Summary
Una técnica para manipular genéticamente las células epiteliales dentro de toda
Abstract
La morfogénesis de ramificación se produce durante el desarrollo de muchos órganos, y la glándula submandibular del ratón embrionario (SMG) es un modelo clásico para el estudio de la morfogénesis de ramificación. En la SMG desarrollo, este proceso implica pasos iterativos de brote epitelial y la formación del conducto, en última instancia, para dar lugar a una compleja red ramificada de acinos y conductos, que sirven para producir y modificar / transportar la saliva, respectivamente, en la cavidad oral de 1 - 3. La membrana basal epitelial asociada y los aspectos de la compartimiento mesenquimal, incluyendo las células del mesénquima, factores de crecimiento y la matriz extracelular, producidas por estas células, son críticos para el mecanismo de ramificación, aunque la forma de los acontecimientos celulares y moleculares están coordinados sigue siendo poco conocida 4 . El estudio de los mecanismos moleculares de conducción avances epiteliales morfogénesis nuestra comprensión de los mecanismos de desarrollo y da una idea de posible regeneraraproximaciones creativas medicina. Tales estudios se han visto obstaculizados por la falta de métodos eficaces para la manipulación genética del epitelio salival. Actualmente, la transducción adenoviral representa el método más eficaz para atacar a las células epiteliales de las glándulas adultos in vivo 5. Sin embargo, en los explantes de embriones, mesénquima y densa de la membrana basal que rodea las células epiteliales impide el acceso viral a las células epiteliales. Si el mesénquima se retira, el epitelio puede ser transfectadas utilizando adenovirus, y rudimentos epiteliales puede reanudar la morfogénesis de ramificación en presencia de Matrigel o laminina-111 6,7. Mesénquima crecimiento libre de rudimento epitelial también requiere suplementos adicionales con factores de crecimiento solubles y no completamente recapitular la morfogénesis de ramificación ya que se produce en las glándulas intactas 8. Aquí se describe una técnica que facilita la transducción adenoviral de las células epiteliales y la cultura de la e transfectadaspithelium con mesénquima asociado. Después de la microdisección de los subfusiles embrionarias, la eliminación de la mesénquima, y la infección viral del epitelio con un adenovirus que contiene GFP, se muestra que el epitelio espontáneamente recombina con mesénquima no infectada, recapitulando intacta la estructura glandular SMG y la morfogénesis de ramificación. La población de células epiteliales modificadas genéticamente pueden controlarse fácilmente utilizando métodos estándar de microscopía de fluorescencia, si fluorescentemente etiquetados construcciones adenovirales se utilizan. El método de recombinación de tejidos descrito aquí es actualmente el método más eficaz y accesible para la transfección de células epiteliales con un vector de tipo salvaje o mutante dentro de una construcción de tejido complejo 3D que no requiere la generación de animales transgénicos.
Protocol
El protocolo contiene cuatro etapas principales, como se representa en la figura 1. Todos los pasos se describen con todo detalle. Construcción de adenovirus y la purificación viral se debe realizar antes de la extracción de órganos para su uso en la transducción genética de diseccionados rudimentos epiteliales. Todos los estándares BSL-2 medidas de seguridad se deben seguir cuando se trabaja con adenovirus.
1. Embrionarias de ratón glándula submandibular (SMG) Recolección y microdisección
- Eutanasiar cronometrado embarazadas ratones hembra (cepa consanguínea CD-1 o ICR) utilizando CO 2 narcosis, seguido por dislocación cervical y cadenas de cosecha de embriones de ratón en el día embrionario 13 (E13, 3-5 papilas epiteliales) siguientes procedimientos aprobados por el IACUC institucional comité. El día del descubrimiento de tapón vaginal se designa como E0. Las glándulas salivales también pueden ser cosechados y cultivados en la etapa E12 cuando hay un solo brote primario y tallo con hendiduras empezandoa iniciar. Subfusiles antes de esta etapa requieren diferentes condiciones de cultivo de las indicadas aquí.
- Transferir cadenas de embriones en estériles de 10 placas de cultivo cm de tejido llena de 25 ml de DMEM / Ham 's F12 (F12) que carecen de rojo fenol (Life Technologies) suplementado con 100 U / ml de penicilina, y 100 ug / ml de estreptomicina (pen-strep, Life Technologies).
- Con un bisturí estéril (# 11 cuchillas) y pinzas (# 5, Herramientas de Bellas ciencia, 11252-20), la toma de embriones a partir de los sacos en un plato separado 10 cm que contiene 25 ml de DMEM/F12 + pen-strep.
- Cortar las cabezas de embriones con un corte en ángulo justo debajo de la mandíbula inferior.
- Aislar las mandíbulas inferiores de las cabezas bajo un microscopio de disección estéreo con una base de luz transmitida (Nikon SMZ645 o equivalente) con un corte por debajo de la mandíbula superior. Colocar los tejidos en la parte superior de una pieza extra de vidrio en lugar de directamente sobre el componente de vidrio de la base del microscopio.
- Recoge las mandíbulas inferiores a 3 ml de DMEM/F12 + pen-strep en una estéril 35 mm plato de cultivo de tejidos.
- Colocar una rodaja mandíbula sobre la platina del microscopio de disección para que la lengua está en la parte inferior de la rebanada pero está apuntando hacia la posición de las 12:00.
- Usando un lado de dos pinzas cruzadas en una especie de tijera, retire y deseche la rd 1/3 inferior de la porción mandibular.
- Girar la rebanada 90 ° a la derecha (si es diestro) y, usando un corte de tijera con los fórceps, cortar la parte superior de la rebanada mandíbula (sin cortar la lengua) hasta la mitad en la rebanada.
- Pelar el exceso de tejido y retirar a exponer las metralletas debajo. Habrá una en cada lado cerca de la base de la lengua.
- Con un par de pinzas para sujetar el tejido de la lengua, utilizar las pinzas para molestar a los demás SMG lejos de la lengua. Repita el procedimiento para la otra glándula.
- Recoger las glándulas salivales microdissected en 3 ml de DMEM/F12 + pen-strep en un nuevo tejido estéril mm 35cultura plato. Nota: las glándulas submandibulares más grandes (3-5 yemas epiteliales), junto con la glándula más pequeña conectada sublingual (1 yema) se pueden cultivar intacto por saltarse el paso 4 y de realizar los pasos 4,1, 4,3 y 4,4, como se ha descrito previamente 2,8.
2. SMG Separación rudimento epitelial
- Place 5 (o más) las glándulas salivales en un fondo de vidrio, 50 mm diámetro del plato de micropocillos (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) que contiene 200 l de solución salina equilibrada de Hank (HBSS carece Ca + + o Mg + +, Life Technologies) que contenía 0,4% (v / v) dispasa (Life Technologies, cat. no. 17,105-041) e incubar durante 15 min a 37 ° C.
- Después de la incubación, usando una punta de pipeta estéril 200 l, aspirar con cuidado a la solución de dispasa sin perturbar las glándulas. Añadir inmediatamente 200 l de medio DMEM/F12 que contiene 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, pre-esterilizado con un filtro de 0,22 micras) para neutralizar la dispasa. <li> Bajo un microscopio de disección, usando un par de pinzas con puntas finas (# 5 Dumostar, herramientas finas Science, 11295-20), suavemente separar el mesénquima alrededor de aflojado de las papilas epiteliales SMG y conductos, teniendo cuidado de dejar el epitelio intacto .
- Humedezca previamente una punta de pipeta estéril 200 ml con DMEM/F12-BSA medios de comunicación y pipetear suavemente los rudimentos epiteliales en un nuevo 50 mm diámetro del plato de micropocillos que contiene 200 l de DMEM/F12 + pen-strep. Utilice una alta calidad de 200 l punta de la pipeta con un borde liso.
- En el plato que contiene las piezas mesénquima, desechar cualquier tejido no-mesenquimal incluyendo las glándulas sublinguales y las glándulas submandibulares yemas separadas.
3. La infección adenoviral de Rudimentos epiteliales
- Hacer 200 l de medios de infección viral mediante la dilución del adenovirus de interés en DMEM/F12 + pen-strep en un tubo de microcentrífuga de modo que el título de la solución resultante es 1x10 8 -10 9 PFU. Latítulo óptimo requerido para diferentes virus puede variar. Es importante utilizar cloruro de cesio (CsCl)-preparaciones purificadas virales para la eficacia de la absorción óptima.
- Retire el material de la cápsula que contiene las cinco rudimentos epiteliales. Añadir rápidamente 200 l de los medios de comunicación de infección, manteniendo los rudimentos húmedo en todo momento. Tome las precauciones necesarias al manipular el virus y la eliminación de puntas de pipeta contaminados. Desinfecte las superficies contaminadas con virus con la solución de lejía al 10%.
- Mover los rudimentos epiteliales lejos el uno del otro con pinzas para evitar que se peguen entre sí y permitir que se depositen en el fondo de la placa. Incubar rudimentos en medios virales durante 1 hora a temperatura ambiente. Durante la incubación, separar los rudimentos, si se mueven juntos. Balanceo excesivo o movimiento permitirá a las glándulas para agruparse.
- Después de la incubación, retire con cuidado los medios de comunicación viral que contienen y deseche adecuadamente, teniendo cuidado de no alterar la rudiments. Añadir 200 l de DMEM/F12 + pen-strep. Repita este lavado por lo menos dos veces más y reemplazar con 200 l de DMEM/F12 + pen-strep medios de comunicación. Estos lavados son fundamentales para eliminar cualquier virus que no está fuertemente unida al epitelio y para prevenir la infección del mesénquima.
- Incubar rudimentos epiteliales con 200 ml de DMEM/F12 que contiene 2% (v / v) de Matrigel (BD Biosciences, 356.231) durante 20 min. Encontramos que este corto de incubación en Matrigel minimiza la regresión de las hendiduras existentes durante el período inicial de cultivo, pero este paso puede obviarse si la exposición a Matrigel no se desea.
4. Ex Culture in vivo de subfusiles recombinados
- Colocar cada rudimento, uno a la vez, usando una pre-mojado punta de pipeta 200 l, en la parte superior de una muesca (pequeño corte) 13 mm, 0,1 micras Nuclepore Track-Etch membrana de filtro (Whatman) flotando sobre 200 l de medio de cultivo ( 5 rudimentos / filtro) en una placa de vidrio con fondo de pocillos de microtitulación. Los medios de cultivoes: DMEM/F12 + pen-strep que contenía 50 mg / ml de transferrina y 150 ug / ml de ácido ascórbico, como se ha descrito previamente 2,8. La transferrina se sabe que estimula la supervivencia y morfogénesis de ramificación de explantes de glándula salival y otros órganos 9. La adición de ácido ascórbico se ha demostrado que estimula la ramificación SMG. 10 Se sabe que actúa como un cofactor en muchas reacciones de hidroxilación de vías metabólicas (tales como hidroxilación de prolina durante la formación de fibras de colágeno 11) y también estimula la producción de fibronectina y la laminina en explantes de otros órganos 12.
- Eliminar como muchos medios en la parte superior del filtro como sea posible después de añadir cada rudimento epitelial. Medios demasiado en la parte superior del filtro puede hacer que el filtro a hundirse, mientras que menos medios de comunicación hace que la colocación de los rudimentos y mesénquima mucho más fácil. El exceso de medios de comunicación se puede eliminar con una punta de pipeta o utilizando pinzas para sujetar el papel entre las puntas.
- Coloque las piezas de mesénquima derivado from tres y cincuenta y siete glándulas en la parte superior y / o alrededor de cada rudimento epitelial. Quite todos los medios adicionales que se rodean las glándulas para evitar el movimiento del mesénquima lejos de los rudimentos. Mesénquima derivado de más glándulas no es beneficiosa, pero puede ser menos perjudicial para el crecimiento rudimento epitelial.
- Incubar metralletas recombinados en un incubador humidificado (95% aire / 5% CO 2) a 37 ° C durante 48 -72 horas, según se desee.
- Adquirir claro y / o imágenes fluorescentes de glándulas en vivo a 0 horas (si se desea), 2 h después de la recombinación y cada 24 horas a partir de entonces en un microscopio de luz invertida, en posición vertical, o estéreo equipado con una cámara digital con un objetivo de aumento 4X o 5X para capturar la glándula recombinada todo en un solo marco de vista. Las imágenes de la glándula salival mostrar el mejor contraste utilizando el ajuste campo claro o el anillo de fase apropiado colocado a medio camino en la trayectoria de la luz (lo cual no es posible en totalmente automatizados microscopios). Contraste de fase estándar es not necesario ya que la glándula esté espesa y crea contraste.
- En los puntos de tiempo deseados, subfusiles recombinados se puede fijar durante 20 minutos con la solución de fijación hechos de 2% de paraformaldehído (PFA) en 1X PBS que contenía 5% (w / v) de sacarosa (para mantener la mejor estructura celular interna, manteniendo las células en un estado isotónico). A diferencia de PFA al 4%, 2% PFA conservará una cantidad significativa de la señal de GFP si el fijador se elimina por completo después de la fijación. Las glándulas se pueden almacenar durante hasta 1 semana en 1X PBS en la oscuridad a 4 ° C hasta que toda la inmunocitoquímica y montaje de imagen confocal se lleva a cabo, como se informó anteriormente 3,6,13-15. Idealmente, inmunocitoquímica y de imagen se debe realizar poco después de la fijación de obtener imágenes con la mejor calidad. Glándulas también pueden ser lisadas en tampón RIPA por SDS-PAGE seguida por análisis de Western Blot.
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Representative Results
El flujo de las etapas experimentales principales se describen en la Figura 1. Un ejemplo de un SMG intacto, un rudimento epitelial aislado, y su mesénquima correspondiente se muestra en la Figura 2. Imágenes de campo claro subfusiles recombinados, que siguen a someterse a la morfogénesis de ramificación cuando cultivadas ex vivo durante los tiempos indicados, se muestran en la Figura 3. Glándulas recombinados cultivadas durante 48 horas epitelial que expresan GFP se muestra en la Figura 4. Imágenes confocales de subfusiles recombinados fija y la imagen después de 72 h en cultivo seguido de inmunocitoquímica, se muestran en la Figura 5. El marcador epitelial, E-cadherina, demarca la población que expresa GFP células epiteliales desde el mesénquima circundante. Detección de la proteína de membrana basal, perlecan, localizada en la periferia del epitelio demuestra al menos reconstitución parcial de la membrana basal en las glándulas recombinados. Figura 6. Ganglio submandibular parasimpático someterse crecimiento de neuritas e inervan las glándulas en las culturas de recombinación como se ha demostrado anteriormente 19.
Figura 1. (A) Diagrama de flujo y (B) Esquema que representa las etapas experimentales principales.
Figura 2. Imágenes de campo claro (A) un día entero embrionario 13 (E13) glándula salival que muestra el epitelio de la glándula sublingual (SL Epi) y el epitelio de la glándula submandibular (SMG Epi) rodeado por mesénquima (MES). (B) rudimento epitelial aislada, y (C) Separado mesénquima. Las barras de escala = 100 micras.
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Figura 3. Imágenes de campo claro rudimentos epiteliales (esbozado por líneas de puntos blancos) rodeado por piezas mesenquimales cultivadas en cultivo ex vivo durante los tiempos indicados. Las células epiteliales se someten a la morfogénesis de ramificación y la condensación mesenquimal es evidente tan pronto como 24 horas en cultivo. Las barras de escala = 100 m
Figura 4. Campo claro (A), fluorescente (B) y superpuestos (C) imágenes de subfusiles recombinados en el que sólo las células epiteliales (descritos en las líneas blancas discontinuas) fueron infectadas con adenovirus que expresa GFP y ex vivo se cultivaron durante 48 hr. Las barras de escala = 100 micras.
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Figura 5. Confocal de imágenes o imágenes campo claro (BF) de subfusiles recombinados marcados con (A) los núcleos (DAPI, azul), adenoviral GFP (verde), el marcador epitelial. E-cadherina (rojo), barras de escala = 250 m, o, (b) los núcleos (DAPI, azul), adenoviral GFP (verde), el marcador epitelial, E-cadherina (rojo), y el marcador de la membrana basal, perlecan ( cian), barras de escala = 50 micras. Puntos epitelio blanco bosquejo líneas. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 6. Submandibular ganglios parasimpáticos someterse crecimiento de neuritas e inervan las glándulas en las culturas de recombinación, barras de escala = 250 micras.
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Discussion
El ex vivo epitelial-mesenquimal técnica de recombinación fue publicado por primera vez por las glándulas salivales submandibulares en 1981 16. En este protocolo, se expanda en el método original, usando infección adenoviral para manipular la expresión génica de células epiteliales en el contexto de una glándula recombinado. Se demuestra que un porcentaje de las células epiteliales están infectadas con el adenovirus, mientras que el porcentaje de células que están infectadas depende de las propiedades del promotor viral, título viral, y la pureza viral. Hemos encontrado que es necesario utilizar gradiente de CsCl virus purificados para la transducción eficiente epitelial, la purificación de los cuales no se describe aquí. Dado que también hemos sido capaces de infectar las células del mesénquima antes de recombinación (datos no mostrados), la manipulación independiente genética de la población mesenquimal también es posible. Recientemente, hemos utilizado esta adenoviral transfección / tejido método de recombinación para identificar un papelpara la proteína de polaridad, PAR-1B, en el control de la colocación de la membrana basal por el epitelio en el desarrollo de las glándulas salivales. Muertos-quinasa PAR-1b adenovirus y adenovirus de tipo salvaje PAR-1b se utiliza tanto en este estudio 13 para infectar rudimentos epiteliales y se recombina con E13 mesenchymes. La capacidad de utilizar los virus mutantes para interrogar a las funciones de las moléculas específicas aumenta la utilidad de este método.
Actualmente, existe una falta de medios eficaces para dirigir moléculas específicas dentro de la población de células epiteliales intactas en las glándulas salivares embrionarias sin afectar el compartimiento mesenquimal. Aunque muchos estudios han utilizado inhibidores farmacológicos para manipular la señal de transducción en cultivos de órganos intactos, estos inhibidores afectan tanto en el epitelio y el mesénquima. Para evaluar directamente los efectos de los inhibidores sobre el epitelio, rudimentos epiteliales deben ser cultivados en ausencia de mesénquima en Matrigel o ya sear laminina-111 geles de 6,7. ARN inhibidores pequeños (siRNAs) son un método eficaz para regular a la baja la expresión génica epitelial desde siRNAs son preferentemente captado por las células epiteliales en presencia de la mayoría de los vehículos lipídicos 13,14,17,18. Sin embargo, ninguno de estos métodos para interferir con los niveles de proteína o la función de permitir que la sobreexpresión de un gen de tipo salvaje o mutante. Los intentos de transfección tradicional (no viral) de cultivos de embriones SMG enteras han tenido un éxito limitado en el que sólo un pequeño número de células epiteliales pueden ser dirigidos (ML, datos no publicados). En comparación, la transducción adenoviral representa un método eficaz para la transfección de salivales específicamente las células epiteliales.
Los nervios parasimpáticos Recientemente se han demostrado ser crítica para la normal de la glándula salival de ramificación mediante el mantenimiento de una queratina 5-positivo población de células progenitoras 19. Una ventaja de este método de recombinación de tejido sobre el mesenchyme método libre epitelial cultura rudimento es que el ganglio parasimpático se puede mantener en el sistema de cultivo de recombinación. Al mantener un registro cuidadoso de la ubicación aproximada del ganglio parasimpático, que se encuentra en el mesénquima adyacente al conducto principal 19 epitelial, es posible asegurar que cada rudimento termina siendo asociado a un ganglio. Sin embargo, encontramos que mediante la combinación de las glándulas 3-4 valor de mesenchymes con cada rudimento epitelial, cada rudimento se asocia con un ganglio suficiente para inervar los brotes hasta cierto punto (Figura 6), aunque no siempre en el mismo como en el no modificado intacto glándulas.
Existen métodos alternativos para infectar el epitelio en el contexto de la glándula intacto. Hemos informado anteriormente de que la microinyección se puede utilizar para introducir adenovirus en células epiteliales de las glándulas intactas 20,21. Sin embargo, la microinyección es difícil de control, físicamente puede dañar las glándulas, y típicamente conduce a la infección de sólo un subconjunto limitado de células 20. Virus adeno-asociados (AAV) han demostrado ser útiles para la transfección de poblaciones celulares distintas en el contexto de explantes de órganos intactos SMG 22. El scAAV2 serotipo mostró ser sustancialmente más eficiente en la transducción específica del epitelio de subfusiles intactas más de otros vectores de AAV recombinantes 23. Desde AAVs no están ampliamente disponibles en el mercado, ni la experiencia para preparar AAV existen en la mayoría de los laboratorios, la transducción adenoviral y protocolo de recombinación tejido proporcionada aquí es más generalmente accesible a la mayoría de los laboratorios que es el uso de vectores de AAV.
Si bien este método recapitula recombinación de tejidos epiteliales-mesenquimales interacciones, en cierta medida, también es posible infectar el epitelio con adenovirus y luego crecer el epitelio fuera de su contexto nativo.Como se mencionó anteriormente, estamos infectados intactos rudimentos del epitelio salival con adenovirus y luego crecieron los cultivos en Matrigel con factores de crecimiento exógena añadido 17,20,21. Explantes de glándula salival de órganos también pueden ser cultivadas en andamios nanofibras, aunque estos andamios no recapitular la función completa del mesénquima en su forma actual, 15. Aunque ninguno de estos métodos recapitula el mesénquima nativo, estos métodos permiten la imitación de las propiedades específicas del mesénquima en cultivo ex vivo.
Cada método de cultivo ex vivo tiene sus propias ventajas y desventajas, pero es aplicable para abordar determinadas cuestiones científicas. Mientras que las glándulas recombinados no sufren tanto la morfogénesis de ramificación como hacer intactas explantes órgano de la glándula salival, explantes de órganos, en general, sólo recapitular in vivo la morfogénesis de ramificación durante unos días. Una solución a este problema es, por supuesto, a CREcomía animales transgénicos que contienen la expresión de genes diana dentro del compartimiento epitelial. Puesto que hay una falta de promotores conocidos que se activan específicamente en el desarrollo temprano epitelio SMG, y la tecnología transgénica sigue siendo significativamente más costoso que los métodos descritos, los experimentos de recombinación de tejidos descritos aquí constituyen un sistema modelo viable para estudiar tanto las células epiteliales y mesenquimales de señalización en temprano desarrollo de las células de la glándula salival dentro de su contexto tejido.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a la Dra. Deirdre Nelson por sus valiosos comentarios y para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado por el NIH subvenciones DE019244, DE019197 y DE021841 a ML, F32DE02098001 a SJS, y RR015464 C06 a la Universidad de Albany, SUNY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham's F12 Medium without phenol red | Life Technologies | 21041-025 | |
| Penicillin and Streptomycin | Life Technologies | 15070-163 | 10X stock |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | Freeze single use aliquots at -20C |
| BSA | Sigma | A2934-100G | Fraction V, low endotoxin |
| Adeno-X-GFP | BD Biosciences | 8138-1 | Should be high titer (1x1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay. |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v) |
| 1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | Prepared from 10X stock |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14175095 | no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red |
| Transferrin | Sigma | T8158 | 25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma | A4403 | 75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C |
| Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol. | |||
| 10 cm sterile plastic dishes | Corning | 430167 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo dissecting microscope with transmitted light base | Nikon | SMZ645 | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| 35 mm tissue culture dishes | Falcon | 353001 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm diameter microwell dishes | MatTek Corporation | P50-G-1.5-14F | |
| Nuclepore Track-Etch membrane filters | Whatman | 110405 | 13 mm diameter, 0.1 mm pore size |
| Widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss, USA | Axio Observer Z1 | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm | Fine Science Tools | 11252-20 | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm | Fine Science Tools | 11295-20 | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol. | |||
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