Summary
En teknik til at genmanipulere epitelceller i hele
Abstract
Forgrening morfogenese forekommer under udviklingen af mange organer, og den embryoniske muse-glandula submandibularis (SMG) er en klassisk model for studiet af forgrening morfogenese. I udviklingslandene SMG, indebærer denne proces iterative trin epithelial knop og kanal dannelse, til sidst føre til et komplekst forgrenet netværk af acini og kanaler, som tjener til at frembringe og modificere / transportere spyt, henholdsvis i mundhulen 1 - 3. Epitel-associeret basalmembran og aspekter af mesenchymal rum, herunder mesenchym-celler, vækstfaktorer og den ekstracellulære matrix, der produceres af disse celler, er afgørende for forgrening mekanisme, selv om hvordan de cellulære og molekylære begivenheder er koordineret stadig dårligt forstået 4 . Undersøgelsen af de molekylære mekanismer kørsel epitelial morfogenese forskud vores forståelse af udviklingsmæssige mekanismer og giver et indblik i mulige Regenertive medicin tilgange. Sådanne undersøgelser er blevet hæmmet på grund af manglen på effektive metoder til genetisk manipulation af spyt epitel. Currently, adenoviral transduktion er den mest effektive metode til målretning af epitelceller hos voksne kirtler in vivo 5. I embryonale eksplantater, hindrer tæt mesenkym og basalmembranen omgiver epitelcellerne viral adgang til epitelcellerne. Hvis mesenkym fjernes, kan epithelet transficeres med adenovira, og epitel ansatser kan genoptage forgrening morfogenese i nærvær af Matrigel eller laminin-111 6,7. Mesenkym-free epitel Rudiment vækst kræver også yderligere supplering med opløselige vækstfaktorer og ikke fuldt rekapitulere forgrener morfogenese som den forekommer i intakte kirtler 8. Her beskriver vi en teknik, der letter adenoviral transduktion af epitelceller og kultur i den transficerede epithelium med tilhørende mesenkym. Efter mikrodissektion af embryonale SMGS, fjernelse af mesenkym, og virusinfektion af epithelet med et GFP-indeholdende adenovirus, viser vi, at epithelet spontant rekombinerer med uinficerede mesenkym, idet den gentog intakt SMG glandulær struktur og forgrenet morfogenese. Den genetisk modificerede epitelcelle population kan nemt overvåges ved anvendelse af standard fluorescensmikroskopi metoder, hvis fluorescens-mærkede adenovirale konstruktioner anvendes. Vævet rekombination her beskrevne fremgangsmåde er i øjeblikket den mest effektive og tilgængelig fremgangsmåde til transfektion af epitelceller med en vildtype-eller mutant vektor i en kompleks 3D væv konstruktion, som ikke kræver generering af transgene dyr.
Protocol
Protokollen indeholder fire hovedtrin, som afbildet i fig. 1. Alle trin er beskrevet i alle detaljer. Adenovirus konstruktion og viral rensning skal udføres forud for organhøst til anvendelse i den genetiske transduktion af dissekerede epiteliale ansatser. Alle standard BSL-2 sikkerhedsforanstaltninger skal følges, når man arbejder med adenovirus.
1. Muse embryonale submandibulære kirtel (SMG) Høst og mikrodissektion
- Aflive timed-drægtige mus (udavlet stamme CD-1 eller ICR) ved hjælp af CO 2-narkose, efterfulgt af cervikal dislokation, og høst strenge af muse embryoer på embryonisk dag 13 (E13, 3-5 epitel knopper) følgende procedurer godkendt af institutionelle IACUC udvalg. Den dag i vaginal prop opdagelse betegnes som E0. Spytkirtler kan også høstes og dyrkes på E12 stadium, hvor der er en enkelt primær knop og stilk med kløfter lige begyndtat indlede. SMGS forud for denne fase kræver forskellige dyrkningsbetingelser end angivet her.
- Overfør embryo strenge i sterile 10 cm vævskulturskåle fyldt med 25 ml DMEM / Ham 's F12-medium (F12) mangler phenolrødt (Life Technologies) og suppleret med 100 U / ml penicillin og 100 pg / ml streptomycin (pen-strep, Life Technologies).
- Med en steril skalpel (# 11 vinger) og tang (# 5, Fine Science Tools, 11.252-20), flytte embryoner fra sækkene ind i en separat 10 cm skål indeholdende 25 ml DMEM/F12 + pen-strep.
- Adskille embryo hoveder med en vinklet snit lige under underkæben.
- Isolere de nederste underkæber fra hovedet under et stereo dissektionsmikroskop med et stereomikroskop med (Nikon SMZ645 eller tilsvarende) ved hjælp af et snit under den øvre kæbe. Placere væv oven på et ekstra stykke glas i stedet for direkte på glasset komponent i mikroskopets bund.
- Saml de lavere Kindbakker i 3 ml DMEM/F12 + pen-strep i en steril 35 mm vævsdyrkningsskål.
- Placere en mandibel skive på den dissektionsmikroskop tidspunkt, således at tungen er på bunden af skiven, men peger mod 0:00 o'clock position.
- Brug den ene side af to krydsede tang i en klipning bevægelse, fjerne og kassere nederste 1/3 rd af mandiblen skive.
- Drej skive 90 ° til højre (hvis højrehåndet) og, under anvendelse af en klipning snit med pincetten, skæres den øverste del af underkæbeknoglen skive (uden at skære tungen) halvvejs ind i udsnittet.
- Skræl den overskydende væv væk og fjerne det for at blotlægge SMGS nedenunder. Der vil være en på hver side tæt ved tungens basis.
- Brug en tang til at holde vævet med tungen, skal du bruge de andre pincet til at drille SMG væk fra tungen. Gentag i den anden kirtel.
- Indsamle de microdissected spytkirtler i 3 ml DMEM/F12 + pen-strep i en ny steril 35 mm tissuedyrkningsskål. Bemærk: de større submandibulære kirtler (3-5 epiteliale knopper) sammen med den tilsluttede mindre sublingual kirtel (1 knop) kan dyrkes intakt ved at springe til trin 4 og udføre trin 4,1, 4,3, og 4,4, som beskrevet tidligere 2,8.
2. SMG Epithelial Rudiment Separation
- Place 5 (eller flere) spytkirtler i en glas-bund, 50 mm diameter mikrobrønd skål (Mattek Corporation, P50G-1.5-14-F) indeholdende 200 ul Hanks balancerede saltopløsning (HBSS mangler Ca + + eller Mg + +, Life Technologies) indeholdende 0,4% (v / v) dispase (Life Technologies, kat. no. 17105-041) og inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C.
- Efter inkubationen med en steril 200 gl pipettespids forsigtigt aspireres ud af dispase opløsning uden at forstyrre kirtler. Umiddelbart tilsættes 200 ul DMEM/F12 medium indeholdende 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, præ-steriliseret med et 0,22 um filter) for at neutralisere dispase. <li> Under et dissektionsmikroskop ved hjælp af en pincet med fine spidser (# 5 Dumostar, Fine Science Tools, 11.295-20), forsigtigt adskille løsnede mesenkym fra omkring SMG epiteliale knopper og kanaler, der tager sig at forlade epitel intakt .
- Pre-wet en steril 200 gl pipettespids med DMEM/F12-BSA medier og forsigtigt pipettere de epiteliale ansatser til en ny 50 mm diameter mikrobrønd skål indeholdende 200 ul DMEM/F12 + pen-strep. Bruge en høj kvalitet 200 pi pipettespids med en glat kant.
- I skålen, der indeholder de mesenchym stykker, kassere alle ikke-mesenkymvæv herunder de sublinguale kirtler og eventuelle løsrevne submandibulære kirtel knopper.
3. Adenoviral infektion af epiteliale Grundtraek
- Gøre 200 pi af viral infektion medier ved fortynding af adenovirus af interesse i DMEM/F12 + pen-strep i et mikrocentrifugerør, således at titeren af den resulterende opløsning er 1x10 8 -10 9 PFU. Denoptimale titer kræves til forskellige vira kan variere. Det er vigtigt at anvende cæsiumchlorid (CsCI)-oprensede virale præparater til optimal optagelse effektivitet.
- Fjern medierne fra skål indeholdende de fem epiteliale ansatser. Hurtigt tilsættes 200 pi af infektionen medier, holder de ansatser våde hele tiden. Tage de nødvendige forholdsregler, når du håndterer virus og bortskaffelse af forurenede pipettespidser. Desinficer eventuelle virus-forurenede overflader med 10% blegemiddelopløsning.
- Flytte de epiteliale ansatser langt væk fra hinanden med en pincet for at forhindre dem i at klæbe sammen og lade dem sedimentere til bunden af pladen. Inkuber ansatser i virale medier i 1 time ved stuetemperatur. Under inkuberingen adskille de ansatser, hvis de bevæger sig tæt på hinanden. Overdreven rokkende eller bevægelse vil tillade kirtler til at klumpe sammen.
- Efter inkubation fjernes forsigtigt de viral-holdige medier og skille hensigtsmæssigt, pas på ikke at forstyrre den rudiments. Tilsæt 200 ul DMEM/F12 + pen-strep. Gentag denne vask mindst to gange mere, og erstat med 200 pi DMEM/F12 + pen-strep medier. Disse vaskninger er afgørende at fjerne eventuelle virus, der ikke er stærkt knyttet til epitel og forhindre infektion i mesenkym.
- Inkuber epiteliale ansatser med 200 ml DMEM/F12 indeholdende 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356231) i 20 min. Vi finder, at dette kort inkubation i Matrigel minimerer regression af eksisterende spalter i den indledende dyrkningsperioden, men dette trin kan undværes, hvis udsættelse for Matrigel ikke ønskes.
4. Ex vivo kultur af rekombinerede SMGS
- Anbring hver Rudiment, en ad gangen, under anvendelse af en præ-vådt 200 ul pipettespids, oven på en hak (lille snit) 13 mm, 0,1 um Nuclepore Track-Etch membranfilter (Whatman) flydende over 200 pi kulturmedium ( 5 ansatser / filter) i en glas-bund mikrobrønd plade. Dyrkningsmedierneer: DMEM/F12 + pen-strep indeholdende 50 ug / ml transferrin og 150 ug / ml ascorbinsyre, som tidligere beskrevet 2,8. Transferrin vides at stimulere overlevelsen og forgrening morfogenese af spytkirtel og andre organsystemer eksplantater 9. Tilsætning af ascorbinsyre er blevet vist at stimulere SMG forgrening. 10. Det er kendt at virke som en cofaktor i mange hydroxylering reaktioner af metaboliske veje (såsom prolin hydroxylering under collagen fiberdannelse 11) og stimulerer også fibronectin og laminin produktion i andre organsystemer eksplantater 12.
- Fjern så meget medier oven på filteret som muligt efter tilsætning af hver epithelial ansats. For meget medier oven af filteret kan få filteret til at synke, mens de mindre medier gør placering af ansatser og mesenkym meget lettere. Overskydende medier kan fjernes enten med en pipettespids eller ved hjælp af en pincet til at gribe mediet mellem spidserne.
- Placer mesenchym stykker stammer tilbagem 3-4 kirtler på toppen og / eller omkring hver epithelial ansats. Fjern eventuelle ekstra medier, der omgiver kirtler til at undgå bevægelse af mesenkymet væk fra de ansatser. Mesenkym afledt af flere kirtler er ikke gavnlig, men mindre kan være til skade for epitelial Rudiment vækst.
- Inkuber rekombinerede SMGS i en befugtet inkubator (95% luft / 5% CO2) ved 37 ° C i 48 -72 timer efter ønske.
- Anskaf brightfield og / eller fluorescerende billeder af levende kirtler ved 0 timer (hvis det ønskes), 2 time efter rekombination og hver 24 time derefter på en omvendt, opretstående, eller stereo lysmikroskop udstyret med et digitalt kamera ved hjælp af en 4X eller 5X forstørrelse mål om at fange hele rekombinerede kirtel i en enkelt ramme af betragtning. Billeder af den spytkirtel viser den bedste kontrast ved hjælp af enten brightfield indstillingen eller den relevante fase ring placeret delvist ind i lysbanen (hvilket ikke er muligt på fuldautomatiske mikroskoper). Standard fasekontrast ikket nødvendig, idet kirtlen er tyk og skaber kontrast.
- På de ønskede tidspunkter med, kan rekombinerede SMGS fastsættes i 20 minutter med fiksativ opløsning fremstillet af 2% paraformaldehyd (PFA) i 1X PBS indeholdende 5% (vægt / volumen) saccharose (for bedre at bevare interne cellestruktur ved at holde cellerne i en isosmotisk tilstand). I modsætning 4% PFA, 2% PFA vil bevare en signifikant mængde af GFP-signal, hvis fikseringsmiddel helt fjernet efter fiksering. Pakningerne kan opbevares i op til 1 uge i 1 X PBS i mørke ved 4 ° C indtil hele mount immunocytokemi og konfokal billeddannelse udføres som beskrevet tidligere 3,6,13-15. Ideelt set bør immunocytokemi og billedbehandling udføres hurtigt efter fiksering for at opnå den bedste kvalitet billeder. Kirtler kan også lyseret i RIPA-buffer til SDS-PAGE efterfulgt af Western blotting-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Strømmen af de store eksperimentelle trin er skitseret i figur 1.. Et eksempel på en intakt SMG, en isoleret epithelial ansats, og dens tilsvarende mesenkym er vist i figur 2. Brightfield billeder af rekombinerede SMGS, som fortsat undergår forgrening morfogenese, når dyrkes ex vivo for de anførte tidspunkter, er vist i figur 3.. Rekombineret kirtler dyrket i 48 timer udtrykker epithelial GFP er vist i fig. 4. Konfokale billeder af rekombinerede SMGS fikseret og afbildes efter 72 timer i kultur efterfulgt af immuncytokemi, vist er i figur 5. Epitel markør, E-cadherin, afgrænser GFP-udtrykkende epitelcelle population fra den omgivende mesenkym. Påvisning af basalmembranen protein, perlecan, lokaliseret ved periferien af epithelet viser i det mindste delvis opløsning af basalmembranen i rekombinerede kirtler. Figur 6. Parasympatiske submandibulære ganglier gennemgå neuritudvækst og innerverer kirtlerne i rekombination kulturer som påvist tidligere. 19
Fig. 1. (A) Flowchart og (B) skematisk viser et større eksperimentelle trin.
Figur 2. Lysfelt billeder af (A) en hel embryonisk dag 13 (E13) spytkirtel viser sublingual kirtel epitel (SL Epi) og glandula submandibularis epitel (SMG Epi) omgivet af mesenkym (mes). (B) isoleret epithelial ansats, og (C) Separeret mesenkym. Scale bar = 100 | jm.
i-page = "altid"> 
Figur 3. Brightfield billeder af epitheliale ansatser (beskrevet af hvide stiplede linier) omgivet af mesenchym stykker dyrket i ex vivo kultur for de angivne tidspunkter. Epitelceller undergår forgrening morfogenese og mesenchymal kondens er tydelig allerede efter 24 timer i kultur. Scale bars = 100 um
Figur 4. Lysfelt (A), fluorescerende (B) og overlejrede (C) billeder af rekombinerede SMGS, hvor kun epitelceller (beskrevet i hvide stiplede linier) blev inficeret med GFP-udtrykkende adenovirus og dyrket ex vivo i 48 timer. Scale bar = 100 | jm.
highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50060/50060fig5.jpg "/>
Figur 5. Konfokale billeder eller brightfield billeder (BF) af rekombinerede SMGS mærket med (A) kerner (DAPI, blue), adenoviral GFP (grønt), epitel markør. E-cadherin (rød), Scale bars = 250 um, eller (b) kerner (DAPI, blue), adenoviral GFP (grønt), epitel markør, E-cadherin (rød), og basalmembranen markør, perlecan ( cyan), skala barer = 50 um. Stiplet hvide linjer skitsere epitel. Klik her for at se større figur .
Figur 6. Parasympatiske submandibulære ganglier gennemgå neuritudvækst og innerverer kirtlerne i rekombination kulturer, skala barer = 250 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ex vivo epitel-mesenchymal rekombinationsteknik blev først offentliggjort for submandibulære spytkirtlerne i 1981 16. I denne protokol, udvider vi på den oprindelige metode, ved hjælp af adenovirusinfektion at manipulere epitelcelle genekspression inden for rammerne af en rekombineret kirtel. Vi viser, at en procentdel af de epiteliale celler inficeres med adenovirus, mens andelen af celler, der er inficerede afhænger af egenskaberne af viral promotor, viral titer, og viral renhed. Det har vist sig, at det er nødvendigt at anvende CsCI gradient-oprensede virus til effektiv epithelial transduktion, oprensning af, som ikke er beskrevet her. Da vi også har været i stand til at inficere de mesenchym-celler forud for rekombination (data ikke vist), uafhængig genetisk manipulation af den mesenchymale befolkning er også mulig. Vi har for nylig brugt denne adenoviral transfektion / væv rekombination metode til at identificere en rollefor polariteten protein, PAR-1b,. ved kontrol af placeringen af basalmembranen ved epitelet i udviklingen spytkirtler Kinase-død PAR-1b adenovirus og vildtype-PAR-1b adenovirus blev begge anvendt i denne undersøgelse 13 at inficere epithelceller ansatser og rekombineres med E13 mesenchymes. Evnen til at anvende mutantvirus at forhøre funktioner af specifikke molekyler forøger stærkt anvendeligheden af denne metode.
Der er i øjeblikket en mangel på effektive redskaber til at målrette specifikke molekyler i epitelcellers befolkningen i intakte embryoniske spytkirtler uden at påvirke den mesenchymale rum. Selv om flere undersøgelser har anvendt farmakologiske inhibitorer til at manipulere signaltransduktion i intakte organkulturer, disse inhibitorer påvirker både epitel og mesenkym. For direkte at bedømme virkningen af inhibitorer på epitelet, skal epitel ansatser dyrkes i fravær af mesenkym i enten Matrigel or laminin-111 geler 6,7. Små inhibitoriske RNA'er (siRNAs) er en effektiv metode til at nedregulere epithelial genekspression eftersom siRNAs fortrinsvis optages af epithelcellerne i nærvær af de fleste lipidbærere 13,14,17,18. Ingen af disse metoder til at interferere med proteinniveauer eller funktion tillader overekspression af et vildtype eller mutant gen. Forsøg på traditionel (non-viral) transfektion af embryoniske hele SMG kulturer har haft begrænset succes med at kun et lille antal epitelceller kan målrettes (ML, ikke-publicerede data). Til sammenligning udgør adenoviral transduktion en effektiv metode til specifikt transfektion af spyt epitelceller.
Parasympatiske nerver er for nylig blevet vist at være kritiske for normal spytkirtel forgrening ved at opretholde en keratin 5-positive progenitorcellepopulation 19. En fordel ved dette væv rekombination metode over meddelelenchyme-free epitel Rudiment kultur fremgangsmåde er, at parasympatiske ganglion kan opretholdes i rekombination kultursystem. Ved at holde nøje øje med den omtrentlige placering af det parasympatiske ganglion, som er beliggende i mesenkymet støder op til den primære epitel kanal 19, er det muligt at sikre, at hver ansats ender er forbundet med en ganglion. Imidlertid finder vi, at ved at kombinere 3-4 kirtler værd af mesenchymes med hver epithelial ansats er hver Rudiment forbundet med en ganglion tilstrækkelig til innerverer knopperne i nogen grad (fig. 6), men ikke altid den samme som i den intakte umodificerede kirtler.
Der er alternative metoder til at inficere epitelet i forbindelse med det intakte kirtel. Vi har tidligere rapporteret, at mikroinjektion kan anvendes til at indføre adenovirus ind i epitelceller i intakte kirtler 20,21. Imidlertid mikroinjektion er vanskeligt at control, kan fysisk skade kirtler, og fører typisk til infektion af kun en lokaliseret delmængde af celler 20. Adeno-associerede vira (AAV) har vist sig at være anvendelige til transfektion af distinkte cellepopulationer inden for rammerne af intakte SMG organ eksplantater 22. The serotype scAAV2 blev vist at være væsentligt mere effektive til specifikke transduktion af epithelet af intakte SMGS flere andre rekombinante AAV-vektorer 23. Da AAV'er ikke er bredt kommercielt tilgængelige, heller ikke ekspertise til fremstilling af AAV findes i de fleste laboratorier, det adenovirale transduktion og væv rekombination, der tilvejebringes her er generelt tilgængelige for de fleste laboratorier end anvendelsen af AAV-vektorer.
Mens dette væv rekombination metode redegør epithelial-mesenchymal-interaktioner til en vis grad, er det også muligt at inficere epithelet med adenovirus og derefter vokse epithelet uden for dens native kontekst.Som tidligere nævnt har vi inficerede intakte spyt epiteliale ansatser med adenovirus og derefter blev kulturerne i Matrigel med eksogent tilsatte vækstfaktorer 17,20,21. Spytkirtel organ eksplantater kan også dyrkes på nanofiber stilladser, selv om disse scaffolds ikke gentage den fulde funktion af mesenkym i deres nuværende form 15. Mens ingen af disse metoder rekapitulerer den native mesenchym, sådanne fremgangsmåder muliggør efterligning af særlige egenskaber ved mesenkym i ex vivo kultur.
Hver ex vivo kultur metode har sine egne fordele og ulemper, men er anvendelig for at løse specifikke videnskabelige spørgsmål. Mens de rekombinerede kirtler ikke undergår så meget forgrenede morfogenese som gør intakte spytkirtel organ eksplantater, organer eksplantater i almindelighed kun rekapitulere in vivo forgrening morfogenese i et par dage. En løsning på dette problem er naturligvis at skaspiste transgene dyr, der indeholder målrettet genekspression i epitel rum. Da der er en mangel på kendte promotorer, der aktiveres specifikt i begyndelsen udvikle SMG-epitel, og transgen teknologi er væsentligt dyrere end de beskrevne metoder, de væv rekombinationseksperimenter beskrevet her udgøre et levedygtigt modelsystem til at undersøge både epithel-og mesenchymal celle signalering i tidlig udvikling spytkirtel celler i deres væv sammenhæng.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Deirdre Nelson for personer kommentarer og for kritisk gennemlæsning af manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af NIH tilskud DE019244, DE019197, og DE021841 til ML, F32DE02098001 til SJS, og C06 RR015464 til universitetet i Albany, SUNY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham's F12 Medium without phenol red | Life Technologies | 21041-025 | |
| Penicillin and Streptomycin | Life Technologies | 15070-163 | 10X stock |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | Freeze single use aliquots at -20C |
| BSA | Sigma | A2934-100G | Fraction V, low endotoxin |
| Adeno-X-GFP | BD Biosciences | 8138-1 | Should be high titer (1x1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay. |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v) |
| 1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | Prepared from 10X stock |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14175095 | no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red |
| Transferrin | Sigma | T8158 | 25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma | A4403 | 75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C |
| Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol. | |||
| 10 cm sterile plastic dishes | Corning | 430167 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo dissecting microscope with transmitted light base | Nikon | SMZ645 | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| 35 mm tissue culture dishes | Falcon | 353001 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm diameter microwell dishes | MatTek Corporation | P50-G-1.5-14F | |
| Nuclepore Track-Etch membrane filters | Whatman | 110405 | 13 mm diameter, 0.1 mm pore size |
| Widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss, USA | Axio Observer Z1 | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm | Fine Science Tools | 11252-20 | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm | Fine Science Tools | 11295-20 | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol. | |||
References
- Tucker, A. S. Salivary gland development. Seminars in cell & developmental biology. 18, 237-244 (2007).
- Sakai, T., Onodera, T. Embryonic organ culture. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19 (2008).
- Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. Salivary gland branching morphogenesis. Differentiation. 74, 349-364 (2006).
- Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).
- Zheng, C., et al. Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland. J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).
- Larsen, M., et al. Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis. Developmental biology. 255, 178-191 (2003).
- Hoffman, M. P., et al. Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms. Development. 129, 5767-5778 (2002).
- Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development. Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).
- Partanen, A. M., Thesleff, I. Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture. Differentiation. 34, 25-31 (1987).
- Naka, T., et al. Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate. In Vivo. 19, 883-888 (2005).
- Bornstein, P., Traub, W. The chemistry and biology of collagen. The Proteins. Neurath, H., Hill, R. L. 4, 3rd, Academic Press. 412-632 (1979).
- Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture. Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).
- Daley, W. P., et al. ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity. Development. 139, 411-422 (2012).
- Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis. Developmental biology. 336, 169-182 (2009).
- Sequeira, S. J., et al. The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds. Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).
- Nogawa, H., Mizuno, T. Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development. Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423, 876-881 (2003).
- Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science. 329, 1645-1647 (2010).
- Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis. J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).
- Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells. Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).
- Zheng, C., Baum, B. J. Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands. Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).
- Hsu, J. C., et al. Viral gene transfer to developing mouse salivary glands. J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).
