny steril 35 mm vevkultur parabolen. Merk: de større submandibular kjertler (3-5 epiteliale knopper) sammen med den tilkoblede mindre sublingual kjertel (1 knopp) kan dyrkes intakt ved å hoppe til trinn 4 og gjennomføre punkt 4.1, 4.3, og 4.4, som beskrevet tidligere 2,8.
2. SMG epithelial rudiment Separasjon
- Plass 5 (eller mer) spyttkjertler i et glass-bunnen, 50 mm diameter mikrobrønn parabolen (Mattek Corporation P50G-1.5-14-F) som inneholder 200 ul Hanks balanserte saltløsning (HBSS mangler Ca + + eller Mg + +, Life Technologies) inneholdende 0,4% (v / v) dispase (Life Technologies, katt. nei. 17105-041) og inkuber i 15 min ved 37 ° C.
- Etter inkuberingen ved hjelp av en steril 200 pl pipettespiss forsiktig aspirate ut dispase løsningen uten å forstyrre kjertlene. Umiddelbart tilsett 200 ul av DMEM/F12 media inneholdende 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, pre-sterilisert med et 0,22 mikrometer filter) for å nøytralisere dispase. <li> Under en disseksjonsmikroskop, ved hjelp av en pinsett med fine tips (# 5 Dumostar, Fine Science Verktøy, 11295-20), forsiktig skille løsnet mesenchyme fra rundt SMG epiteliale knopper og kanaler, ta vare å forlate epitelet intakt .
- Pre-vått en steril 200 pl pipettespiss med DMEM/F12-BSA media og forsiktig pipetteres ut epiteliale barnelærdom inn i en ny 50 mm diameter mikrobrønn tallerken med 200 ul DMEM/F12 + penn-strep. Bruke en høy kvalitet 200 pl pipettespiss med en jevn kant.
- I parabolen som inneholder mesenchyme stykker, kast ikke-mesenchymale vev inkludert sublingual kjertler og eventuelle frittliggende submandibular kjertel knopper.
3. Adenoviral Infeksjon i Epiteliale barnelærdom
- Lag 200 ul virusinfeksjon medier ved å fortynne adenovirus av interesse i DMEM/F12 + penn-strep i en mikrosentrifuge rør slik at titeren av den resulterende løsning er 1x10 8 -10 9 PFUs. Denoptimale titer kreves for ulike virus kan variere. Det er viktig å bruke cesiumklorid (CsCl)-renset viral preparater for optimal opptak effektivitet.
- Fjern materialet fra parabolen inneholder de fem epiteliale barnelærdom. Raskt legge 200 ul av infeksjonen mediene, holde rudimenter våt til alle tider. Ta nødvendige forholdsregler ved håndtering av virus og avhending av forurensede pipettespisser. Desinfiser eventuelle virus-forurensede overflater med 10% blekemiddel.
- Flytt epiteliale rudimentene langt unna hverandre med pinsett for å hindre at de kleber seg sammen og tillate dem å synke til bunnen av platen. Inkuber rudimenter i viral medier i 1 time ved romtemperatur. Under inkuberingen skille rudimenter, hvis de flytter tett sammen. Overdreven rocking eller bevegelse vil tillate kjertlene å klumpe seg sammen.
- Etter inkubasjon forsiktig fjerne viral-holdige medier og kast riktig, tar seg ikke å forstyrre rudiments. Tilsett 200 ul DMEM/F12 + penn-strep. Gjenta dette vask minst to ganger og erstatte med 200 ul DMEM/F12 + penn-strep media. Disse vasker er avgjørende for å fjerne eventuelle virus som ikke sterkt knyttet til epitel og for å hindre smitte av mesenchyme.
- Inkuber epiteliale rudimenter med 200 ml DMEM/F12 inneholdende 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356231) i 20 min. Vi finner at denne korte inkubasjon i Matrigel minimerer regresjon av eksisterende kløftene under den innledende kulturen perioden, men dette trinn kan utelates dersom eksponering Matrigel ikke er ønskelig.
4. Ex vivo Culture of saman maskingeværer
- Plasser hver rudiment, en om gangen, ved hjelp av en pre-våt 200fil pipettespiss, på toppen av en med hakk (lite kutt) 13 mm, 0,1 mikrometer Nuclepore Track-Etch membranfilter (Whatman) flytende over 200 ul dyrkingsmedier ( 5 barnelærdom / filter) i en glass-bunn mikrobrønnplate plate. Kulturmedieneer: DMEM/F12 + Pen-strep inneholdende 50 ug / ml transferrin og 150 ug / ml askorbinsyre, som tidligere beskrevet 2,8. Transferrin er kjent for å stimulere overlevelse og forgrening morphogenesis av spyttkjertel og andre organ explants 9. Tilsetning av askorbinsyre har vist seg å stimulere SMG forgrening. 10 Det er kjent å fungere som en kofaktor i mange hydroksylering reaksjoner av metabolske veier (eksempel prolin hydroksylering under kollagen fiber dannelse 11) og også stimulerer fibronectin og laminin produksjon i andre organ eksplanter 12.
- Fjern så mye media på toppen av filteret som mulig etter at hvert epithelial rudiment. For mye medier på toppen av filter kan føre til at filteret å synke, mens mindre medier gjør plassering av rudimenter og mesenchyme mye lettere. Overskytende materiale kan fjernes enten med en pipettespiss eller ved hjelp pinsett for å gripe de medier mellom tuppene.
- Sted mesenchyme stykker avledet from 03:57 kjertler på toppen og / eller rundt hver epithelial rudiment. Fjern eventuelle ekstra medier som omgir kjertlene å unngå bevegelse av mesenchyme unna rudiments. Mesenchyme avledet fra flere kjertler er ikke gunstig, men mindre kan være skadelig for epithelial rudiment vekst.
- Inkuber rekombinerte maskingeværer i en fuktet inkubator (95% luft / 5% CO 2) ved 37 ° C i 48 -72 timer, som ønsket.
- Erverve lysfelt og / eller fluorescerende bilder av levende kjertler ved 0 hr (hvis ønskelig), 2 timer etter rekombinasjon og hver 24 hr deretter på en omvendt, stående, eller stereo lysmikroskop utstyrt med et digitalt kamera med en 4x eller 5x forstørrelse mål å fange hele rekombinert kjertel i en enkelt ramme av visningen. Bilder av spyttkjertel viser den beste kontrasten ved hjelp av enten lysfelt innstillingen eller den aktuelle fasen ring plassert delvis inn i lyset banen (som ikke er mulig på helautomatiske mikroskoper). Standard fasekontrast er ingent nødvendig siden kjertelen er tykk og skaper kontrast.
- På ønskede tidspunkter, kan rekombinerte maskingeværer festes i 20 minutter med fiksativ løsning laget av 2% paraformaldehyd (PFA) på 1X PBS inneholdende 5% (w / v) sukrose (for å bedre bevare intern cellulær struktur ved å holde cellene i en isosmotic tilstand). Motsetning til 4% PFA, 2% PFA bevare en vesentlig mengde av GFP signalet om fiksativ er fullstendig fjernet etter fiksering. Kjertler kan lagres i opptil 1 uke i 1X PBS i mørket ved 4 ° C inntil hele mount immunocytokjemi og confocal avbildning utføres, som rapportert tidligere 3,6,13-15. Ideelt sett bør immunocytokjemi og bildebehandling utføres kort tid etter fiksering for å oppnå best kvalitet. Kjertlene kan også lyseres i RIPA buffer for SDS-PAGE etterfulgt av Western blotting-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flyten av de store eksperimentelle trinnene er skissert i Figur 1. Et eksempel på en intakt SMG, en isolert epitelial rudiment, og dens tilhørende mesenchyme er vist i figur 2. Lysfelt bilder av rekombinerte maskingeværer, som fortsetter å gjennomgå forgrening morphogenesis når kultivert ex vivo for de angitte tider, er vist i figur 3. Rekombinerte kjertler dyrket i 48 timer uttrykker epitelial GFP er vist i figur 4. Confocal bilder av rekombinerte maskingeværer løst og avbildes etter 72 timer i kultur fulgt av immunocytokjemi, er vist i figur 5. Epiteliale markør, E-cadherin, avgrenser den GFP-uttrykke epitelcelleopprinnelse befolkningen fra omkringliggende mesenchyme. Påvisning av kjelleren membranprotein, perlecan, lokalisert på periferien av epitelet demonstrerer minst delvis rekonstituering av basalmembran i rekombinerte kjertler. Figur 6. Parasympatiske submandibular ganglia gjennomgå neurite utvekst og innerverer kjertler i rekombinasjon kulturer som demonstrert tidligere. 19
Figur 1. (A) Flytskjema og (B) Skjematisk skildrer de store eksperimentelle trinnene.
Figur 2. Lysfelt bilder av (A) en hel embryonale dag 13 (E13) spyttkjertel viser sublingual kjertel epitelet (SL Epi) og submandibular kjertel epitelet (SMG Epi) omgitt av mesenchyme (MES). (B) isolert epiteliale rudiment, og (C) Separert mesenchyme. Skala barer = 100 mikrometer.
i-page = "always"> 
Figur 3. Lysfelt bilder av epiteliale barnelærdom (skissert av hvite stiplede linjer) omgitt av mesenchyme stykker dyrket i ex vivo kultur for de angitte tidsrom. Epitelceller gjennomgå forgrening morphogenesis og mesenchymale kondens er tydelig så tidlig som 24 timer i kultur. Skala barer = 100 mikrometer
Figur 4. Lysfelt (A), fluorescerende (B) og overlappende (C) bilder av rekombinerte maskingeværer hvor kun de epitelceller (skissert i hvite stiplede linjer) ble infisert med GFP-uttrykkende adenovirus og kultivert ex vivo i 48 timer. Skala barer = 100 mikrometer.
highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50060/50060fig5.jpg "/>
Figur 5. Confocal bilder eller lysfeltobjektiver bilder (BF) av rekombinerte maskingeværer merket med (A) kjerner (DAPI, blå), adenoviral GFP (grønn), epithelial markør. E-cadherin (rød), skala barer = 250 mikrometer, eller (b) kjerner (DAPI, blå), adenoviral GFP (grønn), epithelial markør, E-cadherin (rød), og basalmembran markør, Perlecan ( cyan), skala barer = 50 mikrometer. Stiplede hvite linjer disposisjon epitel. Klikk her for å se større figur .
Figur 6. Parasympatisk submandibular ganglia gjennomgå neurite utvekst og innerverer kjertler i rekombinasjon kulturer, skala barer = 250 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den tidligere vivo epitelial-mesenchymale rekombinasjon teknikken ble først publisert for submandibular spyttkjertler i 1981 16. I denne protokollen, utvider vi på den opprinnelige metoden med adenoviral infeksjon å manipulere epitelcelleopprinnelse genuttrykk innenfor rammen av en rekombinert kjertel. Vi viser at en prosentandel av epitelcellene er infisert med adenovirus, mens prosentandelen av celler som er infisert avhenger egenskapene til viral promotor, viral titer, og viral renhet. Vi har funnet at det er nødvendig å bruke CSCL gradient-rensede virus for effektiv epitelial transduksjon, rensing av som ikke er beskrevet her. Siden vi har også vært i stand til å infisere cellene mesenchyme før rekombinasjon (data ikke vist), er uavhengig genetisk manipulering av mesenchymale befolkningen også mulig. Vi har nylig brukt denne adenoviral transfeksjon / vev rekombinasjon metode for å identifisere en rollefor polariteten protein, PAR-1b, i kontroll av plassering av basalmembran ved epitelet i utviklingen spyttkjertlene. Kinase-død PAR-1b adenovirus og vill-type PAR-1b adenovirus ble begge brukt i denne studien 13 å infisere epiteliale barnelærdom og saman med E13 mesenchymes. Muligheten til å bruke mutante virus å avhøre funksjoner til spesifikke molekyler forbedrer nytten av denne metoden.
Det er for tiden mangel på effektive verktøy for å målrette bestemte molekyler i epitelcelleopprinnelse befolkningen i intakte embryonale spyttkjertler uten at det påvirker mesenchymale kupé. Selv om flere studier har brukt farmakologiske hemmere å manipulere signaltransduksjon i intakte orgel kulturer, disse hemmere påvirker både epitel og mesenchyme. For direkte vurdere effekter av inhibitorer på epitel, må epiteliale rudimenter dyrkes i fravær av mesenchyme i enten Matrigel or laminin-111 gels 6,7. Små inhiberende rnas (sirnas) er en effektiv metode til å ned-regulere epitelial genuttrykk siden sirnas er preferensielt tatt opp av epitelceller i nærvær av de fleste lipid bærere 13,14,17,18. Men ingen av disse metodene for å forstyrre protein nivåer eller funksjon tillater overuttrykte en vill-type eller muterte genet. Forsøk på tradisjonelle (ikke-viral) transfeksjon av embryonale hele SMG kulturer har møtt med begrenset suksess i at bare et lite antall av epitelceller kan målrettes (ML, upubliserte data). I sammenligning, representerer adenovirale transduksjon en effektiv metode for spesifikt transfecting salivary epitelceller.
Parasympatiske nerver har nylig vist seg å være kritisk for normal spyttkjertel forgrening ved å opprettholde et keratin 5-positiv progenitor cellepopulasjon 19. En fordel med denne vev rekombinasjon metode over mesenchyme-fri epitelial rudiment kultur metoden er at den parasympatiske ganglion kan opprettholdes i rekombinasjon kultursystem. Ved å holde nøye spor av omtrentlig plassering av det parasympatiske ganglion, som ligger i mesenchyme tilstøtende til det primære epiteliale kanalen 19, er det mulig å sikre at hver rudiment ender opp med å bli forbundet med en ganglion. Vi finner imidlertid at ved å kombinere 3-4 kjertler verdt av mesenchymes med hver epiteliale rudiment, er hver forbundet med en rudiment ganglion tilstrekkelig til innerverer knoppene til en viss grad (figur 6), selv om det ikke alltid til det samme som i den intakte umodifisert kjertler.
Det finnes alternative metoder for å infisere epitelet i sammenheng for det intakte kjertel. Vi har tidligere rapportert at mikroinjeksjon kan brukes for å introdusere inn i adenovirus epitelceller hos intakte kjertler 20,21. Imidlertid er mikroinjeksjon vanskelig å kontrol, kan fysisk skade kjertler, og vanligvis fører til infeksjon av bare en lokalisert undergruppe av celler 20. Adeno-assosiert virus (AAV) har vist seg å være nyttig for transfeksjon av distinkte cellepopulasjoner innenfor rammen av intakte SMG orgel eksplanter 22. Den serotype scAAV2 ble vist å være vesentlig mer effektiv ved spesifikk transduksjon av epitel intakte maskingeværer fremfor andre rekombinante AAV vektorer 23. Siden AAVs er ikke allment kommersielt tilgjengelig, og heller ikke gjør den ekspertise for å forberede AAV eksisterer i de fleste laboratorier, forutsatt adenovirale transduksjon og vev rekombinasjon protokollen her er mer alminnelig tilgjengelig for de fleste laboratorier enn er bruken av AAV vektorer.
Mens dette vevet rekombinasjon metoden rekapitulerer epitelial-mesenchymale interaksjoner til en viss grad, er det også mulig å infisere epitel med adenovirus og deretter vokse epitel utenfor sin opprinnelige kontekst.Som tidligere nevnt, infiserte vi intakte salivary epiteliale rudimenter med adenovirus og deretter vokste de kulturer Matrigel med eksogent lagt vekstfaktorer 17,20,21. Spyttkjertelsvulster organ explants kan også dyrkes på nanofiber stillaser, selv om disse stillasene ikke rekapitulere hele funksjon mesenchyme i sin nåværende form 15. Mens ingen av disse metoder rekapitulerer innfødt mesenchyme, slike metoder tillater etterligning av bestemte egenskaper av mesenchyme i ex vivo kultur.
Hver ex vivo kultur metode har sine egne fordeler og ulemper, men gjelder for opp spesifikke vitenskapelige spørsmål. Mens rekombinerte glands ikke gjennomgå så mye forgrening morphogenesis som gjør intakt spyttkjertelsvulster orgel explants, orgel explants, generelt, bare rekapitulere in vivo forgrening morphogenesis for et par dager. En løsning på dette problemet er selvfølgelig å crespiste transgene dyr som inneholder målrettede genuttrykk i epiteliale kupé. Siden det er en mangel på kjente arrangører som aktiveres spesielt i tidlig utvikling SMG epitel, og transgene teknologi er betydelig dyrere enn de beskrevne metoder, vevet rekombinasjon eksperimenter beskrevet her utgjør en levedyktig modell for å studere både epithelial og mesenchymale celle signalisering i tidlig utvikling spyttkjertelsvulster celler i løpet av sin vev sammenheng.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke dr. Deirdre Nelson for nyttige kommentarer og for kritisk lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av NIH tilskudd DE019244, DE019197, og DE021841 til ML, F32DE02098001 til SJS, og C06 RR015464 til Universitetet i Albany, SUNY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham's F12 Medium without phenol red | Life Technologies | 21041-025 | |
| Penicillin and Streptomycin | Life Technologies | 15070-163 | 10X stock |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | Freeze single use aliquots at -20C |
| BSA | Sigma | A2934-100G | Fraction V, low endotoxin |
| Adeno-X-GFP | BD Biosciences | 8138-1 | Should be high titer (1x1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay. |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v) |
| 1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | Prepared from 10X stock |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14175095 | no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red |
| Transferrin | Sigma | T8158 | 25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma | A4403 | 75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C |
| Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol. | |||
| 10 cm sterile plastic dishes | Corning | 430167 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo dissecting microscope with transmitted light base | Nikon | SMZ645 | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| 35 mm tissue culture dishes | Falcon | 353001 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm diameter microwell dishes | MatTek Corporation | P50-G-1.5-14F | |
| Nuclepore Track-Etch membrane filters | Whatman | 110405 | 13 mm diameter, 0.1 mm pore size |
| Widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss, USA | Axio Observer Z1 | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm | Fine Science Tools | 11252-20 | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm | Fine Science Tools | 11295-20 | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol. | |||
References
- Tucker, A. S. Salivary gland development. Seminars in cell & developmental biology. 18, 237-244 (2007).
- Sakai, T., Onodera, T. Embryonic organ culture. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19 (2008).
- Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. Salivary gland branching morphogenesis. Differentiation. 74, 349-364 (2006).
- Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).
- Zheng, C., et al. Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland. J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).
- Larsen, M., et al. Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis. Developmental biology. 255, 178-191 (2003).
- Hoffman, M. P., et al. Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms. Development. 129, 5767-5778 (2002).
- Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development. Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).
- Partanen, A. M., Thesleff, I. Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture. Differentiation. 34, 25-31 (1987).
- Naka, T., et al. Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate. In Vivo. 19, 883-888 (2005).
- Bornstein, P., Traub, W. The chemistry and biology of collagen. The Proteins. Neurath, H., Hill, R. L. 4, 3rd, Academic Press. 412-632 (1979).
- Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture. Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).
- Daley, W. P., et al. ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity. Development. 139, 411-422 (2012).
- Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis. Developmental biology. 336, 169-182 (2009).
- Sequeira, S. J., et al. The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds. Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).
- Nogawa, H., Mizuno, T. Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development. Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423, 876-881 (2003).
- Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science. 329, 1645-1647 (2010).
- Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis. J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).
- Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells. Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).
- Zheng, C., Baum, B. J. Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands. Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).
- Hsu, J. C., et al. Viral gene transfer to developing mouse salivary glands. J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).
