Summary
Genetik bütünü içinde epitel hücreleri manipüle etmek için bir tekniktir
Abstract
Morfolojilerinden Dallanma birçok organların gelişim sırasında meydana gelen, ve embriyonik fare submandibular bez (SMG) morfolojilerinden dallanma çalışma için klasik bir modeldir. - Sonuçta oral kavite 1 içine, sırasıyla, tükürük üretirler ve değiştirmek / taşıma hizmet asinüs ve kanalların karmaşık dallı ağı, yol vermek, epitelyal tomurcuk ve kanal oluşumu adımları iteratif geliştirme SMG, bu süreci içerir 3. Nasıl hücresel ve moleküler olaylar henüz tam olarak anlaşılamamıştır koordine olmasına rağmen epitel ilişkili bazal membran ve bu hücreler tarafından üretilen mezenşimi hücreler, büyüme faktörleri ve ekstraselüler matriks dahil mezenkimal bölmesi, yönlerini, dallanma mekanizması için kritik olan 4 . Moleküler mekanizmaların çalışmada epitelyal morfolojilerinden gelişmeler gelişim mekanizmalarına anlayışımızı sürüş ve olası Rejenere içgörü sağlarative tıp yaklaşımları. Bu tür çalışmalar tükrük epitelin genetik manipülasyonu için etkili yöntemlerin eksikliği nedeniyle sekteye edilmiştir. Şu anda, adenoviral transdüksiyon vivo 5 yetişkin bezlerinin epitel hücrelerini hedef için en etkili yöntem temsil eder. Ancak, embriyonik eksplantlar, yoğun mezenşimi ve epitel hücreleri çevreleyen bazal membran epitel hücreleri viral erişimi engellemektedir. Mezenşim çıkarılırsa, epitelyum adenovirüsler kullanılarak transfekte edilebilir ve epitel esaslar Matrigel ya da laminin-111 6,7 varlığında, morfojenezi dallanma devam edebilir. Mesenchyme serbest epitelyal yitiren organ büyüme de çözünür büyüme faktörleri ile ek takviyesi gerektirir ve bozulmamış bezleri 8 oluşuyor gibi tamamen dallanma morfolojilerinden özetlemek değil. Burada transfekte e epitel hücreleri ve kültür adenoviral iletimi kolaylaştıran bir yöntem tanımlamakilişkili mezenşimi ile pithelium. Embriyonik SMGs, mezenşimi çıkarılması ve bir GFP içeren adenovirüs ile epitel viral enfeksiyon mikrodisseksiyon ardından, epitel kendiliğinden sağlam SMG glandüler yapısı recapitulating ve morfonogenezi dallanma, bulaşmamış mezenşimi ile yeniden birleştirilmesi kastedilmektedir olduğunu göstermektedir. Genetiği değiştirilmiş epitel hücre popülasyonu kolayca floresan etiketli varsa adenoviral yapıları kullanılır, standart floresan mikroskobu yöntemleri kullanılarak izlenebilir. Burada açıklanan yöntem, şu anda doku rekombinasyon transgenik hayvanların üretimi gerektirmeyen bir kompleks 3B doku yapısı içinde, bir vahşi-tip ya da mutant vektör ile epitel hücrelerinin transfeksiyonu için en etkili ve ulaşılabilir bir yöntemdir.
Protocol
Protokol olarak Şekil 1 'de gösterilen dört ana adımı içerir. Tüm adımlar tam detaylı olarak açıklanmıştır. Adenovirüs yapı viral ve arıtma parçalanmış epitel esasların genetik iletiminde kullanım için organ toplama önce yapılmalıdır. Adenovirüsler ile çalışırken tüm standart BSL-2 güvenlik önlemlerine uyulmalıdır.
1. Fare Embriyonik Submandibular tükrük bezi (SMG) Hasat ve Mikrodisseksiyon
- Embriyonik gün 13 de fare embriyo servikal dislokasyon ve hasat dizeleri (E13, 3-5 epitel tomurcukları) kurumsal IACUC tarafından onaylanan aşağıdaki prosedürleri takip CO 2 narkoz kullanarak zamanlanmış gebe dişi farelerde (outbred zorlanma CD-1 veya ICR), Euthanize komitesi. Vajinal fişi keşif günü E0 olarak belirlenmiştir. Yarıkların sadece başlangıç ile tek bir primer tomurcuk ve sap olduğunda Tükürük bezleri de E12 aşamada hasat ve kültüre edilebilirbaşlatmak için. Önce bu aşamaya SMGs burada belirtilenlerden daha farklı bir kültür koşulları gerektirir.
- Fenol kırmızısı (Life Technologies) ve 100 U / ml penisilin ile desteklenmiş ve 100 mg / ml streptomisin (pen-strep eksik DMEM / Ham 's F12 Orta (F12) 25 ml ile dolu steril 10 cm doku kültür kaplarına embriyo dizeleri aktarın, Life Technologies).
- Steril bir neşter (# 11 bıçak) ve forseps (# 5, Güzel Bilim Araçları 11252-20) kullanarak DMEM/F12 + kalem-strep 25 ml içeren ayrı 10 cm çanak içine Keselerden embriyolar çıkarın.
- Sadece alt çene altında bir açılı kesim ile embriyo kafaları Sever.
- Üst çene altındaki bir kesim kullanarak iletilen ışık tabanı (Nikon SMZ645 veya eşdeğeri) ile bir stereo mikroskop altında başları alt çene kemiklerini ayırın. Cam bir ilave parça üzerinde yerine doğrudan doğruya mikroskop baz cam bileşeni dokular yerleştirin.
- DM, 3 ml içine alt altçeneleri toplayınEM/F12 + steril bir 35 mm doku kültürü çanak kalem strep.
- Dil dilimin altında ama 0:00 pozisyonunda doğru bakacak şekilde diseksiyon mikroskop sahnede bir mandibula dilim yerleştirin.
- Bir makaslama hareketi iki çarpı forseps bir tarafı kullanarak, kaldırmak ve mandibula dilim 1/3 alt rd atın.
- Forseps ile makaslama kesme kullanarak dilim 90 sağa ° (sağ elini ise) ve çevirin, yarım dilim içine mandibula dilimin üst kısmı (dil kesmeden) kesti.
- Peel aşırı uzak doku ve altında SMGs açığa çıkarın. Dil tabanının yakınında, her iki yandaki olacaktır.
- Diliyle dokusu aşağı tutmak için forseps bir çift kullanarak, dilinden SMG uzak kızdırmak için diğer forseps kullanabilir. Diğer bezi için tekrarlayın.
- Yeni bir steril 35 mm doku içine DMEM/F12 + kalem-strep 3 ml içine microdissected tükürük bezleri toplayınkültür çanak. Not: Bağlı küçük dilaltı bezi (1 tomurcuk) ile birlikte büyük submandibular bezler (3-5 epitel tomurcukları) 4. adıma atlama ve adımları 4.1, 4.3 performans ve 4.4 bozulmamış kültüre edilebilir, daha önce 2,8 nitelendirdi.
2. Epitel yitiren organ Ayırma SMG
- Sıra 5 (veya daha fazla) Hank'in dengeli tuz çözeltisi 200 ul (HBSS Ca eksik içeren bir cam tabanlı, 50 mm çaplı mikro çanağı (Mattek Corporation, P50G-1.5-14-F) içine tükürük bezleri + + ve Mg + +, Life Technologies) ihtiva eden% 0.4 (v / v) dispase (Life Technologies, Cat. no. 17105-041) ve 37 'de 15 dakika inkübe ° C.
- Inkübasyondan sonra, steril bir 200 ul pipet kullanarak, dikkatli bezleri bozmadan dispase çözüm aspire. Hemen BSA (DMEM/F12-BSA, bir 0.22 um filtre ile önceden sterilize) dispase nötralize etmek için% 5 (w / v) içeren DMEM/F12 ortamı 200 ul ilave edin. <li> bir diseksiyon mikroskobu altında, ince ipuçları (# 5 Dumostar, Güzel Bilim Araçları 11295-20) ile forseps bir çift kullanarak, yavaşça epitel dokunmadığınızdan özen SMG epitel tomurcukları ve kanalların etrafında gevşetti mezenşimi ayırmak .
- Pre-ıslak steril bir 200 ul pipet DMEM/F12-BSA medya ile ucu hafifçe DMEM/F12 200 ul + kalem-strep içeren yeni bir 50 mm çaplı mikro yemeğin içine epitel esasları üzerinden Pipeti. Pürüzsüz bir kenar ile yüksek kalitede 200 ul pipet kullanın.
- Mezenşimi parçaları içeren çanak olarak, sublingual bezler ve herhangi bir müstakil submandibular bez tomurcukları da dahil olmak üzere herhangi bir non-mezenkimal doku atın.
3. Epitel Esaslar adenoviral enfeksiyonu
- Elde edilen solüsyon bir titre 1x10 8 -10 9 PFUs böylece bir mikrosantrifüj tüpü içinde DMEM/F12 + kalem-Strep ilgi adenovirüs seyreltilmesi ile viral enfeksiyon medya 200 ul edin.başka virüsler için gereken optimum titresi değişebilir. Bu, sezyum klorür (CsCl)-saflaştırılmış optimum etkinlik alımı için viral preparatları kullanmak için önemlidir.
- Beş epitel esasları içeren çanak ortamı çıkarın. Hızla her zaman esasları ıslak tutulması, enfeksiyon medyanın 200 ul ekleyin. Virüs taşıma ve kontamine pipet ipuçları atılmasının gerekli önlemleri alın. % 10 çamaşır suyu çözeltisi ile herhangi bir virüs bulaşmış yüzeyler dezenfekte edin.
- Birbirine yapışmasını önlemek ve onları plakanın alt yerleşmek için izin vermek için forseps ile uzak birbirinden epitelyal esasları taşıyın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca ortam içinde viral esaslar inkübe edin. Onlar birbirine yakın taşırsanız inkübasyon sırasında, esasları ayırın. Aşırı sallanan veya hareket bezlerinin bir araya gelme sağlayacaktır.
- Inkübasyondan sonra, yavaşça viral içeren ortamı çıkarın ve uygun atın, r bozmaya özenudiments. DMEM/F12 + kalem strep 200 ul ekleyin. Bu yıkama en az iki kez daha tekrarlayın ve DMEM/F12 + kalem strep medyanın 200 ul ile değiştirin. Bunlar yıkar güçlü epitel bağlı olmayan herhangi bir virüs kaldırmak için ve mezenşimi enfeksiyonu önlemek için kritik öneme sahiptir.
- DMEM/F12, 200 ml% 2 içeren epitelyal esaslar inkübe (v / v), 20 dakika boyunca Matrigel (BD Biosciences, 356.231). Biz, Matrigel içinde bu kısa inkübasyon ilk kültür periyodu boyunca mevcut yarıkların regresyon en aza indirir bulmak, ancak bu adım Matrigel maruz arzu edilmediği takdirde ile vazgeçilebilir.
Rekombine SMGs 4. Ex vivo Kültür
- Bir dişli (küçük bir kesim) üstüne, bir ön-ıslak 200 ul pipet kullanarak her yitiren organ, bir defada tek bir koyun 13 mm, 0,1 mikron kültür ortamı 200 ul (üzerinde yüzen Nuclepore İz-Etch membran filtreden (Whatman) cam zeminli bir mikro plaka 5 esasları / filtre). Kültür besiyerişudur: DMEM/F12 + kalem-strep 50 ug / ml transferin ve 150 ug / ml askorbik asit, daha önce tarif 2.8 içeren. Transferrin sağkalım uyardığı bilinmektedir ve tükürük bezi ve diğer organ eksplantları 9 morfolojilerinden dal. Askorbik asit ilavesi SMG dallanma uyardığı gösterilmiştir. 10 bu metabolik yolların (örneğin kollajen lif oluşumu sırasında 11 prolin hidroksilasyon gibi) birçok hidroksilasyon reaksiyonlarında bir kofaktör olarak hareket etmek ve aynı zamanda bilinen diğer organ eksplantlar olarak fibronektin ve laminin üretimini uyarır 12.
- Her epitel yitiren organ ekledikten sonra mümkün olduğunca filtrenin üstüne kadar medya olarak çıkarın. Filtrenin üstünde çok fazla medya az medya esasları yerleştirme yapar iken, filtre batmaya neden olabilir ve çok daha kolay mezenşimin olabilir. Aşırı medya bir pipet ucu ile ya da uçları arasındaki medya bir pens ile ya da çıkarılabilir.
- Sıra mezenşimi adet fro türetilmiştirüst ve / veya her epitel yitiren organ çevresindeki m 3-4 bezleri. Uzaklıkta esasları gelen mezenşimi hareketi önlemek için bezleri çevreleyen herhangi bir ekstra ortamları çıkarın. Daha bezlerinden kaynaklanan mezenşimin yararlı değildir, ancak daha az epitel yitiren organ büyümesi için zararlı olabilir.
- İstendiğinde, 48 -72 saat boyunca 37 ° C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi (% 95 hava /% 5 CO2) içinde rekombine SMGs inkübe edin.
- Aydınlık ve / veya floresan 0 saat canlı bezlerinin görüntüleri (istenirse), rekombinasyon sonra 2 saat ve bir 4X veya 5X büyütme objektif kullanarak dijital kamera ile donatılmış bir, ters dik, ya da stereo mikroskopta bundan sonra her 24 saat Edinme görünümü tek bir çerçeve içinde tüm rekombine bezi yakalamak. Tükürük bezi Görüntüler ışık yolu (ki tam otomatik mikroskoplar üzerine yazdırmak mümkün değildir) yarısına kadar yerleştirilmiş aydınlık ayarı veya uygun faz halkasını kullanarak en iyi kontrast gösterir. Standart faz kontrast hayırgerekli t bezi kalın ve yana kontrast oluşturur.
- Istenen zaman noktalarında, rekombine SMGs% 5 (w / v) sakaroz (daha iyisi hücreler tutarak iç hücre yapısını muhafaza ihtiva eden 1X PBS içinde% 2'lik paraformaldehid (PFA) yapılmış sabitleştirici solüsyonu ile 20 dakika boyunca sabit olabilir Bir isosmotic devlet). Sabitleştirici tamamen tespit sonrası çıkartılırsa,% 4 aksine PFA,% 2 PFA GFP sinyali önemli miktarda muhafaza edecektir. Bezler 4 karanlıkta 1X PBS içinde 1 hafta kadar süreyle saklanabilir ° C bütün montaj immünsitokimya ve konfokal görüntüleme yapılana kadar, önceden 3,6,13-15 bildirdi. İdeal immünsitokimya ve görüntüleme en iyi kalitede görüntü elde etmek için fiksasyon kısa bir süre sonra yapılmalıdır. Bezler da Western blot analizi ile SDS-PAGE için RIPA tamponu içinde lize edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Büyük deneysel adımların akış Şekil 1 'de özetlenmiştir. Bozulmamış bir SMG, izole edilmiş bir epitel yitiren organ, ve karşılık gelen mezenşim bir örneği, Şekil 2'de gösterilmiştir. Belirtilen zaman için ex vivo kültive, Şekil 3 'de gösterilmiştir zaman morfojenezi dallanma geçmesi devam rekombine SMGs, bir aydınlık görüntüler. Epitel GFP ifade eden, 48 saat süreyle yetiştirilir Rekombine bezi Şekil 4' de gösterilmiştir. Rekombine SMGs Konfokal Resimler sabit ve görüntülü immünsitokimya ardından kültür içinde 72 saat sonra, Şekil 5 'de gösterilmiştir. Epitel marker, E-kaderin, çevredeki mesenchyme GFP ifade epitel hücre popülasyonu demarcates. Epitelin periferinde lokalize bazal membran proteini, perlekan, Tespiti rekombine bezlerinin bazal membran en azından kısmi sulandırma göstermektedir. FŞEKIL 6. Parasempatik submandibular gangliyon akson uzantısı geçmesi ve daha önce gösterdiği gibi rekombinasyon kültürlerde bezlerini innerve. 19.
Şekil 1. (A) Akış Şeması ve (B) şematik büyük deneysel adımlar tasvir.
Şekil 2.. Aydınlık (A) bir bütün embriyonik gün 13 (E13) dilaltı bezi epitel (SL Epi) ve mezenşimi (mes) çevrili submandibular bez epiteli (SMG Epi) gösteren tükürük bezi görüntüleri. (B) İzole epitel yitiren organ ve (C) mesenchyme Ayrılmış. Ölçek bar = 100 mikron.
in-page = "always"> 
Şekil 3. Belirtilen kez ex vivo kültüründe yetişen mezenşimi parçaları ile çevrili epitel esaslarından aydınlık görüntüleri (beyaz kesik çizgiler) sıraladı. Epitel hücreleri morfolojilerinden dallanma tabi tutulurlar ve mezenkimal yoğunlaşma kültür 24 saat gibi erken açıktır. Ölçek bar = 100 mikron
Şekil 4,. Aydınlık (A), floresan (B) ve sadece epitel hücreleri (beyaz kesikli çizgiler içerisinde çerçevelenmiş), 48 saat süreyle GFP-ifade eden adenovirüs ve ex vivo kültive ile enfekte edildiği rekombine SMGs Örtüşme (C) görüntüleri. Ölçek bar = 100 mikron.
highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50060/50060fig5.jpg "/>
Şekil 5. (A) çekirdekler (DAPI, mavi), adenoviral GFP (yeşil), epitelyal işaretleyici ile etiketlenmiş rekombine SMGs Konfokal görüntü veya aydınlık görüntüleri (BF). E-kaderin (kırmızı), ölçek çubukları = 250 mikron veya, (B) çekirdekler (DAPI, mavi), adenoviral GFP (yeşil), epitelyal marker, E-kaderin (kırmızı) ve bazal membran işaretleyici, perlekan ( camgöbeği), ölçek çubukları = 50 mikron. Beyaz çizgiler anahat epitel Kesik. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 6. Parasempatik submandibular gangliyon akson uzantısı geçmesi ve rekombinasyon kültürleri, ölçek bar = 250 mikron olarak bezlerini innerve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex vivo epitelyal-mezenkimal rekombinasyon tekniği ilk kez 1981 16 submandibular tükürük bezleri için yayınlandı. Bu protokol, biz bir rekombine bezinin kapsamında epitel hücre gen ekspresyonu işlemek için adenoviral infeksiyonun kullanarak, orijinal yöntem geliştirmektedir. Biz enfekte hücrelerin yüzdesi viral promotör özellikleri, viral titresi ve viral saflık bağlıdır ise epitel hücrelerinin yüzdesi, adenovirüs ile enfekte olduğunu göstermektedir. Biz bu verimli transdüksiyonu epitel, burada tarif edilmemiş olan saflaştırılması için CsCl gradient saflaştırılmış virüs kullanmak için gerekli olduğunu bulmuşlardır. Ayrıca, önceki rekombinasyon (veriler gösterilmemiştir) mezenşim hücreleri enfekte etme yeteneğine sahip oldukları için, mezenkimal nüfus bağımsız olarak genetik manipülasyonu da mümkündür. Biz son zamanlarda bir rolü tanımlamak için bu adenoviral transfeksiyon / doku rekombinasyon yöntemipolarite protein, PAR-1b için, tükrük bezleri gelişmekte epitel bazal membran yerleştirme kontrolü. Kinaz-ölü PAR-1b adenovirüs ve vahşi tip PAR-1b adenovirüs epitel esasları bulaştırmak için bu çalışmada 13 kullanılan ve E13 mesenchymes ile recombined edildi hem de. Spesifik moleküllerin fonksiyonlarının sorgulamak için mutant virüsler kullanılır yeteneği büyük ölçüde bu yöntemin yararını artırır.
Mezenkimal bölmesi etkilemeden sağlam embriyonik tükürük bezlerinde epitel hücre popülasyonu içindeki belirli molekülleri hedef için etkili araçlar eksikliği bulunmamaktadır. Birden fazla çalışmalar sağlam organ kültürleri sinyal iletimi işlemek için farmakolojik inhibitörleri kullanılmış olmasına rağmen, bu inhibitörleri epitel ve mezenşimi hem etkiler. Doğrudan epitelyum üzerinde inhibitörlerinin etkilerini değerlendirmek için, epitelyal esaslar Matrigel o ya da mezenşim yokluğunda kültür edilmesi gerekirr laminin-111 jeller 6,7. Küçük inhibitör RNA'lar (siRNA) siRNA'lar tercihen en lipid taşıyıcı 13,14,17,18 varlığında epitel hücreleri tarafından alınır yana epitel gen ekspresyonu düşürmesine için etkili bir yöntemdir. Bununla birlikte, ne protein seviyeleri veya fonksiyon ile müdahale için, bu yöntemler bir vahşi-tip ya da mutant gen ekspresyonu izin verir. Embriyonik Bütün SMG kültürlerin geleneksel (non-viral) transfeksiyon girişimleri epitel hücrelerinin sadece az sayıda (ML, yayınlanmamış veri) yönelik olması sınırlı bir başarı ile bir araya geldi. Buna karşılık, adenoviral transdüksiyon özellikle tükürük epitel hücreleri transfekte etmek için de etkili bir yöntemi temsil eder.
Parasempatik sinirler yakın bir keratin 5-pozitif progenitör hücre popülasyonunun 19 sürdürerek dallanma Normal tükürük bezi için kritik olduğu gösterilmiştir. MES üzerinde bu doku rekombinasyon metodun bir avantajıenchyme serbest epitel yitiren organ kültürü yöntemi parasempatik ganglion rekombinasyon kültür sistemi muhafaza edilebilir olmasıdır. Primer epitelyal kanal 19 ile bitişik mezenşim bulunan parasempatik ganglion, yaklaşık yerini dikkatli bir şekilde takip ederek, her yitiren organ kadar bir gangliyon ile ilişkili olan bitmektedir sağlamak mümkündür. Bununla birlikte, her zaman olmasa da bozulmamış değiştirilmemiş de olduğu gibi aynı için, her bir epitel yitiren organ ile mesenchymes değerinde 3-4 bezleri birleştirilmesi ile, her bir yitiren organ bir ölçüde (Şekil 6) tomurcukları innerve için yeterli bir gangliyon ile ilişkili olduğunu bulmak bezleri.
Bozulmamış bezi bağlamında epitel enfekte için alternatif yöntemler bulunmaktadır. Daha önce olduğu gibi mikroenjeksiyon bezleri 20,21 epitel hücrelerine adenovirüs tanıtmak için kullanılabilir olduğunu bildirmiştir. Bununla birlikte, mikroenjeksiyon Contr zordurgliserol, fiziksel olarak bezleri zarar verebilir, ve tipik olarak hücre 20 sadece bir yerelleştirilmiş alt enfeksiyona yol açar. Adeno-ilişkili virüs (AAV) sağlam SMG organı eksplantları 22 kapsamındaki hücre popülasyonlarının farklı transfeksiyon için yararlı olduğu gösterilmiştir. Serotip scAAV2 diğer rekombinant AAV vektörleri 23 üzerinde sağlam SMGs epitelinde belirli transdüksiyon azından önemli ölçüde daha etkili olduğu gösterilmiştir. AAVs yaygın piyasada mevcut değildir, ne de uzmanlığı en laboratuarlarda AAV var hazırlamak için yapar bu yana, adenoviral transdüksiyon ve doku rekombinasyon protokolü AAV vektörlerin kullanılması daha birçok laboratuar daha genel olarak erişilebilir burada sağlanan.
Bir ölçüde bu doku rekombinasyon yöntem özetler epitelyal-mezenkimal etkileşimi de, adenovirüs ile enfekte epitel ve daha sonra kendi yerli bağlamı dışında epitel büyüme da mümkündür.Daha önce de belirtildiği gibi, bozulmadan tükürük adenovirüs ile enfekte epitelyal esasları ve sonra eksogen olarak ilave edilen büyüme faktörleri 17,20,21 ile Matrigel içinde kültür büyüdü. Bu iskelelerinin kendi mevcut haliyle 15 mezenşimi tam işlevi özetleyen yok rağmen Tükürük bezi organ eksplantlar Ayrıca, nanolif iskelelerinin kültüre edilebilir. Bu yöntemleri özetler doğal mezenşim ikisi de, bu tür yöntemleri ex vivo kültüründe mezenşim belirli özelliklerini taklit yapılmasını sağlar.
Her ex vivo kültüre yöntemin kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır ama belirli bilimsel soruların iletilebileceği geçerlidir. Genel olarak sağlam tükrük bezi organ eksplantlar, organ eksplantlar yapmak kadar morfolojilerinden dallanma olarak rekombine bezleri tabi değilken, sadece in vivo birkaç gün morfolojilerinden branşlaşmasında özetlemek. Bu soruna bir çözüm CRE için elbetteepitel bölmesi içinde hedeflenen gen ifadesi içeren transgenik hayvanlar yedik. Erken SMG epitel gelişmekte özellikle aktif ve transgenik teknoloji açıklanan yöntemlere göre önemli ölçüde daha pahalı olmaya devam etmektedir bilinen yararlanıcı eksikliği olduğundan, burada açıklanan doku rekombinasyon deneylerinde sinyalizasyon hem epitelyal ve mezenkimal hücre incelemek için uygun bir model sistem teşkil Erken kendi dokusu bağlamında tükürük bezi hücrelerinin geliştirilmesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar yararlı yorumlar ve elyazmasının eleştirel okuma için Dr Deirdre Nelson teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Albany Üniversitesi, SUNY NIH hibe DE019244, DE019197 ve DE021841 ML, F32DE02098001 SJS, ve C06 RR015464 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham's F12 Medium without phenol red | Life Technologies | 21041-025 | |
| Penicillin and Streptomycin | Life Technologies | 15070-163 | 10X stock |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | Freeze single use aliquots at -20C |
| BSA | Sigma | A2934-100G | Fraction V, low endotoxin |
| Adeno-X-GFP | BD Biosciences | 8138-1 | Should be high titer (1x1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay. |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v) |
| 1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | Prepared from 10X stock |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14175095 | no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red |
| Transferrin | Sigma | T8158 | 25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma | A4403 | 75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C |
| Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol. | |||
| 10 cm sterile plastic dishes | Corning | 430167 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo dissecting microscope with transmitted light base | Nikon | SMZ645 | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| 35 mm tissue culture dishes | Falcon | 353001 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm diameter microwell dishes | MatTek Corporation | P50-G-1.5-14F | |
| Nuclepore Track-Etch membrane filters | Whatman | 110405 | 13 mm diameter, 0.1 mm pore size |
| Widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss, USA | Axio Observer Z1 | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm | Fine Science Tools | 11252-20 | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm | Fine Science Tools | 11295-20 | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol. | |||
References
- Tucker, A. S.
- Sakai, T., Onodera, T.
- Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P.
- Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).
- Zheng, C., et al. Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland. J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).
- Larsen, M., et al. Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis. Developmental biology. 255, 178-191 (2003).
- Hoffman, M. P., et al. Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms. Development. 129, 5767-5778 (2002).
- Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development. Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).
- Partanen, A. M., Thesleff, I. Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture. Differentiation. 34, 25-31 (1987).
- Naka, T., et al. Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate. In Vivo. 19, 883-888 (2005).
- Bornstein, P., Traub, W. The chemistry and biology of collagen. The Proteins. Neurath, H., Hill, R. L. 4, 3rd, Academic Press. 412-632 (1979).
- Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture. Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).
- Daley, W. P., et al. ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity. Development. 139, 411-422 (2012).
- Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis. Developmental biology. 336, 169-182 (2009).
- Sequeira, S. J., et al. The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds. Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).
- Nogawa, H., Mizuno, T. Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development. Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M.
- Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science. 329, 1645-1647 (2010).
- Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis. J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).
- Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells. Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).
- Zheng, C., Baum, B. J. Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands. Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).
- Hsu, J. C., et al. Viral gene transfer to developing mouse salivary glands. J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).
