Summary
Vi presenterar metoder för att utvärdera hur predation risk kan förändra den kemiska kvaliteten hos växtätare byte genom att inducera kostförändringar för att möta kraven från förhöjd stress och hur nedbrytningen av slaktkroppar från dessa stressade växtätare saktar efterföljande nedbrytning växt kull med jordmikrober.
Abstract
Den kvantitet och kvalitet detritus kommer in i jorden avgör graden av nedbrytning av mikrobiella samhällen samt återvinna priser kväve (N) och kol (C) upptag 1,2. Anläggning kullen omfattar merparten av detritus 3, och så det antas att nedbrytningen endast marginellt påverkas av biomassa insignaler från djur såsom växtätare och köttätare 4,5. Emellertid kan köttätare påverka mikrobiell nedbrytning av växt strö via en kedja av interaktioner där predationen risken ändrar fysiologin av deras växtätare byten som i sin tur förändrar markens mikrobiella fungerar när växtätande slaktkroppar sönderdelas 6. En fysiologisk stress reaktion från växtätare till risken för predation kan ändra C: N grundämnessammansättningen av växtätare biomassa 7,8,9 eftersom stress från rovdjur risk ökar växtätande basala energibehov som i näringsfattiga begränsade system tvingar växtätares för att flytta sin förbrukning från N-rika resurser för att stödja tillväxt och reproduktion till C-rika kolhydrater resurser för att stödja ökad ämnesomsättning 6. Växtätare har begränsad förmåga att lagra överskott av näringsämnen, så stressad växtätare utsöndrar N som de ökar kolhydrater-C-konsumtion 7. Ytterst bytesdjur stressade av predation risk öka sin kropp C: N-kvot 7,10, vilket gör dem sämre kvalitet resurser för markens mikrobiella poolen sannolikt på grund av lägre tillgänglighet av labila N för mikrobiell enzymproduktion 6. Således har nedbrytning av slaktkroppar av stressade växtätare en primer effekt på funktion mikrobiella samhällen som minskar efterhand förmåga att av mikrober att bryta växt kull 6,10,11.
Vi presenterar metoden för att utvärdera sambanden mellan predation risk och strö nedbrytning av jordmikrober. Vi beskriver hur du: framkalla stress hos växtätare från predation risk, MEAtill att dessa stressreaktioner och mäta konsekvenserna för mikrobiell nedbrytning. Vi använder insikter från en modell gräsmark ekosystem bestående av jakt Spider rovdjur (Pisuarina mira), en dominerande gräshoppa växtätare (Melanoplus femurrubrum) och en mängd olika gräs och forb växter 9.
Protocol
1. Uppfödningsenheter Gräshoppor under stress och stress gratis villkor
- Använd 0,5 m 2 cirkulär, slutna mesokosmosstudier att förhindra emigration eller immigration av djurarter (figur 1). Konstruera mesokosmosstudier med 2,4 m längder 1,5 m hög ¼ "mesh aluminium staket som en byggnadsställning. Täck fäktning med 2,5 m längder 1,75 m hög aluminium fönster screening viks över toppen och botten av stängsel och häftas ihop längs veck. Gå med i fäktning slutar att bilda en sluten cirkel och sedan häfta den överlappande fönster screening tillsammans för att skapa en tätning. Ställ mesokosmförsök i jorden i fältet genom att gräva en 10 cm djup med 4 cm bred dike runt basen av mesocosom, sänka mesokosmförsök till diket och sedan packa SOD av diket runt den sjunkna delen av mesokosmförsök. Häfta en cirkulär bit fönster screening till toppen av mesokosmförsök.
- Array mesokosmosstudier i en parad kopieras experimentell design i området. Tomt platser bör väljas för att matcha identitet växtarter och växter relativ lock. Sink burar 10 cm i marken vid tomten platsen.
- Med hjälp av ett svep nät, samla tidigt (2: a) instar gräshoppa nymfer och lagra dem i mesokosmosstudier på naturliga fält densiteter.
- Med hjälp av ett svep nät, fånga individer av en dominerande sit-and-wait jakt (inte webb vävning) spindel rovfiskar. Lim stängde Spider chelicerae (mouthparts som används för att dämpa byten) med snabbtorkande cement till frikopplade risk effekter från faktiska överlevnad val gynnar enskilda gräshoppor med bättre förmåga att undvika Spider predation. Fylla spindlar på fältet densiteter till en mesokosmförsök i varje par. Detta kommer att vara den stress behandlingen. Mesokosmosstudier utan spindlar blir stressfri behandling.
- Låt gräshoppa nymfer att utvecklas till sena (4: e och 5: e) instar steg. Samla alla individer från burarna och Randomly tilldela personer från varje bur till en av tre efterföljande analys grupper: (1) validering av fysiologisk stress tillstånd, (2) Validering av förskjutning i kroppen elementärt stökiometri, (3) mikrobiell nedbrytning.
2. Validera Grasshopper spänningstillståndet
- Mät gräshoppa standard ämnesomsättning (SMR), i takt med koldioxidutsläpp (
) I en incurrent genomströmningssystem respirometri system med en luftflödeshastighet av 200 ml / min. Avlägsna vattenånga genom att strömmande luft genom ett torkmedel. - Efter mat berövande av 16 h (vatten ska finnas), väger enskilda gräshoppor (± 0,1 mg), och placera dem i transparent 50 ml (9,2 cm L x 2,0 cm D) respirometer kammare och låta dem återhämta sig från hanteringen för minst 10 minuter innan mätningarna påbörjas.
- Under ständig genomsnittlig omgivande tem temperatur (temperatur ± 1% standardavvikelse variation) inom respirometer kammaren, analysera respireras luft med hjälp av en infraröd CO 2-analysator (t.ex. kvantbiten S151-1 ppm upplösning). Mät den genomsnittliga minsta steady-state under 10 min.
- Analysatorn ger fraktionerad CO 2-koncentration (delar per miljon), men SMR ska redovisas som en kurs, så man måste omvandlas inspelningarna som = FR I (
- 
) / {1 - [1 - (1/RQ)]}, däriles/ftp_upload/50061/50061eq3.jpg "FO: src =" / files/ftp_upload/50061/50061eq3highres.jpg "/> = incurrent fraktionerad koncentrationen av CO 2; = Excurrent fraktionerad koncentration av CO 2, FR = flödeshastighet (ml min -1), RQ = respiratoriska kvoten, antas vara lika med 0,85 i växtätande djur.
) I en incurrent genomströmningssystem respirometri system med en luftflödeshastighet av 200 ml / min. Avlägsna vattenånga genom att strömmande luft genom ett torkmedel. 
- 
) / {1 - 3. Validera Skift i Body Elemental stökiometri
- Utvärdera Kol: Kväve (C: N) av ett urval av gräshoppor som samlats in från fältet mesokosmosstudier.
- Minska variationen i C: N på grund av nyligen livsmedelskonsumtion genom att ta bort gräshoppa tarminnehåll under ett dissektionsmikroskop.
- Frystorka den tomma magen och kroppen för 48 timmar sedan slipa den enskilda slaktkroppen och tarm till ett homogent pulver.
- Åtgärd C: N innehåll av pulvret med användning av en autoanalysator CNH.
4.Mikrobiell nedbrytning
- Plats replikerade par av PVC kragar (15,4-cm i diameter., In ~ 4 cm i jorden) i fältet webbplats (figur 3C). Ta bort alla växtlighet inom dem via klippning vid markytan. Dessa kragar används för nedbrytningsprodukter åtgärder. Dessutom fastställa en uppsättning av PVC kragar över fältet webbplatsen att fungera som 13 C naturliga överflöd kontroller (se nedan), som varken gräshoppor eller gräs-kullen läggs.
- Till en krage i varje par lägger 2 intakta, frystorkade slaktkroppar av gräshoppor (registrera biomassan tillagd) fötts med rovdjur risk som beskrivs ovan att använda fältet-burar. Till den andra kragen i varje par lägger 2 intakta frystorkade slaktkroppar som föds upp utan rovdjur risk.
- Täck PVC halsband med en skärm för att förhindra gräshoppa borttagning av asätare från tomter och låt gräshoppa slaktkroppar sönderdelas i 40 dagar.
- Medan slaktkroppar nedbrytning, etikett gräs-litter med 13 C.
- Konstruera en klart plexiglas kammare (60 cm x 60 cm x 1,5 m) med en inlopps-och utloppsventil (figur 3B).
- Sink en kvadrat 60 cm x 60 cm träram med en gummitätning belagd med silikonfett 5 cm i marken (figur 3B).
- Skjut kammaren ovanpå träramen så att kammaren blir tätad av gummit (figur 3B).
- Anslut kammaren inloppen till komprimerad gastuber som innehåller 99 atom% 13 CO 2. Växter inne i kammaren kommer att märkas med 13 C, där CO 2 koncentrationer bibehålls på omgivande nivåer (eftersom upplyftande koncentrationer förändrar växt kol partitionering). Omgivande bibehålls genom att endast pulsera märkt CO 2 under korta perioder. Dessutom är kammaren temperaturen övervakas och kamrarna bort om temperaturen når 5 ° C enBove omgivningstemperatur.
- En vecka efter märkning, jämföra δ 13 C i gräset-kullen med naturliga överflöd värden som samlats in från ett slumpmässigt urval av identiska gräsarter med en Thermo DELTAplus isotop spektrometer förhållande massa (Thermo, San Jose, CA, USA).
- Efter 40 dagar, tillsätt 10 g lufttorkat 13 C-märkt gräs-kullen till varje krage som tidigare hade ändrats med gräshoppa kadaver.
- Övervaka mineraliseringshastighet av gräset-kullen på plats över 75 dagar genom tak varje krage och spårning både total markrespirationen och andning 13 CO 2. Detta sker med hjälp av ett flöde, genom kammaren teknik där gas prover från varje krage övervakas i realtid, för 8 min vardera med hålrum ring-down spektroskopi (CRDS, Picarro Inc., Santa Clara, CA, USA, Modell: G1101 -i). CRDS gör det möjligt att samtidigt följa både totalt och δ 13 Cav markrespirationen.
- Uppskatta bidrag 13 C-märkt gräs-kullen till total markrespirationen med isotop blandning ekvationer. Mängden gräs-kullen härstammar CO 2 beräknas enligt följande: (. Δ 13 C andning - δ 13 C nat.abn) C gräs-kullen härrör = C totala × / (δ 13 C gräs-kullen - δ 13 C-nat . ABN), där C totalt är den totala mängden C respireras under en given mätning, är δ 13 C-andning den δ 13 C respireras-C för kragar ändras med märkt gräs strö, δ 13 C-nat.abn. är den genomsnittliga δ 13 C i respireras C i tre naturliga överflöd kragar (dvs. de som inte har ändrats med strö) och δ 13 C gräs-kullen är den δ 13 C i gräset kullen läggs till samarbetetllars.
- Övervaka både marktemperatur och fuktighet över experimentet med handhållna prober för att korrigera för skillnader i markrespirationen grund av skillnader i temperatur och fuktighet.
- Även avsedd för fältbruk, kaviteten ring ner spektroskopi instrument (Picarro Inc., Santa Clara, Kalifornien, USA, Modell: G1101-i) avläsningar är känsliga för rörelse. Därför bör en resa en station bas mätning centralt till alla tomter som innehåller PVC kragar och anslut instrumentet till kragar med längder av PVC slang.
Representative Results
Ett exempel tomt på gräshoppa standard metabola priser i stress och stress fria förhållanden presenteras i figur 2. På grund av body mass skillnader mellan enskilda gräshoppor, och det faktum att ämnesomsättning varierar med kroppsmassa, bör tomter presentera metabola priser i förhållande till gräshoppa kroppsmassa. Parallella trender för de olika behandlingarna visar att metabola stiger som en konstant multipel av standard ämnesomsättning (dvs det finns ingen kroppsmassa X ämnesomsättning interaktion) för alla stressade människor.
Gräshoppa kropp C och N elementära innehållet i risk och risk fria förhållanden presenteras i Tabell 1. Det är anmärkningsvärt att det finns en mycket liten (4%) skillnad i C: N-förhållanden mellan behandlingarna. Ändå kan dessa små skillnader leda till stora skillnader i gräs kullen nedbrytningen med markens mikrobiella poolen (Figur 3). Lägga gräs kullen till PVC kragar som tidigare ändrats med stressade eller stressfri gräshoppor leder till olika grader av strö nedbrytning, vilket avspeglas i kurvorna som beskriver kumulera CO 2 utsläpp från marken på grund av mikrobiell respiration (figur 3). Experiment bör övervakas tills kumulera kurvor börjar mättas.
| Stress | Stress Free | |
| Kol (%) | 48,44 ± 0,32 | 44,73 ± 0,46 |
| Kväve (%) | 12,11 ± 0,08 | 11,62 ± 0,12 |
| Kol: Kväve | 4,00 ± 0,03 | 3,85 ± 0,04 |
Tabell 1. Jämförelse av det kemiska innehållet i gräshoppa växtätare bilcasses från förhållanden som de ställs inför predation risk (stress) och där predation risk var frånvarande (stress gratis). Värden är medelvärde ± 1 standardfel.
Figur 1. Illustration av utformningen av fältet mesokosmosstudier används i experimentet och övergripande systematiken i experimentell utvärdering av risk effekter på kull nedbrytning.
Figur 2. Ett diagram över växtätare standard ämnesomsättning i förhållande till växtätare kroppsmassa. Uppgifterna är indelade i två klasser enligt experimentell behandling: gräshoppor från mesokosmosstudier innehåller rovdjur (predation) för att inducera stress och mesokosmosstudier utan rovdjur (kontroll) och därmed ingen inducerad stress. Data är från D. Halwenaoch EGT Schmitz 2010, opublicerad.
Figur 3. Kurvor som beskriver kumulativ CO 2 utsläpp från den mikrobiella poolen medan ruttnande experimentella ingångar gräs kullen i PVC kragar. Plottade värdena är medelvärde ± 1 standardfel. Grafen visar att jordar grundas med stressade gräshoppa slaktkroppar (rovdjur) resulterar i 19% lägre (ANOVA F 1,6 = 9,06, p <0,05) växt kullen nedbrytningsprodukter priser än jordar primade med stressfri gräshoppa slaktkroppar (kontroll). Den infällda bilden visar PVC kragen anordningen på fältet. Figur hämtad från Hawlena et al. 6 Cick här för att visa större bild .
Discussion
Sekvensen av metoder som presenteras här bör göra det möjligt systematisk mätning av hur stress i arter som omfattar ovan jord födovävar kan prime marken mikrobiella samhällen på ett sätt som leder till förändring av efterföljande nedbrytning av växt kull. Metoderna är idealiska för att studera ekosystemen består av leddjur konsumenter och örter eftersom intakta födovävar kan vara geografiskt avgränsad och innesluten i mesokosmosstudier.
Rumslig variabilitet kan finnas på grund av gradienter i bakgrunden markfuktighet, marktemperatur, växt näringsinnehåll etc. studiedesign gör att man kan array mescosms och PVC kragar att blockera längs rumsliga miljögradienter och därmed står för en sådan miljö variation vid analys av effekter.
Även avsedd för fältbruk, kaviteten ring ner spektroskopi instrument (Picarro Inc., Santa Clara, Kalifornien, USA, Modell: G1101-i) avläsningar sensitive för rörelse. Därför bör en resa en station bas mätning centralt till alla tomter som innehåller PVC kragar och anslut instrumentet till kragar med längder av PVC slang.
Jord kullen nedbrytning har traditionellt mätts genom att bifoga kända mängder skräp i glasfibernät påsar, deponering påsarna på markytan i fältet och regelbundet ses mäta påsarna att kvantifiera betygsätta kullen försvinnande (sönderfall). Begränsningen av denna metod är att en inte kan spåra öde nedbrutet material eller avgöra bidraget till CO 2 mineralisering i marken ändringen (lagt kull) från bakgrunden marken CO 2 mineralisering. Spårämnet metoden med märkt CO 2 presenteras här hjälper lindra detta logistiska begränsning.
Ekosystemekologi och biogeokemi har fungerat under arbetsnamnet paradigm att eftersom uppätet anläggning-Kullen består merparten av detritus, är belowground ekosystemprocesser endast marginellt påverkats av biomassa ingångar från högre trofinivåer i banor ovan jord livsmedel, såsom växtätare själva 6. Det finns dock alltfler tecken på att arten i högre trofiska nivåer av ekosystemen kan ha en djupgående inverkan på belowground processer 1,4,5. Den metod som presenteras här står att öka kvantifiering av bidraget från högre trofinivåer, antingen direkt genom biomassa från slaktkroppar nedfall (t ex 12, 13) eller utsöndring och egestion (t.ex. 14, 15) eller indirekt genom förändring av sammansättningen av växternas (t.ex. 9 ) på ekosystem näringsomsättning. Sådan kvantifiering kan hjälpa avslöja de mekanismer genom vilka djur kontrollerar ekosystemens dynamik som en del av en samlad insats för att förbättra och revidera den nuvarande arbete paradigm biotiska kontroll över ekosystemens funktion.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av medel från Yale Klimat och energi Institute och amerikanska National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cavity ring down spectroscope | Picarro Inc., Santa Clara, CA, USA | Model # G1101-i | |
| CO2 respirometer | Qubit Systems, Kingston, ON, Canada | Model # S151 | |
| 13C | Sigma-Aldrich | 372382 | |
| Spectrophotometer | Thermo, San Jose CA, USA | Model: Delta V Plus Isotope Ratio Mass Spectrophotometer |
References
- Wardle, D. A., et al. Ecological linkages between aboveground and belowground biota. Science. 304, 1629-1633 (2004).
- Hattenschwiler, S., Tiunov, A. V., Scheu, S. Biodiversity and litter decomposition in terrestrial ecosystems. Annu. Rev. Ecol. Syst. 36, 191-218 (2005).
- Cebrian, J. Role of first-order consumers in ecosystem carbon flow. Ecol. Lett. 7, 232-240 (2004).
- Aboveground-Belowground Linkages. Bardgett, R. D., Wardle, D. A. , Oxford University Press. Oxford. (2010).
- Schmitz, O. J., Hawlena, D., Trussell, G. C. Predator control of ecosystem nutrient dynamics. Ecol. Lett. 13, 1199-1209 (2010).
- Hawlena, D., Strickland, M. S., Bradford, M. A., Schmitz, O. J. Fear of predation slows plant litter decomposition. Science. 336, 1434-1438 (2012).
- Hawlena, D., Schmitz, O. J. Physiological stress as a fundamental mechanism linking predation to ecosystem functioning. Am. Nat. 176, 537-556 (2010).
- Stoks, R. D. eB. lock, M,, McPeek, M. A. Alternative growth and energy storage responses to mortality threats in damselflies. Ecol. Lett. 8, 1307-1316 (2005).
- Hawlena, D., Schmitz, O. J. Herbivore physiological response to predation risk and implications for ecosystem nutrient dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15503-15507 (2010).
- Schimel, J. P., Weintraub, M. N. The implications of exoenzyme activity on microbial carbon and nitrogen limitation in soil: a theoretical model. Soil Biol. Biochem. 35, 1-15 (2003).
- Allison, S. D., et al. Low levels of nitrogen addition stimulate decomposition by boreal forest fungi. Soil Biol. Biochem. 41, 293-302 (2009).
- Bump, J. K., et al. Ungulate carcasses perforate ecological filters and create biogeochemical hotspots in forest herbaceous layers allowing trees a competitive advantage. Ecosystems. 12, 996-1007 (2009).
- Yang, L. H. Periodical cicadas and resource pulses in North American forests. Science. 306, 1565 (2004).
- Belovsky, G. E., Slade, J. B. Insect herbivory accelerates nutrient cycling and increases plant production. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14412 (2000).
- Frost, C. J., Hunter, M. D. Recycling of nitrogen in herbivore feces: plant recovery, herbivore assimilation, soil retention, and leaching losses. Oecologia. 151, 42 (2007).
